代谢学人

Science：糖尿病，“细胞身份丢失”引起的全身崩溃

撰文 | 王蕊  夏志蕊  王颖雯  朱丽君  刘爽  曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

线粒体在真核生物的细胞生物能量学中至关重要，而线粒体缺陷与代谢性疾病（如2型糖尿病，T2D）的发生有关。来自 T2D患者胰岛供体的胰岛素产生胰腺β细胞在葡萄糖刺激后表现出线粒体超结构的异常和 ATP/ADP 比值的降低。另外，T2D患者的骨骼肌经胰岛素刺激后，ATP生成减少、线粒体呼吸能力降低和线粒体DNA (mtDNA)含量下降；胰岛素抵抗个体的内脏脂肪组织线粒体呼吸速率明显降低，肝脏线粒体解偶联以及质子泄漏导致了线粒体呼吸、ATP合成和转换减少。大量研究也强调了，线粒体损伤在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）发展中的核心作用。

有研究学者提出，线粒体功能障碍是T2D发展过程中一个广泛的统一机制，并且线粒体缺陷已经在心肌、血管内皮、脂肪组织以及中枢和周围神经系统中被报道。现已有研究证实，β细胞线粒体基因表达和氧化磷酸化损伤加速了人类T2D疾病进展，这也进一步支持了线粒体在T2D发病机制中的作用。此外，一些人类遗传学研究也支持线粒体和T2D之间的联系。

最近的研究表明，在T2D的不同组织中观察到了终端细胞身份丧失（小编注：不同的细胞都有自己独特的细胞身份，这是由特定稳态或应激状态下独特的基因表达模式所定义的表型和行为，细胞身份丧失则是指细胞失去了其特定的功能和特征，可能恢复到了一种未分化或去分化的状态，这种现象在癌症中尤为常见，与肿瘤的侵袭性和转移能力密切相关）。先前认为，β细胞数量的维持依赖于β细胞复制和凋亡的平衡；而现在认为，β细胞去分化是驱动T2D中β细胞衰竭的关键因素（小编注：去分化是指细胞失去了其原有的形态和功能，回到了类似于干细胞或者前体细胞的状态）。去分化的β-细胞缺乏成熟β-细胞中重要的因子，可能会获得内分泌祖细胞标志物，并表达其他胰岛细胞激素；在T2D期间，其他组织中也可观察到这种分化障碍的现象。尽管线粒体功能障碍对T2D至关重要，但线粒体缺陷是否直接促进代谢组织的不成熟（小编注：组织成熟度：线粒体是细胞的“能量工厂”，负责通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP，并参与代谢调节、钙稳态、活性氧（ROS）平衡及细胞凋亡等关键过程。线粒体功能缺陷会直接影响组织的发育、成熟和稳态维持，尤其在能量需求高的组织（如肌肉、神经、心脏）中表现更为显著）目前尚不清楚。

线粒体质量控制或线粒体生命周期的缺陷可能密切调节着线粒体基因组的完整性、生物发生、动力学和线粒体自噬导致的自我更新，导致T2D中线粒体结构、基因表达和能量学的损害加重。线粒体逆向信号是一种从线粒体到细胞核的通信途径，在正常和病理生理条件下影响了许多细胞和生物体的正常活动。近期一篇发表在Science上的名为“Retrograde mitochondrial signaling governs the identity and maturity of metabolic tissues”的文章报道，线粒体质量控制异常可以参与促进不成熟的代谢组织线粒体逆向信号程序，从而对代谢疾病的发展提供了更深入的了解。

敲黑板啦！

1.T2D中β 细胞线粒体质量控制受损；

2.线粒体质量控制受损导致β细胞身份丧失；

3.线粒体质量控制受损，ETC/OXPHOS 缺陷作为逆向激活信号触发ISR;

4.线粒体质量控制受损,导致β细胞、肝细胞和棕色脂肪细胞的不成熟和ISR。

研究结果

1 .T2D中β细胞线粒体质量控制受损

鉴于在T2D中线粒体结构、基因表达和能量学发生缺陷，研究人员首先检查了线粒体质量是否在T2D中明显受损。结果显示，与非糖尿病供体相比，T2D患者的胰岛mtDNA相较于核DNA含量降低（图1A）。对人胰岛β细胞进行单细胞RNA测序（RNA-seq）后发现，在T2D患者中，13种线粒体编码RNA （mtRNAs）中有11种表达减少（图1B）。这种mtRNA相关基因表达减少是β细胞特异性的，因为在T2D患者的非β细胞中mtRNA水平并没有明显差异（图S1A）。其次，研究人员通过Western blot （WB）发现柠檬酸合成酶活性以及OXPHOS亚基蛋白和线粒体外膜蛋白TOM20表达不存在差异（小编注：柠檬酸合成酶主要位于线粒体基质中，通过TCA循环产生为电子传递链提供还原当量；OXPHOS亚基蛋白是电子传递链的核心组成成分，线粒体主要通过OXPHOS产生ATP），这表明T2D患者mtDNA含量和线粒体基因表达的降低并非继发于线粒体质量的减少（图S1 B和C）。

