撰文 | 夏志蕊 王颖雯 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

代谢功能障碍相关脂肪变性肝病(MASLD，以前称为非酒精性脂肪性肝病)的全球患病率约为25.2%，是全球成年人和儿童慢性肝病的主要原因。MASLD主要包括肝脏的一系列组织学异常，从单纯性脂肪变性到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH，以前称为非酒精性脂肪性肝炎)，这是一种可能进一步发展为肝硬化、肝细胞癌和终末期肝病的炎症疾病。据估计，3%-6%的成年人患有MASH，预计未来10年其发病率将增加到56%。然而，迄今为止还没有批准的药物用于治疗MASH(小编注：2024年3月已有首款MASH药物Resmetirom获得FDA批准上市。本文是2024.03.13接收的，定稿大概率早于Resmetirom上市时间，所以信息不一致)。因此，更好地了解MASH的发病机制对于开发有希望的治疗方法至关重要。

MASH的发病机制复杂，且由多种因素所诱导。因此，确定诱导MASH的关键因素，并阐明触发炎症、驱动单纯性脂肪变性进展为MASH的机制至关重要。肝脏脂肪变性使肝脏发生MASH的概率上升，随着损伤进一步加重，进而发展为伴有炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和微生物菌群失调的MASH。巨噬细胞被认为是控制MASH炎症过程的关键细胞。最近研究表明，在MASH中常驻的库普弗细胞(Kupffer cells, KCs)的自我维持能力受损(小编注：自我维持能力指细胞通过调控自身增殖、分化与稳态机制，长期维持其功能、数量及存活状态的能力)。为了应对KCs死亡率的增加，机体会促进单核细胞生成巨噬细胞，即单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages, MoMCs)，以补充KCs。这些新生成的巨噬细胞表现出与KCs不同的转录组特性以及更显著的炎症特性，并在更大程度上促进肝损伤。在MASH过程中，常驻KCs的死亡以及炎症性MoMCs的取代是由于机体对肝损伤的过度先天免疫反应所致，这可能导致肝脏炎症和肝脏病理改变。因此，深入了解MASH中KCs的稳态，并寻找调控KCs命运的关键分子具有重要意义。

氧化应激作为一个关键风险因素，被广泛认为是脂肪变性进展为MASH的核心介质。最近研究表明，脂质过氧化衍生物，如氧化磷脂(Oxidized phospholipids, OxPL)会促进MASH发展；而中性粒细胞胞质因子1(neutrophil cytosical factor 1, NCF1)编码的蛋白(NCF1，传统上称为p47phox)是诱导型NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2) 复合物的关键组分，该复合物负责氧的单电子还原，最终产生活性氧(ROS)，尤其在髓系吞噬细胞中(即骨髓源性细胞)(小编注：NOX2复合物包含胞内亚基：NCF1、NCF2和NCF4，以及膜结合亚基：CYBB和CYBA。其中NCF2亚基可以启动电子从NADPH穿过质膜，并转移到氧分子，使其转化为超氧阴离子，超氧化物进一步转化为H₂O₂)。NCF1的多态性与多种慢性炎症自身免疫疾病的易感性相关，包括类风湿关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)。NCF1也参与肝脏疾病，如酒精性肝损、肝纤维化和CXCL1驱动的肝损伤。然而，NCF1是否以及如何调节饮食诱导的MASH中的氧化反应和炎症尚不清楚。此外，明确NCF1在MASH中的致病功能由哪种细胞类型介导，对于开发靶向疗法具有重要的临床意义。

与MASH相关的一个主要细胞通路涉及铁稳态。铁作为人体必需微量元素，参与多种生物过程。然而，铁沉积可诱导铁死亡，这是一种以脂质过氧化为特征的铁依赖性细胞死亡。KCs是铁储存细胞，表达多种铁相关基因。越来越多的报道表明，MASLD和MASH患者KCs铁沉积水平与更严重的MASH疾病和晚期纤维化相关。肝细胞是铁调素(hepcidin)的主要来源，铁调素通过结合铁转运蛋白(ferroportin, FPN，细胞表面唯一已知的铁外排通道)并促进FPN内化和降解（小编注：铁调素和FPN结合后，触发其构象变化使FPN的赖氨酸可通过E3泛素连接酶环指蛋白217进行泛素化，从而促进FPN内化降解，且抑制巨噬细胞铁释放和十二指肠铁吸收，平衡机体铁稳态），从而减少细胞(如巨噬细胞)的铁输出。在MASLD/MASH中，小鼠肝细胞中铁调素表达升高。此外，也有报道称铁调素在MASLD和MASH患者中升高，并与MASH严重程度相关。然而，在MASH期间，KCs的铁稳态是否与其自我更新能力受损相关尚不清楚。

该研究是发表在Cell Metabolism上的文章“Reactive oxygen species regulation by NCF1 governs ferroptosis susceptibility of Kupffer cells to MASH”探讨了NCF1在MASH发生发展中的致病性和细胞特异性作用，并且特别关注了NCF1对肝脏KCs中铁稳态的氧化还原调控。