先前发表的研究证实了T2D患者的线粒体结构存在缺陷，这表明线粒体动力学发生了改变（小编注：线粒体动力学是指细胞内线粒体通过不断地分裂、融合以及线粒体膜电位变化等过程，维持其形态、分布和功能的动态平衡）。因此，研究人员通过流式细胞技术分析，评估了线粒体自噬通量。在非糖尿病患者的β细胞中，缬霉素（钾离子载体）通过促进线粒体自噬，提高了酸性溶酶体室内去极化线粒体的水平，而使用缬霉素刺激T2D患者β-细胞，细胞内去极化线粒体的水平相较于非糖尿病患者较低（图1C）（小编注：缬霉素是一种由链霉菌产生的环状十二肽抗生素，其外部具疏水性，能够嵌入脂质双层膜中，内部则具有亲水性空腔，能够特异性结合钾离子，因此它可以破坏质子梯度，导致膜电位降低或消失，使线粒体去极化发生自噬，最终进入酸性的溶酶体中，T2D患者的β细胞在给予缬霉素处理后发生自噬的线粒体数量降低，说明线粒体自噬发生了损伤）。并且，在T2D患者的非β细胞中，未观察到线粒体自噬损伤（图S1D）。综上所述，T2D胰岛表现出mtDNA含量、β细胞mtRNA水平降低，β细胞线粒体自噬损伤，这与线粒体质量控制损伤一致。

先前有研究发现，肥胖不会改变小鼠β细胞的线粒体结构。为了研究T2D中其他β细胞线粒体质量缺陷对于肥胖来说是否重要，研究人员测量了表达mt-Keima线粒体自噬报告基因的转基因小鼠mtDNA含量和线粒体自噬，这些小鼠被给予了1年的常规脂肪饮食（RFD）或高脂肪饮食（HFD）（小编注：mt-Keima是一种用于检测线粒体自噬的荧光蛋白探针，适用于实时监测线粒体被自噬系统清除的过程）。研究人员观察到，饮食诱导肥胖后，胰岛mtDNA含量没有差异，β细胞线粒体自噬有轻微损伤(饮食诱导肥胖(diet-induced obesity，DIO)；图S1 E-G)。这些结果表明，肥胖或胰岛素抵抗并不能重现T2D中β细胞线粒体质量控制的损伤。

2 .线粒体质量控制是维持β细胞质量和功能的必要条件

为了确定线粒体质量控制受损是否足以导致β细胞衰竭，研究人员建立了线粒体质量控制机制成分敲除的小鼠遗传模型，借用线粒体自噬受损或线粒体基因组完整性受损的模型来分析不同的线粒体质量控制因素损伤对T2D中β细胞衰竭的作用。研究人员首先生成了β细胞含C型凝集素结构域16A（CLEC16A）特异性敲除的小鼠(Clec16a^f/f; Ins1-Cre, 下文简称为β-Clec16a^KO; 图S2A)。CLEC16A是线粒体自噬的调节因子，对维持线粒体呼吸、胰岛素分泌和葡萄糖稳态至关重要。CLEC16A在T2D患者的胰岛中表达下降，并受到T2D基因胰腺十二指肠同源盒1（PDX1）的转录调控。在进行生理或形态学分析之前，研究人员分别给予β-Clec16a ^KO小鼠和对照组RFD或HFD 12周，结果显示，两组小鼠在HFD后体重均上升，且组间无差异（图S2B）。与先前研究一致，Ins1-Cre和仅带flox位点的对照小鼠无法在表型上区分彼此（图S2 C和D），因此研究人员将其进行了合并以用于后续分析。如前所述，RFD喂养的β-Clec16a ^KO小鼠出现葡萄糖耐受不良，而DIO加重了这种表型（图1D）；而外周胰岛素敏感性在对照组和β-Clec16a ^KO小鼠之间则没有变化，这表明葡萄糖稳态的差异不是由于胰岛素抵抗引起的（图S2 E到N）。

此外，β-Clec16a ^KO 小鼠在葡萄糖刺激后体内胰岛素释放、离体胰岛的胰岛素分泌以及胞质钙振荡动力学均出现受损（图S3 A-D），且HFD喂养的β-Clec16a ^KO 小鼠表现出OXPHOS亚基表达的改变（图S4A）（小编注：胞质钙振荡动力学是指细胞内钙离子浓度随时间变化的周期性波动现象）。接下来，研究人员通过透射电子显微镜评估了线粒体超微结构，并通过对线粒体标记物SDHA进行免疫染色（小编注：SDHA即琥珀酸脱氢酶复合体亚基A，是线粒体内膜关键蛋白（复合体II组分），可作为线粒体标记物，同时其分布模式可反映线粒体的结构动态），从而评估线粒体形态和网络复杂性。结果与先前观察到的线粒体清除受损一致，β-Clec16a ^KO小鼠的胰岛线粒体显示嵴扭曲，球形度增加，网络/分支复杂性降低（图S4 B-I）。

接下来，研究人员观察到β-Clec16a ^KO 小鼠并未通过增加β细胞总量来补偿DIO所造成的影响（图1E），而α-细胞的总量则没有差异（图S4J）。为了了解HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠中β-细胞总量减少的原因，研究人员评估了β-细胞增殖和凋亡的标志物，但各组之间没有观察到差异（图1F和G）。因此，研究人员推测在该模型中可能有另一种机制导致了β-细胞总量的损失。

由于衰老也是T2D发生的一个危险因素，研究人员评估一岁龄的 RFD 喂养的β-Clec16a ^KO小鼠，结果与HFD喂养的效果类似，这些小鼠也出现了葡萄糖耐受不良，β细胞总量减少，但增殖或凋亡没有变化（图S5 A-D）。随后，研究人员将携带Clec16a条件等位基因的小鼠与他莫昔芬诱导的MIP-CreERT小鼠（小编注：他西莫芬诱导的MIP-CreERT小鼠：MIP-CreERT（Mouse Insulin Promoter-CreERT）是一种广泛用于胰腺β细胞特异性基因操作的转基因小鼠模型。该小鼠模型利用了tamoxifen诱导的Cre/loxp重组系统，通过将Cre与雌激素受体（ER）融合而实现。在没有接受tamoxifen诱导的情况下，Cre-ERT2通常处于失活状态。MIP是小鼠胰岛素启动子，可以特异性驱动CreERT在胰腺β细胞中表达）杂交，从而获得了可诱导性的β细胞Clec16a特异性敲除小鼠(Clec16a^f/f，MIP-CreERT，下文简称iβ-Clec16a^KO小鼠)。随后，研究人员在7周龄时注射他莫昔芬，结果显示iβ-Clec16a ^KO小鼠在饲喂RFD时表现出轻度葡萄糖耐受不良，并且在饲喂HFD时恶化，β细胞总量减少，与MIP -CreERT对照组相比，β细胞复制、存活率、总质量或胰岛素敏感性没有差异（图S5 E-J），表型与β-Clec16a ^KO基本一致。综上所述，这些数据表明，线粒体自噬对于在衰老或肥胖后保持β细胞总量至关重要，这种机制独立于细胞复制或存活，且不能完全归因于β细胞发育缺陷。接下来，研究人员通过将Ins1-Cre和Tfam^f/f小鼠进行杂交，从而获得了mtDNA减少的小鼠品系(以下称为β-Tfam ^KO；图S6A)，线粒体转录因子A（TFAM）是线粒体基因组完整性、mtDNA复制数量控制以及mtDNA转录的关键调节因子。随后，研究人员选择Ins1-Cre敲入品系，从而避免之前使用转基因RIP2-Cre品系敲除Tfam时可能产生的脱靶效应（小编注：Ins1-Cre敲入品系：这是一种基因工程小鼠，其Cre重组酶基因被精确插入到Ins1基因（胰岛素基因）位点中。这种设计使得Cre重组酶主要在β细胞中表达，从而能够特异性地删除目标基因，而不会在其他细胞类型中产生不必要的基因编辑。RIP2-Cre转基因品系：这是另一种常用的Cre小鼠品系，其Cre重组酶由RIP2（大鼠胰岛素2）启动子驱动。然而，RIP2-Cre会在某些非β细胞中表达，导致脱靶效应，即在非目标细胞中意外删除基因，从而干扰实验结果）。先前研究表明，β-细胞Tfam缺失会导致胰岛素分泌受损和葡萄糖稳态失调，而T2D患者β-细胞中Tfam的表达降低，同时Tfam也是PDX1的转录靶点。

随后，研究人员观察到β-Tfam^KO小鼠胰岛中mtDNA的减少（图S6B）。为了证实mtDNA缺失是由β细胞引起的，研究人员将β-Tfam ^KO小鼠与ROSA26-lox-STOP-lox-tdTomato报告基因小鼠进行杂交（小编注：Rosa26-LSL-tdTomato小鼠是指在Rosa26位点插入了tdTomato基因，tdTomato是一种明亮的红色荧光蛋白，在Cre重组酶切割loxp位点后被激活，可以用于追踪和标记表达Cre重组酶的细胞），在Cre表达后即可用tdTomato标记β细胞。在对tdTomato阳性的β-细胞进行荧光活化细胞分选后（小编注：荧光活化细胞分选可分选细分的细胞群，通过荧光探针标记细胞，使其带上正电荷或负电荷，在高压电场的作用下发生不同的偏转，落入不同的收集器中，目前可实现十多至二十多探针的检测），研究人员发现β-Tfam ^KO小鼠的mtDNA含量几乎完全消失（图S6C），且β-Tfam ^KO小鼠的胰岛OXPHOS蛋白表达改变（图S6D）。此外，线粒体形态和网络复杂性分析显示，缺乏TFAM的β细胞线粒体体积增加，球形度下降，分支数量、长度和连接增加（图S6 E-K）。这些数据表明，β细胞中TFAM的缺失导致了线粒体结构的改变，以及mtDNA的缺失。

随着年龄的增长，β-Tfam ^KO小鼠表现出了与Clec16a敲除的小鼠相似的进行性葡萄糖耐受不良、葡萄糖刺激后胰岛素分泌减少、β细胞总量减少，但α细胞质量和外周胰岛素敏感性未发生变化（图1 H、I和图S6）。在8周龄和12周龄时，β-Tfam ^KO小鼠的β细胞复制显著增加（图1J和图S6Q），在8周龄时细胞凋亡无变化，在12周龄时仅小幅增加（图1K和图S6R）。其次，在RIP2-Cre（小编注：即Ins2-Cre，insulin基因在啮齿类中有两个拷贝，分别为Ins1和Ins2，目前认为Ins1来自于Ins2的部分反转录，但是两者具有相同的调节区，Ins1和Ins2启动子都被广泛用于基因小鼠模型中）介导的Tfam缺失后，并未未观察到β细胞凋亡增加。与Clec16a缺失小鼠类似，这些结果表明Tfam缺陷小鼠中β细胞总量的损失可能不是由β细胞复制或存活的变化介导的，并且线粒体质量控制损伤会促使β细胞总量和功能逐渐丧失，这与在T2D中观察到的结果相似。