拓展阅读

MASH过程中KCs的激活

在MASH过程中，机体会通过不同的途径激活KCs。首先，脂质的过度积累会破坏肠道内的微生物平衡，损害粘膜屏障功能，增加细胞膜通透性，从而导致内毒素的释放。这些内毒素随后与KCs上的Toll样受体(TLR2、TLR4、TLR5和TLR9)结合，触发炎症因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12)的产生。其次，KCs还可以识别和吸收衰老的红细胞，衰老红细胞通常可引起铁超载和溶酶体应激，导致肝内炎症和纤维化。另外，在饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的刺激下，KCs分别通过PPAR-γ和NF-κB信号通路产生不同的炎症因子以及M1、M2标记物。以上这些增殖且活化的KCs围绕脂肪变性的死亡肝细胞，形成典型的含有大量胆固醇晶体的冠状结构（小编注：此处的胆固醇结晶是来自肝细胞，由于脂肪变性最终会引起肝细胞死亡增加，KCs会包围在死亡的肝细胞周围，并吞噬这些死细胞产生的胆固醇晶体，最终转化形成含有脂质的泡沫细胞，形成肝脏典型冠状结构），并释放NLRP3炎症因子。此外，游离胆固醇诱导鞘磷脂合成(SMS1，介导饮食诱导的肝细胞焦亡)的表达，促进肝细胞中触发损伤相关分子模式(DAMPs)，从而激活KCs中的NLRP3炎症小体。

参考文献：

[1] Xu GX, et al. Front Cell Dev Biol. 2023 May 16;11:1199519.

敲黑板啦！ 

1.巨噬细胞中的NCF1通过抑制KCs的自我更新促进MASH的发展;

2.NCF1通过诱导OxPL促进铁调素分泌，导致KCs铁沉积和铁死亡；

3.铁死亡抑制剂及OxPL中和抗体可以缓解小鼠MASH的病理进程；

4.人类NCF1低功能性变体通过抑制KCs铁沉积和铁死亡缓解MASH。

研究结果

1. 巨噬细胞NCF1加重小鼠MASH

据集(GEO: GSE136103)，该数据集包含了健康和MASLD肝脏样本。NCF1主要在肝脏巨噬细胞、经典树突状细胞(cDCs)和浆细胞样树突状细胞(pDCs)（小编注：树突状细胞主要分为经典型树突状细胞（cDCs）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）和单核细胞样炎症树突状细胞（MoDCs）。其中，cDCs和pDCs属于淋巴系DC，其前体是浆细胞样干细胞，与T细胞、NK细胞同源。cDCs又可以分为cDC1和cDC2，cDC1主要负责将抗原呈递给CD8⁺T细胞（也称为细胞毒性T细胞），cDC2主要负责CD4⁺T细胞的活化。pDCs激活T细胞的能力低于cDCs，但是它可以促进I型IFN的产生。MoDCs主要促进炎症和T细胞反应，与cDC2很难完全区分开。DCs是一类特殊的免疫细胞，串联起了先天免疫和适应性免疫，而肝脏的DCs可以根据肝脏微环境变化转换为免疫原性表型，不同的亚型可能会具有不同的功能。比如XCR1+cDC1不但可以攻击肝实质细胞，还能和CD8⁺T细胞相互作用，发挥直接杀伤靶细胞的功能；另一种DC亚型——CD11c⁺DCs在不同的研究中有不同的效应，在MCD饮食或硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠中，CD11c⁺DCs会促进炎症因子的表达，但是在其他研究中也有数据表明CD11c⁺DCs在MCD饮食诱导的MASH纤维化中起到保护作用。因此，树突状细胞发挥的具体作用需要根据肝脏微环境的变化以及不同的亚型进行确定，目前还有待进一步探究），并且在MASLD中表达上调(图S1A–S1C)。根据标志基因表达谱，肝脏中的巨噬细胞可进一步分为3个主要亚群，包括KCs、MoMCs和瘢痕相关巨噬细胞(SAMacs)（小编注：本文没有具体写出以上三个亚群的marker，但是文献单细胞数据中使用的以上三个亚群的marker分别是，KC：Clec4f，Tim4，Cd163，Timd2等；MoMCs ：yve1，Macro，CD11b等；SAMacs：Trem2，CD9等。本文流式分析使用的marker：KCs为CD45⁺ CD68⁺ ，F4/80⁺，Tim4⁺，CD11blow。MoMCs 为CD45^+ ，CD68⁺，F4/80⁺，Tim4-CD11bhigh）。与健康肝脏相比，NCF1表达在人类MASLD肝脏的KCs中的表达上调最为显著(图S1D和S1E)。

随后，研究人员通过流式细胞术测定了蛋氨酸/胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的MASH小鼠肝脏不同细胞群中NCF1的表达。研究人员发现NCF1在KC、MoMCs和树突状细胞中显著上调，但在中性粒细胞和CD45−细胞中则无变化(图1A)。为了确定巨噬细胞NCF1是否参与MASH的发病机制，研究人员使用了一种Ncf1*(Ncf1^m1j/m1j)小鼠品系(该品系因剪接位点发生点突变导致NCF1蛋白表达减少且ROS反应无法检测) (小编注：该小鼠主要在外显子8上游2个碱基处的剪接位点处进行A到C的点突变，将剪接位点CGA变为CCG。m1j即为mutant 1, Jackson)和一种在CD68⁺巨噬细胞中特异性表达NCF1的Ncf1突变小鼠品系(称为Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68) （小编注：首先从cDNA中扩增出Ncf1的编码序列，然后将其连接到包含人类CD68启动子、两侧含有内含子以及polyA位点的剪接信号以及剪接位点的载体上，随后去除细菌的基因组DNA，将这段转基因序列引入B10.Q小鼠中，将转入小鼠和Ncf1 mutant B10.Q小鼠杂交（也就是