3.线粒体质量损伤导致β细胞身份丧失

由于研究中所用到的损害线粒体质量控制的正交小鼠模型在表型上均存在相似性，因此研究人员推测其可能存在某种共同的机制。首先，研究人员对饲喂了RFD和HFD的β-Clec16a ^KO小鼠、β-Tfam ^KO小鼠以及各自的对照小鼠胰岛进行了RNA测序，并且将结果与先前验证的β细胞成熟/不成熟基因集相结合，发现RFD和HFD喂养的β-Clec16a ^KO小鼠和β-Tfam ^KO小鼠胰岛中不成熟基因上调，而成熟基因下调（图1 L和M）。基因集富集分析（GSEA）证实，在Clec16a或Tfam缺失小鼠中被诱导的基因包含大量β细胞未成熟的标志物（图1N）。通路分析发现，与胰岛素分泌和线粒体脂质代谢相关的基因下调，表明Clec16a敲除小鼠胰岛的β细胞代谢功能失调；其次，Clec16a敲除的胰岛发育或形态发生通路的富集增加，如Notch和DNA结合抑制剂（Id）信号(图S7 A和B)，与对照组相比，β-Tfam ^KO小鼠胰岛的胰岛素分泌和关键的β细胞信号通路（胰岛素分泌、年轻小鼠的成熟型糖尿病和2型糖尿病）下调（图S8A）。此外，在这两种遗传模型中，均观察到了核心β细胞成熟/身份标记的表达减少，以及未成熟标记的上调（图1O和图8、B和C）

在β细胞特异性缺失有丝分裂蛋白1和2的小鼠胰岛中，核心β细胞成熟标记物的表达减少，未成熟标记物的表达增加，该小鼠模型是也是一种线粒体质量控制受损的模型，其线粒体融合被破坏、线粒体呼吸减少、mtDNA含量和胰岛素分泌下降、血糖控制受损(β-Mfn1/2^DKO小鼠；图S8、D、E)。随后，研究人员测试了DIO后线粒体融合的相关性，首先，β-Mfn1/2 ^DKO小鼠在体内和离体胰岛中均表现出糖耐量和胰岛素分泌的严重缺陷（图S8 F-I），而外周胰岛素敏感性没有差异（图S8 J和K），OXPHOS亚基表达下降（图S8L）；并且与Clec16a和Tfam敲除小鼠一致，HFD饲养的β-Mfn1/2 ^DKO小鼠也显示出β细胞总量的损失。β-细胞增殖增加，但凋亡未发生变化（图S8 M-O）。

为了检验β细胞成熟程度的变化，研究人员对胰腺组织切片进行了免疫染色。结果显示，在终末分化的β细胞中未观察到、但是在T2D患者胰岛中观察到的去分化标志物醛脱氢酶 1A3（ALDH1A3），在RFD喂养的β-Clec6a^KO小鼠中被检测到，并且在HFD喂养时增加（图1P），并且同样在β-Tfam^KO和β-Mfn12^DKO小鼠的β细胞中上调（图1P和图S9A）。同时，在Clec16a、Tfam、Mfn1/2敲除后，β细胞中的去分化标志物分化簇81（CD81）也出现了上调（图1P和图S9B）。此外，通过免疫染色和WB检测发现，与各自的对照组相比，这些线粒体质量控制受损的小鼠模型中细胞成熟标记物葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）和尿皮质素3（UCN3）表达显著降低（图1 Q和R，图S9 C-E）。在衰老的β-Clec6a^KO小鼠和HFD喂养的iβ-Clec6a^KO小鼠中，也观察到了ALDH1A3阳性的β细胞增加，UCN3阳性细胞则减少（图S10 A-D）。在β-Clec6a^KO、β-Tfam^KO和β-Mfn12^DKO小鼠胰岛中包括八聚体结合转录因子4（Oct4）、SRY相关HMG盒转录因子2（Sox2）、同源框蛋白（Nanog）和胰腺发育相关基因神经元素3（Ngn3）在内的干细胞和内分泌祖细胞标志物则没有增加，E3泛素连接酶（Parkin）或者mTOR信号通路中的相关靶点同样也没有上调（图S11 A和B）。以上结果表明，线粒体质量控制受损会诱导不成熟标志物的出现以及终末β细胞身份的丧失，并且目前没有证据表明其能够回归到早期发育前体状态。

接下来，研究人员采用遗传谱系追踪来证实β-细胞Clec16a和Tfam敲除小鼠中β细胞身份的丧失。如上所述，研究人员将β-Clec16a ^KO 和β-Tfam ^KO小鼠（和Ins1-Cre对照组小鼠）与ROSA26-lox-STOP-lox-tdTomato报告基因小鼠杂交，并推测β细胞身份的丧失会导致对胰岛素阴性而tdTomato阳性的细胞产生。结果显示，在Ins1-Cre对照组中，95%的β细胞对胰岛素和tdTomato均呈阳性（图S12 A、B），而在RFD喂养的β-Clec16a ^KO小鼠和对照组相比起tdTomato细胞比例则没有变化（图1S）。然而，在饲喂HFD后的β-Clec16a ^KO小鼠胰岛素阴性、tdTomato阳性细胞则增加（图1S和图S12A）。在Tfam敲除小鼠中，胰岛素阴性、tdTomato阳性细胞同样显著增加（图1S和图S12B）。在β细胞特异性敲除Tfam的小鼠中，β细胞身份改变的频率与先前报道的β细胞特异性敲除转录因子NKX2.2的小鼠模型频率相似，表明mtDNA缺失对β细胞身份有着重要的影响。虽然研究人员观察到在β-Tfam ^KO小鼠和HFD喂养的β-Clec16a ^KO小鼠中胰高血糖素阳性、tdTomato阳性细胞的少量增加（图S12 C和D），但α-细胞总量在两种模型中均未增加（图S4J和图S6N），表明其β/α细胞转分化并不频繁。综上所述，这些结果表明线粒体质量控制受损导致了β细胞身份的丧失。