Ncf1*），从而产生（也称为B10Q.Ncf1^m1j/m1j.MN⁺）。将野生型(WT)小鼠、Ncf1*小鼠和Ncf1∗.Ncf1Tg-CD68小鼠饲喂MCD饲料6周以诱导MASH。结果显示，Ncf1*小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平比WT小鼠更低，而Ncf1∗.Ncf1Tg-CD68小鼠ALT和AST水平相较于Ncf1∗小鼠则较高(图1B)。肝脏切片的组织学检查显示，Ncf1*.Ncf1Tg-CD68小鼠出现明显的脂肪性肝炎，其特征为脂肪变性、气球样变性和小叶炎症。而在Ncf1*小鼠中仅观察到轻微的脂肪变性、气球样变性和小叶炎症(图1C和1D)。与Ncf1∗小鼠相比，油红O染色进一步证实了Ncf1*.Ncf1Tg-CD68小鼠肝脏脂肪变性增加(图1C和1E)。通过F4/80巨噬细胞免疫染色则表明，与Ncf1*小鼠相比较，Ncf1*.Ncf1Tg-CD68小鼠的肝脏中冠状结构增加；并且TUNEL染色显示Ncf1*.Ncf1Tg-CD68小鼠阳性区域增加，表明巨噬细胞NCF1过表达具有促进肝损伤的作用(图1C和1G)。此外，肝脏天狼星红染色也显示巨噬细胞NCF1过表达加重了肝纤维化(图1C和1H)。值得注意的是，与WT小鼠相比，Ncf1*小鼠的脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和纤维化均显著减轻，而在CD68+巨噬细胞中过表达NCF1(也就是在Ncf1∗.Ncf1Tg-CD68小鼠中)反而加重了这些表型。 

      随后，研究人员利用高脂饮食(HFD)模型进一步验证巨噬细胞NCF1对疾病表型的影响。通过血清ALT(图1I)、苏木精-伊红(H&E)染色(图1J和1K)、油红O染色(图1J和1L)、F4/80染色(图1J和1M)和天狼星红染色(图1J和1N)等指标的结果显示，与WT小鼠相比，饲喂了22周HFD饮食的Ncf1∗小鼠肝脏脂肪变性、肝细胞损伤、炎症以及肝纤维化均改善。而Ncf1*.Ncf1Tg-CD68小鼠与Ncf1∗小鼠相比则表现出更严重的疾病程度(图1I–1N)，表明巨噬细胞过表达NCF1加剧了HFD诱导的MASLD疾病。 

此外，研究人员使用了另一个小鼠品系(称为Ncf1*.Ncf1^Ki-Lyz，其在Lyz+髓系细胞中特异性表达Ncf1基因)进一步证实了巨噬细胞NCF1在脂肪性肝炎中的作用。研究人员发现，髓系细胞过表达NCF1增强了MASH表型，包括脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和纤维化，这在MCD喂养的Ncf1*.Ncf1^Ki-Ly小鼠同样存在(图S2A–S2G)。（小编注：Lyz和cd68都是标记髓系巨噬细胞）

 为了研究树突状细胞NCF1是否参与MASH的发展，研究人员使用了一个仅在CD11c⁺树突状细胞中表达NCF1的小鼠品系(Ncf1^∗.Ncf1^Ki-CD11c小鼠) (小编注：CD11c是树突状细胞的经典标志，在大多数的DC亚型中均表达，树突状细胞和骨髓来源巨噬细虽然都起源于骨髓造血干细胞（HSCs），但属于不同的免疫细胞谱系，具有独特的发育路径、表面标记和功能)。结果显示，MCD饮食喂养6周的Ncf1^∗.Ncf1^Ki-CD11c小鼠与其Ncf1^∗同窝对照小鼠具有相似的MASH表型(图S2H–S2M)。综上所述，这些结果表明NCF1通过巨噬细胞而非树突状细胞促进MASH进展。

2. 巨噬细胞NCF1引发MASH中KCs的铁沉积和铁死亡

为阐明NCF1调控小鼠MASH的具体机制，研究人员对WT小鼠、Ncf1^∗小鼠和Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68小鼠分离的肝脏细胞群进行了流式细胞术分析。结果显示，MCD饮食降低了WT小鼠中KCs的比例，而MoMCs比例相应增加(图2A)。值得注意的是，与WT小鼠相比，Ncf1^∗小鼠KCs比例的降低和MoMCs比例的增加均得到缓解；而与Ncf1^∗小鼠相比， Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68小鼠表现出KCs比例的进一步降低和肝脏中MoMCs浸润的加剧(图2A)；并且中性粒细胞或树突状细胞(DCs)的数量不受NCF1表达的影响(图S3A)。此外，HFD喂养22周后，WT小鼠中也出现了KCs比例降低和MoMCs比例增加的情况。同样地，这种情况在Ncf1∗小鼠中得到缓解。而与Ncf1^∗小鼠相比，HFD喂养的Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68小鼠表现出KCs比例的进一步降低和肝脏中MoMCs浸润的加剧(图S3B)。这些结果表明，在MCD和HFD诱导的MASH中，巨噬细胞NCF1均改变了常驻KCs的稳态并促进了炎症性MoMCs的浸润。 

 常驻KCs的死亡被认为是启动MASH炎症的关键，其可能导致炎症性MoMCs的扩增。KCs通过摄取衰老和应激的红细胞来维持肝脏铁稳态，然而在MASH病理条件下，一旦超过阈值，KCs就会发生铁沉积（小编注：MASH情况下体内氧化应激水平升高，损伤红细胞膜和内部结构，会加速红细胞的衰老，因此衰老红细胞会增多，KCs不仅要吞噬衰老红细胞维持铁稳态，还会吞噬死亡肝细胞产生的胆固醇晶体等）。基于这些发现，研究人员探讨了由巨噬细胞NCF1调控的KCs死亡是否与铁失衡有关。因此，研究人员通过流式细胞术检测了MCD喂养的WT小鼠、Ncf1^∗小鼠和Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68小鼠KCs中的铁水平，使用Phen Green SK (PGSK)探针(一种用于检测活细胞内亚铁的膜通透性探针)作为胞质不稳定铁池(LIP)的指示剂(小编注：Phen Green SK探针进入细胞后，可被细胞内的酯酶水解，释放出具有荧光的Phen Green SK。当Phen Green SK与细胞内的金属离子(如 Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺ 等)结合时，荧光会被猝灭。通过流式细胞术或荧光显微镜检测荧光强度的变化，可以反映细胞内金属离子的水平。通常在铁死亡的研究中，胞质不稳定铁池中亚铁离子变化比较显著，因此默认认为Phen Green SK荧光变化反应细胞内亚铁离子动态，但是这里不能排除其他2价金属离子），其荧光强度与LIP水平呈负相关。同时，研究人员还通过流式细胞术检测了铁蛋白(一种主要的细胞铁储存蛋白复合物，由铁蛋白重链(FTH)和铁蛋白轻链(FTL)组成)的丰度，以确定KCs中的铁水平。结果显示，在MCD饮食后，WT小鼠的KCs铁沉积增加，主要表现为PGSK平均荧光强度(MFI)降低以及KCs中FTH和FTL水平升高(图2B-2D)。然而，与普通饮食组相比，MCD喂养的WT小鼠中，MoMCs的LIP水平降低，表现为PGSK MFI升高和FTH水平降低(图2B和2C)。这些结果表明，MASH中发生铁沉积的是KCs而非MoMCs。此外，与WT小鼠的KCs相比，Ncf1^∗小鼠的KCs铁水平较低，表现为PGSK MFI更高，FTH和FTL水平更低；与Ncf1^∗ MASH小鼠相比，Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68 MASH小鼠的KCs中铁沉积增加，证实了巨噬细胞NCF1在KC铁沉积中的作用(图2B–2D)。由于铁沉积参与铁死亡，研究人员使用C11-BODIPY^581/591探针(也是铁死亡的标志物)检测了KCs中的脂质过氧化(脂质ROS)水平(小编注：C11-BODIPY^581/591在还原状态下发出红色荧光，在氧化状态下荧光会转变为绿色。该探针具有良好的亲脂性，能够快速融入细胞膜中，用于检测膜脂质的过氧化水平)。巨噬细胞过表达NCF1增加了KCs中的脂质过氧化(图2E)。此外，MASH也引发了MoMCs中的脂质过氧化，但其程度远低于MCD诱导的MASH模型中KCs的脂质过氧化水平(图2E)。与MCD饮食类似，HFD也在WT和Ncf1^∗.Ncf1^Tg-CD68小鼠中诱导了KCs铁沉积和脂质过氧化，而在Ncf1∗小鼠中这些现象则有所减轻(图S3C和S3D)。 

为进一步阐明不同MASH动物模型中KCs铁死亡的发生情况，研究人员重新分析了AMLN饮食(GEO: GSE129516)和西方饮食(GEO: GSE156059)诱导的MASH小鼠肝脏的scRNA数据集，并评估了KCs和MoMCs中铁死亡相关基因的表达差异。热图分析显示，与正常小鼠相比，AMLN诱导的MASH小鼠的KCs(而非MoMCs)中铁死亡相关基因的表达更高(图S4A和S4B)。通过分析UCell模块构建的KCs和MoMCs铁死亡评分(小编注：UCell是专为单细胞测序数据分析而设计的工具，核心功能是进行细胞特征评估)，发现与对照组小鼠相比，AMLN诱导的MASH小鼠的KCs表现出更高的铁死亡评分(图S4C)。同样，对WD诱导的MASH小鼠的scRNA数据集的分析进一步证实了KC铁死亡在MASH疾病中的高发生率(图S4D-S4F)。 

为了更明确地阐明KC表达的NCF1在MASH中的具体作用，研究人员从Ncf1*小鼠中分离出KCs，并将其过继性转移(adoptively transferred)到MCD喂养的巨噬细胞缺失Ncf1*小鼠体内(图2F)(小编注：过继性转移是一种生物治疗方法，指的是通过输注免疫细胞或免疫分子，将一个接触过抗原的个体(供体)所具有的免疫反应性被动地转移给未被免疫的个体)。结果显示，与未接受KCs转移的小鼠以及接受NCF1缺陷KCs(来自Ncf1*小鼠)转移的小鼠相比，接受WT KCs转移的小鼠表现出血清ALT水平升高(图2G)，通过H&E染色和油红O染色表明脂肪性肝炎加重(图2H–2J)，通过F4/80免疫染色表明巨噬细胞浸润增加(图2H和2K)。然而，在三组小鼠之间，天狼星红染色结果未见显著差异(图2H和2L)。这些发现共同证实了KC NCF1在MASH进展中起着关键作用。另外，研究人员还通过油红O染色和脂肪生成相关基因mRNA水平的检测研究了KC NCF1在体外对肝细胞脂肪变性的影响。棕榈酸(PA)诱导了WT 小鼠KCs中NCF1表达的升高，但在Ncf1* KCs中则无此现象(图S5A)。将正常WT小鼠的原代肝细胞与PA刺激的WT KCs条件培养基（CMs）共孵育时，相较于未接受CM刺激的肝细胞或与Ncf1* KCs的 CM共孵育的肝细胞，其脂质蓄积现象显著加剧 (图S5B–S5D)。

 综上所述，研究人员得出结论，巨噬细胞的NCF1（小编注：此处指KCs）促进了MASH中常驻KCs的铁沉积和铁死亡。

3. NCF1加重MASH疾病是由于KC铁死亡

为明确KC铁死亡在MASH中的发生率，并进一步确认KC铁死亡对KC命运及MASH进展的影响，研究人员使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1 (Fer-1) 处理MCD饮食的WT和Ncf1*小鼠。血清ALT水平(图3A)、H&E染色(图3B和3C)、油红O染色(图3B和3D)和F4/80巨噬细胞免疫染色(图3B和3E)的结果显示Fer-1减轻了MCD喂养的WT小鼠的脂肪变性、肝细胞损伤和肝脏炎症。然而，在用Fer-1处理和未用Fer-1处理的WT小鼠之间，天狼星红染色结果没有显著差异(图3B和3F)。相比之下，Fer-1对MCD饮食的Ncf1*小鼠的MASH表型没有影响(图3A–3F)。此外，Fer-1减少了WT MASH小鼠KC的铁沉积，表现为PGSK MFI水平的升高(图3G)和FTH蛋白水平降低(图3H))，并且减轻了KC的脂质过氧化(图3I)，更重要的是，阻止了KCs的细胞死亡和MoMCs的浸润(图3J)。然而，Fer-1并不影响Ncf1*小鼠中KCs的上述现象，也未改变KC的命运和MoMCs浸润(图3G–3J)。以上结果进一步证实了铁沉积和脂质过氧化在KC命运及MASH疾病中的作用，同时也验证了NCF1对此过程的调控作用。

4. NCF1通过调控干细胞中TLR4依赖性铁调素的表达诱导KC铁沉积

接下来研究人员尝试阐明NCF1如何诱导KCs中的铁沉积。鉴于铁调素是肝脏(主要由肝细胞)合成的一种重要铁调节激素，且先前研究表明MASH伴随铁调素水平的升高，于是研究人员检测了MASH模型肝脏中的铁调素表达水平。只有WT和Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠在MCD饮食后肝脏中铁调素表达水平升高，而Ncf1*小鼠中铁调素表达水平低于WT和Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠(图4A和4B)。此外，肝细胞中铁调素表达的增加证实了在MCD饮食和HFD饮食诱导的MASH模型中巨噬细胞NCF1对肝细胞生成铁调素的调控作用(图4C–4E)。以上结果表明，巨噬细胞中NCF1的表达诱导了肝细胞铁调素的产生。 

为了进一步明确NCF1在脂质过载环境中(在MASH肝脏中)调控KCs的铁稳态是否依赖于肝细胞，研究人员在体外建立了一个共培养系统。首先，研究人员从WT和Ncf1*小鼠中分离出KCs，并用棕榈酸(PA)孵育(图4F)。显然，经PA处理的KCs其不稳定铁池(LIP)水平未发生变化，表现为PGSK MFI无变化(图4G)。此外，PA也不能诱导KCs中铁调素的表达(图4H)。接下来，研究人员从WT小鼠中获取原代肝细胞，并用经PA处理的WT和Ncf1*小鼠KCs的条件培养基(CMs)孵育(图4I)。研究人员发现直接用PA刺激的肝细胞不能增加铁调素，但当用WT KCs的CMs孵育的肝细胞却能产生高水平的铁调素(图4J)。值得注意的是，经PA处理的WT KCs的CMs比Ncf1* KCs的CMs更能诱导肝细胞产生铁调素(图4J)。研究人员还通过ELISA检测了肝细胞上清液中的铁调素水平，结果与其mRNA水平一致(图4K)。这些结果再次证实了KC NCF1调控肝细胞产生铁调素（小编注：FPN是定位于细胞膜的上唯一已知的铁外排通道，负责将细胞质中的铁转运至细胞外（血液）；而Lipocalin-2 (LCN2)，也称为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），是一种25 kDa的分泌型糖蛋白，属于脂质运载蛋白超家族，能够转运铁、类固醇、游离脂肪酸、前列腺素和激素等多种物质，在细胞中它能够螯合铁，因为本身是一种分泌型蛋白所以能够携带多种物质到细胞外环境中，同时它能够在细胞外结合铁，通过细胞表面LCN2相应的受体而被内吞到细胞内） 。

为了验证肝细胞铁调素对KC铁沉积的重要性，研究人员按上述方法，用肝细胞的上清孵育新分离的WT KCs(图4L)。经WT KC CMs处理的肝细胞的上清液促进了新分离的KCs中LIP水平升高(图4M)。并且经Ncf1*KC CMs处理的肝细胞诱导产生的铁调素水平较低，因此其上清处理降低了新分离的KCs中的LIP水平(图4M)。铁转运蛋白(FPN)是细胞表面的铁输出蛋白，可被铁调素直接结合后内化并降解。KCs中FPN表达水平结果进一步证实，NCF1调控KC铁沉积依赖于KC-肝细胞的相互作用，尤其是铁调素-FPN轴(图4N)。 