4.线粒体质量控制缺陷诱导ISR

研究人员假设线粒体质量控制的损伤可能会激活一个共同的线粒体逆向信号通路，它能导致与诱导β细胞去分化/不成熟的转录反应。为了验证这一假设，研究人员通过RNA-seq对线粒体自噬缺陷（β-Clec16a KO）、mtDNA调控缺失（β-Tfam KO）和融合缺陷（β-Mfn1/2 DKO）模型中的前500个上调和下调基因进行了比较分析。研究人员发现在这三个模型中都存在74个上调基因和28个下调基因（图2A和表S1）。为了寻找这些靶点之间的联系，研究人员利用STRING（检索相互作用基因/蛋白的检索工具）对这102个共同的差异表达基因进行分析，发现β-细胞成熟过程(Ins2、Ucn3、MafA 和 Slc2a2（编码GLUT2)和ISR通路(Trib3、Ddit3、Atf3、Fgf21、Cebpβ 和Gdf15)中的关键靶点存在相互作用(图2B)。（小编注：整合应激反应（integrated stress response ISR）是蛋白质稳态失调时诱发的信号中心调控网络，可以对发生在内质网和细胞浆中的应激作出反应，ISR能够整合细胞内的各种应激状态，包括蛋白质稳态失调、营养缺乏、病毒感染和氧化还原失衡。未折叠蛋白反应（unfolded protein response UPR）可以识别内质网中错误折叠的蛋白，热休克反应（heat shock response HSR）则负责细胞浆部分，从而促进蛋白正确折叠和降解。ISR可以通过调节eIF2α的磷酸化水平与UPR和HSR耦连，调控基因表达，ISR系统可以使细胞整体上减少翻译起始率，并增加特定mRNA的翻译，二者对细胞基因表达重编程，维持细胞功能平衡：提高蛋白质折叠能力，支持细胞分化，响应细胞损伤。当ISR启动后仍然无法缓解细胞应激状态，ISR会诱发细胞凋亡，清除受损细胞）。

线粒体逆向信号在调节β细胞的成熟和身份方面的功能尚未被观察到。线粒体逆向信号传导机制之一是通过ISR将线粒体或内质网损伤反应整合为单一途径，这是由翻译起始因子EIF2α的磷酸化，来稳定激活转录因子4（ATF4）以促进下游转录反应的一种机制。事实上，研究人员在RFD喂养的β-Clec16a ^KO小鼠中观察到典型的ISR转录靶点的上调，并在HFD喂养小鼠模型中这种上调进一步增加（图2C）。Txnip（一种将葡萄糖毒性与线粒体损伤联系起来的基因）也表现出上调（图2D和图S13A）。在β-Clec16a ^KO、β-Tfam ^KO和β-Mfn1/2 ^DKO小鼠的胰岛中，EIF2α磷酸化和ATF4蛋白水平也升高（图2E、F和图S13B）。研究人员没有观察到内质网应激的特征：一方面内质网伴侣蛋白Bip的表达水平在β-Clec16a ^KO , β-Tfam ^KO和β-Mfn1/2 ^DKO 小鼠胰岛的胰岛中均未见显著变化；的增加（图2G和图S13A）；另一方面研究人员通过透射电镜观察，不论是RFD还是HFD喂养条件下， β-Clec16a ^KO 小鼠胰岛（图S14A-D）和β-Mfn1/2 ^DKO 小鼠胰岛的内质网形态学均没有明显的结构变化。

为了确定线粒体质量控制受损是否会引发ISR并导致人类β细胞成熟度丧失，研究人员通过假胰岛方法构建了TFAM缺陷的EndoC-βH3人类β细胞和原代人类胰岛。简而言之，将人类胰岛分散后，用编码靶向TFAM的shRNA（或对照scramble shRNA）进行转导，然后重新聚集成假胰岛。研究人员在EndoC-βH3细胞和人假胰岛中证实了TFAM的有效敲低和mtRNA表达的减少，这与TFAM功能的损伤相一致（图2H和I）。与研究人员在小鼠中的观察结果相似，TFAM缺失激活了人EndoC-βH3细胞和假胰岛的线粒体ISR，表现为EIF2α磷酸化和ATF4蛋白稳定性增加，进一步诱导ISR转录靶点CEBPβ、CHOP、GDF15和FGF21的表达，而BIP表达没有变化（图2J和K）。研究人员观察到在shTFAM处理的人EndoC-βH3细胞和假胰岛中β-细胞成熟标志物降低（图2L）。这些结果证实线粒体质量控制缺陷诱导了小鼠和人胰岛ISR发生和β细胞不成熟。

5.ETC/OXPHOS缺陷作为逆向激活信号，在线粒体质量控制受损后出发ISR

接下来，研究人员进一步评估了在β细胞线粒体质量控制缺陷后，促进ISR的上游线粒体信号。过量的mtROS、错误折叠的线粒体蛋白积累或ETC/OXPHOS缺陷能够激活线粒体ISR。研究人员首先检测了β-Clec16a KO小鼠胰岛是否表现出总ROS水平的变化，检测发现与对照组相比，模型组ROS水平下降（图S15A）。为了更确切地确定过量的mtROS是否会导致β细胞功能障碍，研究人员将β-Clec16aKO小鼠（或Ins1-Cre对照）与Cre诱导的线粒体靶向过氧化氢酶（mCAT）过表达小鼠杂交，以选择性地清除β细胞mtROS（图S15B）。然而，mCAT过表达降低了β细胞中的H2O2和超氧化物，但是并没有改善HFD喂养的β-Clec16a KO 小鼠的血糖调节能力和胰岛素分泌（图S15C-E）。研究人员测量了线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）标志物，来筛选错误折叠线粒体蛋白进行的转录反应。但是研究人员在线粒体质量控制受损模型中没有观察到UPRmt标记物的一致增加（图S15F-H），这表明线粒体蛋白错误折叠和mtROS不太可能是诱导ISR的原因。

接下来，研究人员用Perceval生物传感器测量了ATP/ADP比率（小编注：Perceval是一种基因编码的荧光生物传感器，它通过将GFP环状排列变体与来源于细菌的ATP结合蛋白（GlnK1）相结合构建而成，荧光共振能量转移（FRET）双荧光蛋白的构象变化引起FRET信号改变，再通过荧光显微镜或流式细胞仪实时捕获FRET信号变化，可实时、动态监测细胞内ATP/ADP比值的变化，反映能量代谢状态。ATP/ADP比值下降表明ADP结合导致构象恢复，FRET效率降低，提示线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能障碍），作为对β细胞线粒体质量控制丧失后能量代谢和电子传递链/氧化磷酸化（ETC/OXPHOS）系统的初步评估。研究人员观察到，与RFD喂养的对照组相比，β-Clec16a ^KO 小鼠胰岛中葡萄糖刺激的ATP/ADP比率降低，而饲喂HFD后ATP/ADP比率进一步减少（图S16A）。在β-Tfam ^KO小鼠胰岛中，研究人员观察到葡萄糖刺激的ATP/ADP比值和总能量储备均显著降低，总能量储备是通过NaN₃（叠氮化钠）暴露来抑制所有线粒体功能后测量的（小编注：细胞通过代谢产生ATP，是细胞内能量的主要来源，对细胞的各种功能活动至关重要，如细胞分裂、信号传导和蛋白质合成。在本文中，研究人员通过评估细胞内现有的ATP水平，反映细胞内总能量的储备。NaN₃是一种线粒体呼吸链抑制剂，通过抑制细胞色素c氧化酶（电子传递链复合体IV）阻断氧化磷酸化，从而阻止线粒体ATP的生成。通过抑制线粒体功能，可以评估细胞内现有的ATP水平，进而反映细胞内总能量储备。本文中同时利用PercevalHR生物传感器对ATP含量进行检测），这与大量的能量缺失相一致（图S16B）。

ETC/OXPHOS系统和ISR之间存在公认联系，但由于在失去线粒体质量控制后ETC/OXPHOS系统可能发生多种生化反应，因此两者之间的问题很难解决。事实上，研究人员在线粒体质量控制受损的模型中观察到多个OXPHOS亚基的破坏（图S4A，图S6D和图S8L）。此外，在成肌细胞和分化的肌管中抑制复合物I、III或V已被证明可以通过能量破坏导致下游的几种代谢缺陷来激活ISR。为此研究人员使用了多种方法来验证ETC/OXPHOS系统的损伤是否导致了β细胞线粒体质量控制缺陷后的ISR激活。在EndoC-β H3人β细胞中通过腺病毒介导的TFAM敲低（AdV-shTFAM）激活ISR后，研究人员们用类黄酮-表儿茶素（EPI，具有改善β细胞呼吸功能和 OXPHOS 表达及活性）处理AdV-shTFAM（和AdV-shScramble）人β细胞。研究人员观察到EPI减弱了AdV-shTFAM人β细胞中ISR的激活（图S16C-D）。

通过过表达细菌或酵母蛋白以促进持续的NADH氧化，可以在体内复合物I缺失或体外复合物I、III或V抑制后减弱ISR的激活。为了评估线粒体基因组不稳定是否可能发生这种情况，研究人员在TFAM缺乏的EndoC-β H3细胞中过表达（1）LbNOX，一种细菌来源的NADH氧化酶，能够独立于ETC将NADH转化为NAD⁺；（2）mitoLbNOX，一种线粒体基质靶向的LbNOX变体；（3）NDI1，一种单亚基替代的内部NADH脱氢酶，在TFAM缺失的EndoC-β H3细胞中，它将电子传递给泛醌，以促进OXPHOS对NADH的持续氧化和 ATP合成。虽然与EPI的作用机制不同，研究人员观察到LbNox、mitoLbNox或NDI1的表达都减少了AdV-shTFAM处理的β细胞中ISR的诱导（图S16E）。以上研究表明，线粒体基因组不稳定后ETC/OXPHOS系统的缺陷有助于诱导人类β细胞ISR。