先前研究表明肝细胞铁调素的表达可通过Toll样受体(TLR)4通路诱导。为了验证TLR4是否为肝细胞响应经PA处理的KCs后产生铁调素所必需，研究人员在上述共培养体系中使用了来自Tlr4突变(Tlr4*)小鼠和WT小鼠的原代肝细胞(图4O)。结果发现，TLR4缺陷的肝细胞无法响应用PA处理的KCs的CMs而增加铁调素mRNA表达(图4O)。相应地，当用PA处理的KCs的CMs处理过的Tlr4*肝细胞的上清孵育时，由于Tlr4*肝细胞产生的铁调素水平低，新分离的KCs未表现出铁沉积，这证明了TLR4在铁调素产生中不可或缺的作用(图4P)。 综上，这些数据表明，NCF1通过调节肝细胞中TLR4依赖性的铁调素表达来促进KC的铁沉积。

拓展阅读

铁调素-铁转运蛋白系统

铁调素（Hepcidin）主要在肝脏中的肝细胞产生，其他组织（如脂肪组织、肾脏、心脏）中也有少量表达。铁调素是一种由25个氨基酸紧密折叠的肽类激素，通过4个二硫键稳定形成简单的发夹结构，其N末端结构域与FPN相互作用，是组织铁摄取和释放的关键调节因子。它受铁供应、机体造血需求和炎症状态的调节，在铁过载和炎症状态下表达增加，在缺铁和缺氧状态下表达减少。 BMP6-HJV-SMAD信号通路在铁调素调节和铁稳态中起主要作用。体内铁水平的增加会导致骨形态发生蛋白6（BMP6）的产生。BMP6与其受体BMPR I和II复合体结合 SMAD1/5/8磷酸化。磷酸化复合物与SMAD4结合形成SAMDs复合物。该复合物易位到细胞核，与BMP反应元件（BMP-Res）结合，促进铁调素基因HAM的转录。BMP辅助受体血黄素（HJV）是BMP6的共受体（共受体是一种受体，可以帮助另外一个受体完成他的功能），通过与BMP6配体结合，招募BMPR形成复合物，大幅提升BMP6-SMAD信号的灵敏度。 JAK-STAT通路是调控铁调素表达的关键炎症信号途径，与经典的BMP6-HJV-SMAD信号通路共同构成铁代谢的"双轨调控系统"。在感染或炎症状态下，巨噬细胞释放白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子，IL-6通过结合肝细胞膜受体（IL-6R/gp130）激活JAK1激酶。JAK1通过磷酸化STAT3促进STAT3二聚化入核。STAT3通过结合HAMP基因启动子中的STAT响应元件（SRE）快速诱导铁调素的转录和表达。

Ferroportin（FPN，又称SLC40A1）是溶质载体家族（SLC）的一员，主要负责铁从细胞输出到血浆的跨膜蛋白。在结构上，FPN由两个6跨膜螺旋束（N叶和C叶）组成，由细胞质环连接，C端和N端均位于细胞质中，N叶和C叶各有一个二价金属结合位点。当铁调素与FPN细胞外环上的结构域结合后，FPN发生构象改变，暴露其胞内域的磷酸化位点，同时激活与FPN关联的JAK2激酶，导致FPN胞内域的酪氨酸残基（如Tyr302/303）磷酸化。磷酸化的FPN被E3泛素连接酶（如RNF217）识别，并在其胞内域添加泛素链，标记其用于内化，在细胞内FPN通过溶酶体途径或者泛素-蛋白酶体途径降解。总之，过量的铁会诱导铁调素浓度增加，从而导致FPN蛋白的内化和降解，同时细胞内铁通过与细胞内的铁蛋白结合，共同调节铁血浆水平和铁的组织分布。

参考文献：

[1]Nemeth E, Ganz T. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6493. Published 2021 Jun 17. 

[2]Rochette L, et al.  Pharmacol Ther. 2015;146:35-52.

拓展阅读

Toll样受体(TLR)4信号轴在肝细胞中调节铁调素的表达

TLR4作为关键信号受体起重要作用，跨膜蛋白分子和靶向肝脏的物质通过TLR4相关信号通路发挥治疗作用。toll 样受体(TLR)通常为由三个功能结构域构成I 型(单通道)跨膜糖蛋白。富含亮氨酸的重复结构域(LRR 结构域)称为胞外结构域，是一种识别配体，由24-29个氨基酸构成的19-25个串联重复组成，这些氨基酸折叠成链和螺旋，由环连接。该结构域也存在于细胞质和跨膜蛋白中，负责识别损伤相关分子模式 (DAMP) 以及病原体相关分子模式(PAMP)。含有α螺旋的跨膜结构域负责TLR的膜锚定。C端细胞内toll/白细胞介素-1 受体(TIR)结构域对细胞信号转导有重大影响。细胞外结构域通过配体的相互作用而成为同源或异二聚体，这导致TIR结构域二聚化。各种桥接蛋白被募集到 TIR 结构域，并在结合后启动相应的信号通路。髓样分化因子 88 (MyD88) 是大多数 TLRs 亚型的下游转导。MyD88 通过调节核因子-B(NF-κB)信号传导来启动炎性细胞因子表达的增加，这导致炎症介质的过度释放，从而对生物体造成炎症损伤。 已知铁调素表达由炎症分子(如脂多糖 (LPS))通过巨噬细胞介导的途径诱导。同时有研究表明 LPS 可以通过TLR4激活直接诱导肝细胞表达和铁调素的分泌，并且MyD88 信号传导是通过TLR4诱导铁调素所必需的。MyD88 依赖性下游信号分子(白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)显著增加铁调素启动子活性，它们激活 c-Jun N 末端激酶(JNK) 和激活蛋白-1 (AP-1)。磷酸化的c-Jun和AP-1进一步占据铁调素启动子，增强铁调素的表达。铁是绝大多数病原体（细菌、真菌、寄生虫）增殖的必需元素，降低循环铁浓度可阻断病原体铁获取途径。当机体受到LPS等刺激时，Toll样受体TLR4被激活，促进巨噬细胞释放IL-6/TNF-α，IL-6通过激活肝细胞IL-6R/gp130，促进JAK1磷酸化STAT3，促使STAT3二聚体入核并结合HAMP基因启动子，促进铁调素的合成。

参考文献：

[1] Tang YL, et al. Pathol Res Pract. 2023;244:154410. 

[2] Lee YS, et al. Exp Mol Med. 2017;49(12):e408. 

[3] Rochette L, et al.  Pharmacol Ther. 2015;146:35-52.

5. TLR4缺乏可减轻MASH中NCF1介导的KC铁死亡

随后研究人员在体内研究了TLR4在MASH中的作用，特别是其在NCF1介导的KC铁死亡中的作用。研究人员使用了同窝WT小鼠、Ncf1* 小鼠、Tlr4*小鼠和Ncf*Tlr4*双突变小鼠，并用MCD饲料喂养6周。与WT同窝小鼠相比，Ncf1*小鼠和Tlr4*小鼠均表现出脂肪性肝炎改善，如血清ALT水平降低(图5A)，H&E染色(图5B和5C)、油红O染色(图5B和5D)、F4/80染色(图5B和5E)、天狼星红染色(图5B和5F)结果改善。与Ncf1*小鼠相比，Ncf1*Tlr4*双突变小鼠在血清ALT水平，H&E染色、油红O染色中表现出更轻的疾病程度(图5A-5D)。但在F4/80染色和天狼星红染色结果中，双突变小鼠与 Ncf1*小鼠之间没有显著差异(图5B，5E和5F)。此外，与Ncf1*小鼠相比，双突变小鼠的常驻KCs增多和MoMCs浸润减轻(图5G)，肝细胞铁调素表达水平降低(图5H)，KCs中铁和脂质ROS水平降低(图5I和5J)。总之，这些结果表明TLR4和NCF1都参与了肝细胞的铁调素产生和KCs的铁沉积，从而参与MASH进展。

6. NCF1氧化KC来源的OxPL诱导肝细胞产生TLR4依赖的铁调素

含有氧化脂肪酸残基的磷脂(OxPLs)可作为TLR4的内源性配体在巨噬细胞中触发炎症。据报道，巨噬细胞中OxPLs的形成是由NCF1衍生的活性氧(ROS)诱导的。因此，研究人员假设OxPLs是巨噬细胞-肝细胞对话的信使，介导肝细胞产生铁调素。为进一步确认NCF1是否参与OxPL的形成，研究人员在MASH模型中通过流式细胞术检测了KCs和MoMCs的OxPL水平。MCD饮食诱导了WT小鼠和Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠的KCs和MoMCs中OxPLs的增加。值得注意的是，KCs产生的OxPLs水平远高于MoMCs，表明与MoMCs相比，KCs可能是OxPLs的主要细胞来源。相比之下，Ncf1*小鼠KCs和MoMCs中的OxPL水平显著低于WT小鼠和Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠(图6A)。通过ELISA检测了MCD饮食的WT、Ncf1*和 Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠血清中OxPL水平。Ncf1*小鼠血清中的OxPL水平低于WT小鼠，而Ncf1*.Ncf1^Tg-CD68小鼠的OxPL水平高于Ncf1*小鼠(图S6A)，表明在MASH中OxPLs与巨噬细胞NCF1之间具有很强的相关性。巨噬细胞NCF1对KCs和MoMCs中OxPL水平的调控也在HFD诱导的疾病模型中得到证实(图6B)。

 为进一步验证由NCF1诱导的ROS来源的OxPLs是KC-肝细胞对话的的信使，并介导肝细胞产生铁调素，研究人员检测了用PA处理的WT和Ncf1*小鼠原代KCs中的ROS水平和OxPL水平。使用二氢乙锭(DHE)探针和荧光红染料(Amplex red)监测KCs中的ROS水平，结果发现PA刺激可诱导WT KCs的ROS水平升高，但无法诱导Ncf1* KCs的ROS水平升高(图6C和6D)。同时PA刺激能够诱导WT KCs产生比Ncf1* KCs更高水平的OxPLs(图6E和S6B)。这些结果表明，NCF1介导的ROS产生增加了脂质负载KCs中的OxPL水平。 

为阐明KCs产生的OxPLs是否参与诱导肝细胞铁调素产生，研究人员在共培养实验中使用了能结合并中和OxPLs的E06抗体(图6F)。与同型对照抗体相比，E06抗体的确降低了PA处理的WT KCs的CMs中的OxPL水平(图6F)。用上述PA处理的KCs的CMs孵育肝细胞后，与添加同型对照抗体相比，添加E06抗体的肝细胞表现出更低的铁调素水平(图6G和6H)。此外，当用肝细胞上清孵育新分离的KCs时，因E06处理使铁调素水平降低，导致新分离的KCs中的铁沉积减少(图6I)。这些数据表明，巨噬细胞NCF1通过诱导高ROS介导的OxPLs产生来促进肝细胞的铁调素表达。 

为进一步研究OxPLs在调节肝细胞铁调素中的作用是否也参与MASH疾病，研究人员将E06抗体或同型对照抗体注射给MCD饮食的WT小鼠。与饲喂相同饮食但接受同型对照抗体处理的小鼠相比，接受E06抗体处理的小鼠表现出减轻脂肪性肝炎(图6J–6O)。此外，与同型对照抗体相比，E06抗体确实降低了MASH小鼠KCs中的OxPL水平(图6P)，更重要的是，它降低了肝细胞中铁调素的表达(图6Q和6R)，并进一步减少了KCs中的铁沉积(图6S和6T)和脂质过氧化(图6U)。相应地，在MCD饮食的小鼠中，使用E06抗体治疗后，小鼠的KCs增多及MoMCs浸润的缓解 (图6V)。

总之，以上结果表明，在MASH疾病进展中由NCF1介导的高ROS调控的OxPL/铁调素轴，触发KC铁沉积和铁死亡，并促进了MoMCs的浸润。

7. 铁死亡与人类MASH有关，人类多态性等位基因NCF1^90H通过保护KC免受铁死亡而缓解MASH

为深入阐明KC铁死亡在人类MASLD/MASH中的发生率，研究人员分析了人类肝脏单细胞RNA测序(scRNA)数据集(GEO: GSE136103，包含健康和MASLD肝脏样本)中肝脏巨噬细胞内铁死亡相关基因的表达差异。热图分析显示，与健康对照组相比，MASLD个体的KCs中铁死亡相关基因的表达更高。相比之下， MoMCs和SAMacs中这些基因的表达略有上升(图S7A)。此外，与健康个体相比，MASLD个体的KCs表现出更高的铁死亡评分(图S7B)。随后，研究人员通过免疫荧光检测了22名MASH患者和6名正常对照者肝脏切片KCs中FTH和FTL的水平。与正常对照组相比，MASH患者KCs中FTH和FTL的水平均显著升高(图7A和7B)。这些观察结果表明，KC铁沉积和铁死亡参与了人类MASH的发生。 

NCF1 rs201802880单核苷酸多态性(SNP)导致人类NCF1蛋白第90位的精氨酸被组氨酸取代，从而促进系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病。为研究人类rs201802880 SNP在MASH中的潜在功能，通过在B10Q小鼠中表达NCF1^90H等位基因构建出具有人SNP的小鼠（小编注：B10Q（C57BL/10QHa）和C57BL/6（B6）都是常用的近交系实验小鼠，遗传背景相似（均属于C57BL家族），但B10Q在免疫反应的研究中更有优势，其具有免疫应答强、巨噬细胞功能稳定等特点）。将Ncf1^R90/90H杂合子小鼠和Ncf1^90H/90H纯合子同窝小鼠用MCD饲料喂养6周。与Ncf1^R90/90H杂合子小鼠相比，Ncf1^90H/90H小鼠肝脏损伤减轻，表现为更低的血清ALT水平(图7C)。肝脏切片的组织学检查表明，低功能的90H突变体改善了脂肪变性和小叶炎症，尽管气球样变评分在两组小鼠之间没有显著差异(图7D和7E)。油红O染色进一步证实，与Ncf1^R90/90H杂合子小鼠相比，Ncf1^90H/90H小鼠的肝脏脂肪变性减轻(图7D和7F)。相应地，在Ncf1^90H/90H小鼠肝脏中，通过F4/80免疫染色观察到的冠状结构较少，支持其肝脏炎症减轻(图7D和7G)。此外，与Ncf1^R90/90H小鼠相比，Ncf1^90H/90H小鼠的TUNEL染色和天狼星红染色阳性区域减少(图7D, 7H和7I)。这些结果表明，低功能的90H等位基因可保护小鼠免受MASH进展的影响。

 随后，研究人员利用这些人源化小鼠在MASH模型中也评估了KC群体及其相关的铁水平和铁死亡情况。Ncf1^90H/90H小鼠表现出肝脏KCs增多和MoMCs浸润减少(图7J)，其KCs中的LIP水平和脂质ROS水平均降低(图7K和7L)。此外，Ncf1^90H/90H小鼠中血清OxPL水平降低(图7M)和肝细胞铁调素表达减少(图7N)，进一步证实了NCF1通过OxPL/铁调素轴促进KC铁沉积的机制。

总结 

KCs自我更新受损导致MASH过程中的炎症反应加剧。本研究中，研究人员发现，中性粒细胞胞质因子1(NCF1)是KCs铁稳态的关键调控因子。NCF1在人类MASLD患者的肝脏巨噬细胞和树突状细胞中表达上调，在MASH小鼠模型中也观察到同样现象。巨噬细胞来源的NCF1(而非树突状细胞来源的NCF1)会触发KC铁过载、铁死亡以及单核细胞来源巨噬细胞(MoMCs)的浸润，从而加剧MASH进展。从机制上讲，巨噬细胞NCF1诱导升高的氧化磷脂(OxPLs)促进Toll样受体4(TLR4)依赖的肝细胞铁调素产生，导致KC铁沉积增加并引发后续的KC铁死亡。重要的是，人类低功能多态性变体NCF1^90H在小鼠模型中能够减轻KC铁死亡和MASH。总之，巨噬细胞NCF1通过氧化磷脂破坏KC铁稳态，触发肝细胞释放铁调素并导致KC铁死亡，从而驱动MASH。突显了NCF1作为改善KC命运、遏制MASH进展的潜在治疗靶点。MASH的特征包括肝脏脂肪变性并伴随炎症、氧化应激、线粒体功能障碍，KC铁沉积能够促进ROS的产生，导致肝脏脂质过氧化，并且铁超载能够促进炎症因子的释放，加剧肝损伤，以及加重纤维化。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124001840?via%3Dihub#app2