6.线粒体质量控制的缺失促进β细胞染色质重塑

为了解决线粒体质量控制缺失后与线粒体逆向信号相关的β细胞转录调控的变化，研究人员采用了单核RNA-seq和ATAC-seq。snRNA-seq和snATAC-seq数据的UMAP图显示，与对照组相比，HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠的β细胞群明显不同（图3A）。snRNA-seq数据的通路分析揭示了对照组小鼠和β-Clec16a^KO小鼠的β细胞中与胰岛素分泌相关的靶标之间的差异（图S17A和B）。snATAC-seq研究表明，在Clec16a缺陷的β细胞中，25016个特定的顺式调控元件作为染色质可及性峰，其中3567个峰在对照组中不存在（图3B）。这些变化包括Clec16a缺陷β细胞中Ins2基因座多个位点的染色质可及性丧失，以及Atf3和Gdf15基因座的可及性增加（图3C）。

使用基因组区域注释富集工具（GREAT）对Clec16a缺失的β细胞中的差异可及峰进行富集分析，发现与线粒体自噬、溶酶体转运和葡萄糖代谢相关区域的峰丢失，这与CLEC16A已知的功能一致（图S17C）。相比之下，在Clec16a 缺失的β细胞中可获得的GREAT峰在与胰腺发育异常和胰腺β细胞分化异常相关的区域富集（图S17D）。通过HOMER（小编注：HOMER是一个用于分析ChIP-seq、RNA-seq等数据的生物信息学工具，主要用于发现基序（motif）并进行功能注释）研究人员观察到Clec16a缺失的β细胞中ISR的转录因子结合位点基序富集，其中包括ATF4、ATF3和CHOP 在内的bZIP因子在β-Clec16a^KO小鼠中高度富集（3D和E）。在Clec16a缺失的β细胞中也发现了BACH2（一种在T2D中β细胞发育不成熟相关的转录因子）的结合位点增加（图3,D和E）。研究人员观察到在Clec16a缺失的β细胞中，对β细胞成熟、身份和功能至关重要的转录因子结合位点丢失，包括关键的β细胞转录因子和成熟调节因子NEUROD1（图3D和E）。以上结果表明，线粒体逆向信号改变了染色质可及性，有利于ISR的转录激活和β细胞身份和成熟的丧失。

7.线粒体质量控制的缺失导致肝细胞和棕色脂肪细胞的不成熟和ISR

研究人员继续探究了线粒体质量控制的缺陷是否会导致其他代谢组织的成熟度和功能出现类似的损害。研究人员通过腹腔注射表达Cre重组酶的腺相关病毒8（AAV8-Tbg^cre），在肝细胞特异性Tbg启动子控制下，对12周龄HFD喂养的对照组、Mfn1/2-floxed或Tfam-floxed小鼠进行了肝脏特异性敲除Mfn1/2或Tfam，这些小鼠分别被称为L-Mfn1/2^DKO和L-Tfam^KO小鼠（图4A-C）。在这两个模型中，mtDNA含量降低，OXPHOS亚基表达发生改变，而线粒体质量没有明显减少（图4D-H）。L-Tfam^KO小鼠的线粒体呼吸复合物活性降低（图S18A）。L-Mfn1/2^DKO小鼠的葡萄糖耐量、胰岛素敏感性和丙酮酸耐量发生了改变（图S18B-F）。L-Tfam^KO小鼠的肝脏质量增加，但总体重没有发生变化（图 S18D-H）。L-Tfam^KO小鼠还出现肝脏脂肪变性和气球样变，导致NAFLD活动评分升高，并增加肝脏脂质积累（图S18I-K）。然而，研究人员没有在L-Mfn1/2^DKO和L-Tfam^KO小鼠中观察到肝脏炎症或纤维化的迹象（图S18I、J、L）。L-Tfam^KO小鼠血清ALT和LDH升高，L-Mfn1/2^DKO小鼠血清胆固醇降低，L-Mfn1/2^DKO和 L-Tfam^KO小鼠肝糖原减少，表明存在明显肝功能障碍（图4I-L）。与β细胞类似，线粒体质量控制的缺失并没有引起肝细胞凋亡（图S18M）。以上研究结果表明，线粒体质量控制的缺失促进了肝脏的许多生理缺陷的发生。

接下来，研究人员利用RNA-seq来确定线粒体质量控制的缺失是否会促进肝细胞中线粒体ISR的转录激活、细胞不成熟分化和末端身份标记的丢失。与β细胞类似，L-Mfn1/2^DKO或L-Tfam^KO小鼠经典ISR靶点表达增加，而Bip表达没有上调（图4M）。研究人员又将RNA-seq数据与肝细胞关键终末身份和发育标志物的列表（小编注：该列表来自参考文献中对C57BL/6J小鼠E11.5（胚胎第11.5天）、E12.5、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5、第0天（出生当天）、第3天、第7天、第14天、第21天和正常成人肝脏的基因表达和转录调控进行了分析。参考文献：T. Li, et al. Genomics 93, 235–242 (2009).）联合分析。研究人员发现包括与细胞色素P450活性和胆红素葡萄糖醛酸化相关基因在内的成熟肝细胞标志物表达降低，包括甲胎蛋白（Apf）、DNA拓扑异构酶IIa（Top2a）和磷酸丝氨酸转氨酶1（Psat1）在内的几种肝细胞未成熟标志物增加（图4N和O）。在L-Mfn1/2^DKO和L-Tfam^KO小鼠中，研究人员进一步证实ISR的诱导是由增加ATF4蛋白水平和EIF2α磷酸化水平（图4P）、降低成熟肝细胞蛋白水平（CYP2E1、MUP-3）并增加未成熟蛋白水平（AFP、TOP2A、PSAT-1）引起的（图4Q和R）。

考虑到线粒体对棕色脂肪组织（BAT）功能的重要性，研究人员探究了终末身份标志物的基因表达和心磷脂合成酶（Crls1）缺乏小鼠的ISR。Crls1是线粒体磷脂心磷脂生物合成所必需的酶，它通过调节心磷脂依赖性线粒体自噬和维持mtDNA含量来影响线粒体质量控制。研究人员重新分析了来自脂肪特异性敲除Crls1基因小鼠（Crls1 floxed小鼠与脂肪细胞特异性Cre重组酶品系小鼠杂交生成，以下简称AdCKO）BAT的RNA-seq数据。先前AdCKO小鼠被发现其BAT中的线粒体呼吸、mtDNA含量、葡萄糖摄取和产热均有所减少，同时还表现出全身代谢不灵活和胰岛素抵抗增加，然而未评估心磷脂与BAT成熟度之间的联系。研究人员利用BATLAS数据库(小编注：BATLAS（Deconvoluting Brown Adipose Tissue，去卷积棕色脂肪组织）是一个结合生物信息学与实验数据的工具或数据库，旨在解析棕色脂肪组织的细胞异质性及其功能特征。它能够通过解卷积分析，从复杂的组织样本中区分不同细胞类型的贡献，从而更精确地研究BAT的组成、代谢活性和调控机制。doi: 10.1016/j.celrep.2018.09.044.)评估了AdCKO小鼠和对照小鼠中BAT之间的差异表达基因，其中包含大量BAT身份/成熟度标志物的基因。研究人员在AdCKO小鼠的BAT中发现包括Ppargc1α和Ucp1在内的BATLAS基因显著下调，同时促进了ISR诱导的转录靶点的基因表达（图4S）。

这些结果共同表明，线粒体质量控制在通过限制代谢组织中的线粒体逆向信号传导来促进终末细胞身份识别方面起着至关重要的作用。

8.阻断逆向信号传导可在体内恢复β细胞质量和成熟度

研究人员根据多种代谢组织中的结果，假设线粒体质量控制的缺失与ISR有关，并直接诱导终末细胞成熟度和身份的丧失。为了验证ISR在β细胞成熟度中的重要性，我们用ISRIB（一种公认的ISR药理学抑制剂）处理HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠。研究人员首先用ISRIB处理HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠和对照组小鼠分离出的胰岛24小时，发现到ISR转录靶点Cebpβ和Trib3表达如预期减少（图5A和B）。ISRIB处理还恢复了HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠胰岛中Ucn3的表达并降低了ALDH1A3的表达（图5C和D）。为了确定β细胞身份是否由于线粒体自噬的意外上调而得到恢复，研究人员将β-Clec16a^KO小鼠与mtKeima线粒体自噬报告品系杂交以评估线粒体自噬通量。ISRIB并没有改善与Clec16a缺失导致的线粒体自噬通量缺陷（图5E），表明ISRIB不能通过改善线粒体自噬来恢复β细胞身份标志物，而是通过ISR抑制逆向信号传导。

为了确定通过ISR的逆向信号传导是否导致体内β细胞质量和身份的丢失，研究人员通过每天腹腔注射ISRIB处理HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠和对照小鼠4周（图5F）。在对照组中延长ISRIB处理时间不会损害β细胞质量或葡萄糖耐量（图5G-I），这与之前的报告一致。此外，高胰岛素-正常血糖钳夹实验显示ISRIB处理后外周胰岛素敏感性没有差异（图S19A-I）。ISR抑制阻止了HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠β细胞质量损伤，并改善了葡萄糖耐受不良，而组间胰岛素敏感性保持不变（图5G-I）。ISRIB处理还降低了HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠中ALDH1A3的表达，并增加了UCN3阳性β细胞的频率，使GLUT2的表达和定位正确，这与β细胞成熟度和身份的恢复一致（图5J-O）。

葡萄糖毒性已被证明会诱导β细胞去分化，而根皮苷通过抑制钠/葡萄糖共转运蛋白1/2（SGLT1/2）来降低高血糖后可以改善去分化。根皮苷处理有效缓解了HFD喂养β-Clec16a^KO小鼠的糖代谢紊乱，但并未恢复β细胞质量，表明葡萄糖毒性并没有促进线粒体质量控制受损后的β细胞去分化（图S20A-E）。根皮苷和ISRIB处理都展现了HFD喂养的β-Clec16a^KO小鼠在葡萄糖不耐受方面有相似的改善功能，此外ISRIB并未通过缓解高血糖间接恢复β细胞的质量和身份。综上所述，这些研究表明，通过ISR诱导的线粒体逆向信号是代谢组织中细胞成熟度和身份的直接调控因子。

总结  

线粒体损伤是包括糖尿病在内的代谢性疾病的标志性特征，但代谢组织中受损线粒体的后果尚不清楚。在本研究中，研究人员报道了功能失调的线粒体质量控制参与了逆向信号程序，损害β细胞、肝细胞和棕色脂肪细胞的细胞特性和成熟度。整个线粒体质量控制途径中的靶向缺陷，包括基因组完整性、动态性或更替，会损害氧化磷酸化机制，激活线粒体综合应激反应，引发染色质重塑，促进细胞不成熟而不是凋亡，从而产生代谢功能障碍。但在体内的综合应激反应的药物阻断恢复了线粒体质量控制丧失后的β细胞身份。因此，靶向线粒体逆向信号可能有望成为治疗或预防代谢紊乱的有效手段。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adf2034?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed