代谢学人

Science: 中年发福的真相

撰文 | 陈芳芳 胡敏 张俊 武霞 马莹 郭明伟

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张俊

背景介绍

从中年开始，一直到老龄化初期（40~65岁），人体内的脂肪通常会积累（白色脂肪组织（WAT）），尤其是在内脏区域。与此同时，骨骼肌的质量也会逐渐下降。即使是在个体保持相同的体重指数的情况下，这种与年龄相关的肌肉流失和WAT的积累也会改变身体成分，导致肌少性肥胖，从而加速了与年龄相关的代谢紊乱。具体来说，内脏肥胖被认为会通过促进胰岛素抵抗、心血管功能障碍和许多其他慢性疾病来加速衰老，从而缩短健康寿命。人们对与年龄相关的内脏脂肪组织（vWAT，visceral WAT）积累的细胞和分子机制知之甚少。

WAT调节多种激素和新陈代谢过程，并具有组成和表型可塑性。随着老年人能量消耗的减少以及组织功能和代谢的整体改变，这些因素可能导致WAT的重塑。WAT通过脂肪细胞肥大（细胞增大）或脂肪生成（新脂肪细胞的产生）而积累。小鼠模型可在体追踪脂肪生成情况，并显示年轻成年小鼠的脂肪生成率非常低，与年轻成年人类相似（小编注：和本文类似，在Vishvanath L,2016这篇文章研究人员利用小鼠脂肪细胞的追踪系统，对小鼠APCs或者成熟脂肪细胞进行标记，研究标记时间之后新生脂肪的占比。研究人员发现给8周龄年轻小鼠喂食NCD4周之后，小鼠的脂肪生成率5%-10%左右，提示相对于刺激条件低，例如HFD，冷暴露等刺激，正常饮食以及常温条件下相比小鼠脂肪生产率较低，本篇文章中图1A和B显示年轻成年小鼠的成脂率甚至更低）。已知脂肪细胞在衰老过程中会发生肥大，但尚不清楚WAT是否也通过脂肪生成而积累。

WAT基质内的脂肪细胞祖细胞（Adipocyte progenitor cells，APCs）是间充质干细胞的一个异质性群体，包括脂肪细胞干细胞和定向祖细胞。脂肪生成包括两个步骤：APCs的增殖和APCs向成熟脂肪细胞的分化。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可确定小鼠和人类APCs的异质性，揭示各种病理生理条件下新的亚型和动态变化。

研究人员使用阴性和阳性谱系示踪系统追踪体内脂肪的生成，发现中年小鼠的WAT是通过活跃的脂肪生成而扩张的。随后，研究人员应用scRNA-seq，试图找出在这一生命阶段特别富集的APC群体，随后进行功能评估，以验证所确定群体的特征。

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              敲黑板啦！

1. 小鼠年龄相关的WAT积累模拟了人类与年龄相关的肥胖；

2. 在中年期间，WAT的脂肪生成增加；

3. 中年时期出现了一个独特的APCs群体-CP-As；

4. LIFR-STAT3轴是CP-A成脂分化所必需的。

​研究结果

1 .小鼠体内与年龄相关的WAT积累模拟了人类与年龄相关的肥胖

随着小鼠进入中年期，雌雄小鼠体重均逐渐增加，且雄鼠体重增长幅度远高于雌鼠（图S1，A~C），这与人类相似。由于雄鼠比雌鼠体重增加更多，研究人员在本研究中重点关注雄鼠。雄鼠与年龄相关的体重增加主要归因于WAT的增加。脂肪占总质量的百分比增加了6倍以上（图S1D），而瘦肉的百分比则下降了23%（图S1E）。身体总水分百分比也随年龄增长而下降（图S1F）。在两种脂肪库中，性腺脂肪库（gWAT，gonadal WAT）是典型的vWAT类型，其质量随年龄的增长最为显著（4.6倍）（图S1G），而皮下脂肪库（sWAT，subcutaneous WAT）在12月龄时增加了2.8倍（图S1H）。这些中年小鼠表现出耗氧量降低（图S1I），体力活动略有减少（图S1J），能量消耗减少（图S1K）。并且这些小鼠的总运动量没有明显变化（图S1L），但食物摄食量减少（图S1M）。耗氧量和能量消耗的下降表明，与人类相似，中年小鼠的基础代谢水平显著降低。腹腔内葡萄糖耐量实验（图S1N）和胰岛素耐量实验（图S1O）表明，中年小鼠糖耐量受损，胰岛素抵抗更为严重。因此，小鼠表现出与年龄相关的内脏积累，同时伴有能量消耗减少和胰岛素抵抗，这与人类中与年龄相关的肥胖症相似。

图S1 | 雄性小鼠在中年时表现出显著的脂肪增加和代谢率降低

2 .中年时期WAT的脂肪生成增加

为了更好地了解脂肪细胞的动态，研究人员开发了AdipoChaser小鼠用于跟踪脂肪的生成。该小鼠模型使用基于多西环素（dox）的四环素反应性调节元件（tetO）标记系统来诱导、永久标记脂联素（Adipoq）表达的细胞，这些细胞代表成熟的脂肪细胞（图S2A）。使用AdipoChaser-loxp-mTomato-stop-loxp-GFP（mTmG）小鼠，多西环素可以在任何时候引入，用绿色荧光蛋白（GFP）标记所有成熟的脂肪细胞，而在追踪期间（停用多西环素后）产生的新脂肪细胞不会被标记。无论荧光标记如何，所有成熟的脂肪细胞都可被肉眼识别为围脂滴蛋白（perilipin）-阳性细胞，因为围脂滴蛋白包裹脂滴，并反映脂肪细胞的单细胞形态。为了确定与年龄相关的脂肪堆积是否伴随着脂肪生成，研究人员标记了3月龄雄性AdipoChaser-mTmG小鼠中的所有脂肪细胞，并随着小鼠年龄的增长追踪脂肪的生成（图S2B）。与研究人员之前的研究一致，在6月龄小鼠中，他们在gWAT中观察到非常少的新生脂肪细胞（即perilipin⁺ GFP^-细胞），表明在年轻成体中脂肪细胞的更替率极低（图1A和B）。在9月大的小鼠中，新生的GFP^-脂肪细胞占总perilipin⁺ 细胞的比例为68.05%（图1A和B）。12月大的小鼠生成的脂肪细胞更多，82.33%的脂肪细胞是新形成的（图1A和B）。在12月大时，小鼠脂肪细胞体积也增大，证实了脂肪细胞肥大（图1C和D）。然而，在每个时间点，原有脂肪细胞（GFP⁺脂肪细胞）的大小与所有perilipin⁺脂肪细胞的平均大小没有差异（图1E）。

为了分析新生成的脂肪细胞和原有的脂肪细胞是否不同，研究人员使用单核RNA测序（snRNA-seq）来分析12个月大的AdipoChaser-mTmG小鼠gWAT中纯化的脂肪细胞的转录组，其中原有的脂肪细胞在3个月大时被标记为GFP⁺细胞。将原有的脂肪细胞（GFP⁺脂肪细胞）与后期产生的脂肪细胞（GFP^-脂肪细胞）进行比较。测序数据分析结果显示，在与糖代谢或胰岛素敏感性相关通路的表达上，原有的脂肪细胞和新生脂肪细胞之间没有明显的差异。然而，基因集富集分析（GSEA，gene set enrichment analysis ）显示，衰老通路在原有的脂肪细胞中上调（图S2C）。

为了进一步确认中年小鼠的内脏脂肪形成，研究人员还获得了血小板衍生生长因子受体α（Pdgfra，platelet-derived growth factor receptor alpha）-rtTA小鼠系，并产生了PdgfraChaser-mTmG小鼠（图S2D），用于标记和追踪PDGFRa⁺的血管周膜细胞，这是一种间充质祖细胞标记物，并标记（大部分）APCs。研究人员用多西环素处理了3月大的雄性PdgfraChaser-mTmG小鼠，并对这些PDGFRa⁺细胞的脂肪生成进行了长达9个月的追踪（图S2E）。在3月大的PdgfraChaser-mTmG小鼠中，gWAT没有标记成熟脂肪细胞（图1F和G）。当标记6个月和9个月后，即小鼠9个月和12个月大时，gWAT中发现大量GFP⁺脂肪细胞（图1F）（小编注：前面Adipochser在小鼠三月龄是标记了所有的成熟脂肪细胞，也就是三月龄小鼠已有的成熟脂肪细胞都是GFP阳性，新生的则是GFP阴性。而这里PdgfraChaser是在小鼠三月龄标记了APCs细胞，在三月龄时小鼠的脂肪祖细胞都是GFP阳性，所以后面新生的脂肪细胞也是GFP阳性）。定量结果显示，9月和12月大小鼠的成脂率与AdipoChaser小鼠相似（图1G）。这些结果表明，在这一阶段新形成的大多数脂肪细胞来源于Pdgfra⁺ APCs。因此，阴性和阳性示踪实验均表明中年小鼠gWAT中APCs分化为脂肪细胞的能力增强。这种脂肪生成可能表明脂肪细胞的周转增加。事实上，研究人员在12月大的小鼠gWAT中观察到巨噬细胞在缺乏perilipin的死亡脂肪细胞周围形成冠状结构（图S2F）。年轻小鼠则没有这种结构。因此，在这一生命阶段，脂肪细胞的死亡与脂肪生成同时发生。

图1 | 在中年小鼠中，脂肪生成增加，并与内脏脂肪含量相关

图S2 | 用于脂肪生成谱系追踪的小鼠模型，预先存在的脂肪细胞具有衰老的分子特征，以及中年雄性小鼠gWAT中巨噬细胞浸润的分子特征

3 . 老龄小鼠的细胞自主性APCs在体内具有很高的脂肪生成能力

研究人员想知道与年龄相关的脂肪生成是由APCs的细胞内在机制还是老化环境系统刺激的。据报道，与其他细胞类型相比，APCs在移植到小鼠体内后免疫原性较低，不易发生排斥反应。因此，研究人员通过移植的方法，检测年轻和中年雄性小鼠gWAT来源的APCs在体内的脂肪生成能力。从基质血管成分（SVF，stromal vascular fraction）中分离出谱系阴性（Lin^-，lineage-negative）的APCs细胞，其中免疫细胞（CD45⁺）、内皮细胞（CD31⁺）和红细胞（Ter119⁺，erythrocytes）已被去除。从2.5月龄雄性CAG-EGFP小鼠（GFP⁺）和12月龄雄性Rosa26-loxp-mTomatostop-loxp-GFP（Rosa26-mTmG）小鼠（Tomato⁺）gWAT中分离出的等量APCs混合在一起（Rosa26是一个在小鼠中组成型、普遍存在的基因表达位点）（小编注：CAG是一种强效的杂合启动子，由鸡β-actin基因的启动子、巨细胞病毒（CMV）早期增强子和兔β-globin内含子组成，其能够驱动基因在多种哺乳动物细胞中实现强大且稳定的实时表达，几乎适用于所有类型的细胞和组织。ROSA26位点位于小鼠第6号染色体上，是一个高度保守的非编码基因区域，具有广泛的表达特性。此外，由于ROSA26位点是一个基因间区，不会破坏宿主基因组中的关键功能基因，因此降低了插入突变的风险）。将细胞混合液重悬于Matrigel 中，然后移植到2.5月大的雄性野生型（WT）小鼠的sWAT中（图2A）。1个月后解剖移植小鼠，12月大小鼠（Tomato⁺）的APCs比2.5月大小鼠（GFP⁺）的APCs分化率更高（图2B和movie S1），产生的脂肪细胞多2.5倍（~450个对~180个脂肪细胞）（图2C）。这些GFP⁺和Tomato⁺的脂肪细胞具有相似的细胞大小（图2C），似乎是成熟的脂肪细胞，因为它们具有单细胞形态（单个脂滴）（图S3A）并表达perilipin（图S3B）。

为了排除是因为两个小鼠品系不同而造成的脂肪生成率不同，研究人员还进行了相反的实验，将2.5月大的Rosa26-mTmG小鼠（Tomato⁺）的gWAT 中的APCs和12月大的CAG-EGFP小鼠（GFP⁺）的APCs混合移植（图2D）。同样，12月大小鼠的APCs在移植4周后的脂肪生成率（2.5倍）高于2.5月大的小鼠的APCs（图2E和F，以及movie S2）。

研究人员通过移植18月龄Rosa26-mTmG小鼠和2.5月龄CAG-EGFP小鼠gWAT来源的APCs，探索老年小鼠APCs的成脂潜能。无论是与12月龄（图2C和F）还是18月龄（图S3C和D）来源的APCs混合，2.5月龄小鼠APCs分化的脂肪细胞数量（~200个）相似。然而，与2.5月龄小鼠的APCs相比，18月龄小鼠的APCs分化成的脂肪细胞（约40个）更少，表明APC成脂潜能的增加具有高度的年龄依赖性，仅发生在中年时期，而不是老年小鼠。事实上，小鼠的体重在18个月左右达到高峰，然后随着年龄的增长而逐渐下降。

研究人员为了进一步证实在中年小鼠中的观察，他们将来自2.5和12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠gWAT的等量Tomato⁺ APCs移植到同样2.5月龄雄性WT小鼠的sWAT两侧（图S4A）。移植4周后，12月龄小鼠的APCs的脂肪生成率更高（3倍）（图S4B，C和movie S4，S5）。因此，来自中年小鼠的gWAT的APCs在移植到年轻环境后仍保持了很高的成脂潜能。

为了测试与年龄相关的微环境是否足以触发APC脂肪发生，研究人员将年轻小鼠的APCs移植到中年小鼠体内。将来自2.5月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠gWAT的Tomato⁺ APCs等量移植到2.5月龄和12月龄雄性WT小鼠sWAT中（图S4D）。移植4周后，年轻和年老受体小鼠的年轻APCs成脂率相似（图S4E，F和movie S6，S7）。同样，当将来自年轻CAG-EGFP小鼠的GFP⁺APCs移植到12和2.5月龄的雄性WT小鼠时（图S4G），年轻APCs的成脂率在移植的时间范围内没有统计学上的显著增加（图S4H和I，以及movie S8和S9）。当然，随着时间的推移，与年龄相关的系统刺激和组织环境极有可能对重塑的APCs中发挥重要作用。

图2 | 中年小鼠APCs的成脂率高

图S3 | 来自中年雄性小鼠的APC在体内表现出高成脂能力

图S4 | 中年微环境不促进年轻APC的脂肪生成

4 .年龄特异性的APC群体具有整体激活的脂肪生成程序

为了探究中年小鼠APCs成脂特性的分子机制，研究人员对2.5或12月龄小鼠gWAT来源的Lin^- SVF细胞（n=3/组）进行了scRNA-seq（图S5A）。APCs表达一系列间充质干细胞表面标志物，如PDGFRα/β、CD34、整合素β-1（CD29）和淋巴细胞抗原6家族成员A（ lymphocyte antigen，Ly6a、Sca-1）。在测序的19534个细胞中，根据Pdgfra，Cd34和Ly6a等经典APC的marker，15194个细胞（占总细胞数量的78%）被鉴定为祖细胞（图S5B~E）。虽然同组小鼠之间的差异极小（（图S5F、G）），但在年轻和中年细胞之间的转录组变化很大（图S5H）。

结合2.5和12月龄小鼠的APCs，研究人员根据基因表达模式的相似性进行无监督Louvain聚类分析，确定了5个细胞亚群，并基于转录组谱图的非线性降维，使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）对细胞亚群进行可视化处理（图3A）。基于已经发表的WAT APCs的scRNA-seq分析，研究人员将这些细胞亚群命名为：（i）脂肪干细胞（ASC，adipocyte stem cell），（ii）中间脂肪细胞祖细胞（IAP，intermediate adipocyte progenitor），（iii）定向脂肪前体细胞1（CP-1，committed preadipocyte 1 ），（iv）定向脂肪前体细胞2（CP-2，committed preadipocyte 2 ）和（v）依赖于年龄富集的定向脂肪前体细胞（CP-A，committed preadipocyte, age-enriched）。

由于两个年龄组的细胞几乎没有重叠，所以祖细胞群根据年龄发生了重塑。利用Slingshot轨迹分析，研究人员揭示了这些APC亚群之间潜在的谱系关系。在2.5月龄小鼠的APC中，ASC有两种发育轨迹，均通过IAP，并以CP-1和CP-2（图3D和图S5I）的轨迹发育。在12月龄小鼠的APC中，ASC有一个独特的发育轨迹，即以CP-A的轨迹发育。研究人员对每个细胞群的百分比进行量化后发现，CP-As在12月龄小鼠中高度富集，而CP-1群体在12月龄小鼠中有所减少（图3E）。这些结果表明，在这个年龄阶段，可能建立了一个从ASC到CP-A的新的脂肪生成谱系。

研究人员根据转录本丰度预测的分化状态，使用Cyto TRACE分析对这些APC细胞亚群进行了排序（图3F，图S5J和K）。从干细胞到定向前体细胞，这些集群的排列顺序为ASC、CP-2、IAP、CP-1和CP-A。在每个细胞亚群中，2.5月龄小鼠的APCs始终比12月龄小鼠的APCs更具有干细胞样特性。在所有细胞亚群中，12月龄小鼠的CP-A亚群被确定为最可能定向分化的APC（小编注：CytoTRACE 是一种基于转录组数据推测细胞分化状态的工具，其核心原理是：越未分化的细胞，其转录本多样性越高（即表达的基因种类越多）。相反，越定向分化的细胞，其转录本多样性越低。CytoTRACE会基于每个细胞的转录本数量和表达水平，计算一个干性评分，并据此将细胞从“最未分化”到“最定向分化”排序。文章中CytoTRACE的排序结果从干细胞到定向前体细胞，这些集群的排列顺序为ASC、CP-2、IAP、CP-1和CP-A，即APC从未分化到定向分化的顺序，CP-A被排在最末位，意味着在这些APC亚群中，它最可能定向分化。）。间充质祖细胞标志物Pdgfra在所有细胞亚群中普遍表达（图3G），但每个亚群也表现出不同的标志物（图S5L）。ASC亚群表达Cd55、Pi16（编码肽酶抑制剂16）和Dpp4（(编码二肽基肽酶 4）（图3H，图S5L和M）；IAP亚群表达常见的脂肪细胞祖细胞标志物（如Pdgfra）和中等水平的ASC标记物以及定向的前体脂肪细胞标志物（图S5L）；CP-1群表达Apoe（编码载脂蛋白E）、Igf1（编码胰岛素样生长因子1）和C7（编码补体成分7）（图3I，图S5L）；CP-2簇表达Mfap4（编码微纤丝相关蛋白4）、Cilp（编码软骨中间层蛋白）、Mgp（编码基质Gla蛋白）和CD9（图3J，图S5L）。CP-A群表达Lifr（小编注：Leukemia Inhibitory Factor Receptor是白血病抑制因子受体，是一种I类细胞因子受体，可与 LIF 配体结合并与 gp130 形成复合物，从而激活 JAK/STAT、MAPK 等信号通路。在脂肪组织中，Lifr 的表达代表细胞已经发生分化趋向改变，偏向特定命运。）和Thbs1（编码血小板反应蛋白-1）（图3K，图S5L和N）。

研究人员通过FACS分离了Lin^- PDGFRa⁺ LIFR^high APCs细胞亚群（小编注：从12月龄小鼠中分离出来的。这里分选是为了确认 CP-A 表型，文章发现 CP-A 细胞首次在 9月龄小鼠中检测到，在12月龄时显著增多），并测定了LIFR^high APCs、LIFR^low APCs和成熟脂肪细胞中编码CP-A标志物的mRNA的丰度。qPCR证实LIFR^high APCs中Thbs1、Lifr、Ccl11（编码C-C基序趋化因子配体11）、Spry1（编码芽期RTK信号拮抗剂1）和Hsd11b1（编码羟基类固醇11-β脱氢酶1）高表达（图S6A）。在这些标志基因中，Lifr、Ccl11和Hsd11b1也在成熟脂肪细胞中高表达，而Thbs1和Spry1只在APCs中选择性表达。Thbs1和Lifr在Lin^- PDGFRa⁺ LIFR^low APC中也表达（水平较低），表明基于LIFR的分选不是分离CP-As的理想方法。事实上，由于Lifr在CP-As中高度表达，但并非唯一表达（图3K），因此FACS富集的LIFR^high细胞中可能含有非CP-A APCs。为了更好地标记和富集CP-As，研究人员通过在Thbs1启动子下插入了膜定位的GFP序列，从而生成Thbs1-mGFP小鼠细胞系（图S6B）。研究人员对不同年龄小鼠gWAT 中PDGFRa⁺ APCs的GFP信号进行流式分析，结果表明只有在9月龄时才能检测到CP-A细胞（小编注：Lifr 虽然在 CP-A 中高表达，但它同时也在成熟脂肪细胞中表达，并且在其他 APCs 中也有低表达。因此 FACS 分选 LIFR^high 并不能保证只获得 CP-As，会有杂质细胞。Thbs1 则不同，它不在成熟脂肪细胞中表达，因此具有更高的特异性）（占总PDGFRα⁺APCs的6.32%），而在12月龄的小鼠中CP-As比例突然上升（34.23%）（图3L，图S6C）。CP-As的比例在小鼠18月龄时下降（1.81%），这可能解释了这一年龄段的APCs的成脂能力较低（图S3C、D）。在sWAT中，9月龄和12月龄小鼠CP-As的小幅度升高，但并无统计学意义（图3L，图S6C）。

为了验证中年小鼠体内ASCs的命运，研究人员将来自2.5或12月龄雄性mTmG小鼠的Tomato⁺原代ASCs（Lin^-PDGFRa⁺DPP4⁺）移植到年轻的WT受体中，并在移植3天后解剖（图S6D）。流式细胞术分析显示，来自12月龄小鼠gWAT中的约80%的移植ASCs高表达LIFR（CP-As），证实了12月龄小鼠中ASCs到CP-A的转变轨迹。相比之下，只有13.7%的年轻小鼠ASCs转化为LIFR高表达细胞（图3M，图S6E）。这些结果表明，中年小鼠ASCs确实是CP-As的祖细胞，且中年小鼠ASCs对CP-As定向率很高。

为了分析APCs基因组中染色质的可及性，研究人员进行了大量的ATAC-seq（利用高通量测序分析转座酶的染色质可及性）。2.5月龄组的4个样品中的3个样品和12月龄组的4个样品都很好地聚在一起（图S7A、B），而整体染色质可及性模式（PC1）的最大变异可由样品之间的年龄差异来解释（小编注：研究人员将ATAC-seq数据（染色质开放程度）进行主成分分析（PCA），以提取其主要变异方向（如PC1、PC2等），发现PC1代表了数据中最大的变异来源（占50%以上）。随后观察样本分布情况发现，2.5月龄和12月龄的小鼠样本在PC1上明显分开（图S7A、B），而同龄样本聚在一起。这说明年龄差异是导致染色质开放模式变化的最主要因素，远超过其他因素（如个体差异或实验误差）。总而言之，PCA显示样本在PC1上的分布完全按年龄明显分开，且PC1是最大变异来源，因此年龄是染色质开放差异的主要因素）。染色质开放发生了全局性的改变，其中许多发生在启动子区域（图S7C）。有趣的是，研究人员观察到Adipoq启动子区染色质开放明显增加，这证实12月龄小鼠gWAT中脂肪生成增加（图S7D）。Lifr基因的染色质开放也增加，表明一些APC可能在中年（CP-As的生成）开始激活Lifr的表达（图S7E）。

研究人员根据已发表的小鼠APC亚群组中显著富集的标记基因列表，计算了每个APC亚群组中的基因模块得分，从而将他们自己的细胞亚群与已发表的小鼠APC亚群进行了比较。本文中的ASC细胞亚群与之前发现的ASC亚群高度重叠。并且研究人员发现的ASC、IAP、CP-1和CP-2细胞亚群与之前定义的APC亚群有相似之处（图S8）。研究人员没有发现sWAT特异性细胞亚群标志物的高表达，如年龄依赖性调节细胞（ARCs），这表明ARC是sWAT特异性的（图S8I和J）。尽管有相似之处，但他们的研究确定CP-A细胞亚群是一个具有不同分子特征的年龄和脂肪库特异性富集的群体。

图3 | scRNA-seq分析鉴定了小鼠年龄特异性前脂肪细胞群（CP-A）

图S5 | 中年轻雄性小鼠gWAT中Lin- SVFs的scRNA-seq

图S6 | Thbs1-mGFP小鼠的生成和FACS策略

图S7 | 批量ATAC-seq比较2.5个月和12个月大雄性小鼠gWAT的APC

图S8 | 基于顶部标志物的APC亚簇与先前确定的APC种群的比较

5 .人类vWAT表现出与年龄相关的APC重塑的相似模式

为了评估这些发现的转化意义，研究人员用scRNA-seq检测了人类是否也具有相同的CP-A亚群。研究人员从人胰腺周围WAT（pWAT）分离出SVFs，并排除了免疫细胞（CD45⁺）、内皮细胞（CD31⁺）和红细胞（CD235a⁺）来富集lin^-APCs，并将其用于scRNA-seq（5例人体标本）。在测序的24794个细胞中，20431个细胞（占总细胞数量的82%）被鉴定为祖细胞（图S9A）。基因表达谱的无监督聚类分析将这些APC分为8个细胞群（Hu0~Hu7）（图4A）。为了将小鼠的APC亚群与人类的细胞亚群进行比较，研究人员计算了ASC和CP-A基因模块得分，作为小鼠标记基因的总和（图4B）。Hu0，2，3和6亚群富集到了小鼠ASC标志物，而Hu1，5和7亚群富集到小鼠CP-A标志物（图4B）。因此，在人的pWAT中既能发现小鼠ASC-样细胞。也能发现CP-A-样细胞。所有祖细胞均高表达APC标记物PDGFRA（图4C）和PDGFRB（图S9B）。与小鼠ASC相似，人细胞亚群高表达ASC的标记物CD55和PI16（图4D和图S9C）。与小鼠CP-A类似的人类细胞亚群表达CP-A标志物——LIFR（图4E），并且中度表达PPARG（编码过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、FABP4（编码脂肪酸结合蛋白4）（图S9D和E）。与皮下储存库中的人类APC细胞亚群相比（女性受试者年龄范围：35~71岁），研究所得的人类ASC亚群与hASPC2亚群重叠，CP-A亚群与hASPC3和hASPC4亚群（图S9F和G）重叠。接下来，研究人员使用流式细胞术分析了不同年龄组人pWATs中所有APCs中CP-As（LIFR^high细胞）的百分比，研究人员分离了6名男性供者的SVFs，并通过流式细胞术分析了APCs（Lin^-PDGFRa⁺细胞）（图S10A）。研究人员发现CP-As在男性人群中的丰度随着年龄增长而增加[图4F，图S10B；Pearson相关系数（r）=0.8206，p=0.0454]。因此，人类pWAT中的APCs从中年到老年早期可能会经历类似的重塑，而人类CP-As可能会导致与年龄相关的肥胖。

研究人员检测了CP-As在人pWAT中的定位。LIFR在其他细胞类型中也有表达，包括免疫细胞，因此研究人员同时对LIFR和CD29标记APCs的进行染色。在年轻成人中，很少有细胞同时被LIFR和CD29染色（图4G）。在衰老早期的人类中，同时表达LIFR和CD29的CP-As细胞分布在成熟脂肪细胞之间的整个组织中。

图4 | 早期衰老过程中人vWAT中CP-As的富集

图S9 | 人APCs的单细胞RNA-seq分析

图S10 | 人pWAT中CP-As的流式细胞术分析

6 .CP-As在体外和体内均具有较高的增殖和成脂率

对小鼠scRNA-seq数据进行通路分析表明，与2.5月龄小鼠相比，12月龄小鼠ASCs中富集了转化生长因子-β（TGF-β，transforming growth factor–β）和有丝分裂信号转导的增殖相关信号（图5A和表S1）。由于CP-As只在老年小鼠中富集，因此研究人员对CP-As中富集的通路进行了分析，发现了成脂通路（图5B和表S2）。分析表明，中年小鼠内脏脂肪组织来源的ASCs和CP-As的增殖能力可能增强，并且CP-As的成脂能力可能也增强。

研究人员在体外对APCs的增殖和分化能力进行了表征。研究人员使用3D培养系统来评估脂肪生成能力（图5C）。将富集的APCs（来自3月龄和12月龄小鼠gWATs）与Matrigel混合，并在生长培养基培养72小时。然后加入经典的成脂混合液，将这些细胞分化为脂肪细胞。从相同数量的细胞开始，12月龄小鼠的APC增殖成的细胞数量与2.5月龄小鼠的APC数量相似（图S11A，B）。两组APCs的成脂率（Bodipy⁺脂肪细胞占Tomato⁺细胞的百分比）相似，均接近100%（图S11B）。与移植实验中的差异不同，两个年龄组的APC在体外表现相似。这两个年龄组之间相似的成脂率可能是由于添加成脂混合液前的生长时间较长，这可能会减小APCs的差异（图2）。研究人员意识到，在3D培养体系中，APCs在成脂前不需要生长几天就可以达到汇合状态。因此，他们将脂肪生成前的培养时间缩短到16小时，以最大限度地保留APC在体内的特征（图S11C、D）。事实上，12月龄小鼠的APCs具有相似的成脂率，但增殖率明显更高，因为Tomato⁺细胞总数是2.5月龄小鼠APCs的2倍多（图S11D）。当在接种16小时后添加成脂混合液时，qPCR验证了在分化过程中成熟脂肪细胞特异性基因的mRNA增加，（图S11E）。因此，3D培养体系部分模拟了体内年轻和中年APCs之间的差异。

鉴于通路分析的结果，研究人员探究了CP-As是否具有更强的增殖和分化能力。研究人员富集了单个APC亚群，并在体外测试了它们的增殖和成脂能力。为了尽量减少对细胞的应激，研究人员使用磁激活细胞分选（MACS，magnetic-activated cell sorting）技术，从2.5和12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠gWAT中新鲜分离的SVFs中富集APCs（Lin^-，CD31^-CD45^-Ter119^-）。为了富集ASCs，研究人员从APCs中分离出DPP4⁺细胞群。通过流式分析验证了DPP4⁺和DPP4^-亚群（图S11F）。为了富集CP-1s和CP-As，研究人员通过去除APCs中的ASCs（DPP4⁺）、CP-2s（CD9⁺）和IAPs（CD9⁺）来进行负选择。经过验证，富集的群体在流式分析中显示出低比例的DPP4和CD9表达以及高比例的LIFR表达（图 S11，G 和 H）。12月龄雄性小鼠的gWAT中有更多的DPP4⁺APCs从CD9^-细胞转变为CD9⁺细胞，这表明12月龄小鼠ASCs中有一定量的细胞可能已经沿着IAPs的轨迹启动了脂肪生成程序（图S11I）。这也验证了Cyto TRACE分所展示的，12个月的ASCs比2.5个月的ASCs分化程度更高（图3F）。12月龄小鼠ASCs的成脂率与2.5月龄小鼠ASCs相似，但其总细胞数和脂肪细胞数显著高于2.5月龄小鼠的ASCs，这表明他们的增殖率更高（图5D和E）。由于年轻小鼠中的数量极少，研究人员无法从年轻小鼠中分离到CP-As。此外根据scRNA-seq结果，CP-1s与CP-As分子相似性最高，研究人员还将CP-As与来自年轻小鼠的CP-1s进行了比较。有趣的是，与CP-1s相比，CP-As不仅增殖率高出4倍多，而且脂肪生成率也最高（图5F和G）。因此，CP-As在体外具有较强的增殖和分化能力。

研究人员检测了体内APC亚群的增殖率。研究人员用5-乙炔基2'-脱氧尿苷（EdU）处理2.5和12月龄WT雄性小鼠。EdU掺入2小时后，流式细胞术分析表明，来自12月龄小鼠gWAT的ASCs中约有1%为EdU⁺，而2.5月龄小鼠的ASCs中仅有0.3%为EdU⁺（图6A，图S11J）。CP-As中约有4%为EdU⁺，而2.5月龄小鼠的CP-1s仅有1%为EdU⁺（图6A，图S11J）。这些结果表明CP-As在体内具有较高的增殖率。

研究人员富集了APC亚群，并检测了它们在体内的成脂能力。从2.5和12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠gWAT新鲜分离的SVFs中收集大量的DPP4^-APCs（不包括ASCs）、CP-1s和CP-As，并将这些不同年龄段的富集群体等量移植到雄性WT小鼠的sWAT对侧（图6B）。与2.5个月的DPP4⁻APC相比，12个月DPP4⁻APC的体积大幅增大（图6C和D，movie S10和S11）。CP-As的脂肪细胞数量是CP-1s的5倍（图6E和F，以及movie S12和S13），这表明CP-A在体内具有较强的增殖和分化能力。

图5 | CP-A在体外具有高度增殖和成脂性

图6 | CP-A在体内具有高度增殖和成脂性

图S11 | 富集APC种群和APCs的体外3D培养

7.LIFR-STAT3轴是CP-A成脂分化所必需的

LIFR是小鼠和人类共有的高级CP-A标志物之一，因此研究人员探究了LIFR在CP-As中的功能。LIFR在细胞增殖、分化和存活中具有重要作用。然而，LIFR在APCs中的作用尚不清楚。研究人员用LIFR抑制剂EC359和成脂混合液处理从12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠体内分离出来的用3D培养Tomato⁺原代CP-As。LIFR抑制剂阻断了这些原代CP-As的脂肪生成，而总细胞数没有显着下降（图S12A和B）。由于LIFR在年轻APCs中并不完全缺失，研究人员在分化过程中同时用EC359处理CP-1s（来自2.5月龄小鼠）和CP-As（来自12月龄小鼠）。EC359阻断CP-As的成脂分化，但不阻断CP-1s的脂肪生成（图7A和B）。这些结果表明，LIFR信号通路是CP-A成脂分化所必需的。

研究人员将从12月龄雄性CAG-EGFP小鼠分离的GFP⁺原代CP-As移植给受体小鼠，并用EC359处理小鼠发现，从GFP⁺APC分化的GFP⁺脂肪细胞数量仅为对照GFP⁺原代CP-As的一半（图7C和D，movie S14和S15）。研究人员利用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）敲低从12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠分离的Tomato⁺原代Lin^- SVFs中的Lifr（图S12C）。在诱导脂肪细胞分化末期时，Lifr敲低降低了APCs的细胞总数和脂肪生成率（图7E和F）。当研究人员移植经Lifr shRNA慢病毒转染的Tomato⁺原代Lin^- SVFs（从12月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠中分离）时，从Tomato⁺SVFs分化的Tomato+脂肪细胞数量仅为对照慢病毒处理的Tomato⁺ SVFs的1/3（图7G和H，movie S16和S17）。这些结果共同证实了LIFR信号促进CP-A脂肪的生成。

研究人员利用慢病毒在2.5月龄雄性Rosa26-mTmG小鼠分离的Tomato⁺原代Lin^-SVFs中过表达Lifr（图S12D）。诱导脂肪细胞分化后，过表达Lifr导致脂肪细胞和总细胞数量增加了一倍，而脂肪生成率没有变化（图7I和J）。当Lifr在GFP⁺原代Lin^-SVFs（从2.5月龄雄性CAG-EGFP小鼠中分离）中过表达时，与对照慢病毒转染的GFP⁺ 原代 Lin^- SVFs相比（图7K和L，movieS18和S19），由GFP⁺ 原代 Lin^- SVFs分化的GFP⁺脂肪细胞数量增加了一倍多。因此，增加年轻脂肪细胞中LIFR的表达足以促进脂肪生成。

通路富集分析显示CP-As中JAK-STAT3（Janus激酶-信号转导和转录激活因子3）通路上调（图5B）。LIFR磷酸化并激活STAT3，而STAT3是LIFR下游重要的效应分子。用LIFR抑制剂EC359处理CP-As有效地降低了STAT3的磷酸化（图S13A），验证了EC359是LIFR抑制剂。研究人员检测了STAT3是否为CP-A成脂分化所必需。用STAT3抑制剂Stattic和BBI608处理原代CP-As（图S13B）。这些处理显著降低了CP-As的成脂率，而没有改变总细胞数（图S13C和D）。因此，STAT3似乎是CP-As中高成脂能力所必需的。

研究人员检测了抑制LIFR的长期效应。从9月龄小鼠开始，他们使用LIFR抑制剂EC359处理小鼠10周。抑制LIFR可降低gWAT重量，但不影响sWAT重量（图7M和N）。全身给药对中年小鼠体重、糖耐量和胰岛素抵抗也几乎没有影响（图S14A~C）。作为对照，从3月龄开始接受相同处理的年轻小鼠在体重、gWAT重量或sWAT重量上均没有变化（图S14D~F）。这些结果表明LIFR是CP-As的功能性标记物。与年轻的APCs不同，CP-As的脂肪生成高度依赖于LIFR-STAT3信号轴。

图7 | CP-A脂肪生成的LIFR-STAT3信号传导要求

图S12 | 调控CP-As中LIFR活性和表达

图S13 | STAT3的激活是CP-A成脂分化所必需的

图S14 | 青中年雄性小鼠LIFR的慢性抑制

总结  

从中年开始，成年人往往会出现内脏肥胖过多和相关的不良代谢紊乱。小鼠的谱系示踪发现，内脏脂肪中的脂肪祖细胞（Adipose Progenitor Cells，APCs）在中年期间经历了广泛的脂肪生成。因此，尽管青壮年的脂肪细胞周转率很低，但脂肪生成在中年时期是被激活的。移植定量显示，中年小鼠APCs具有较高的细胞自主成脂能力。单细胞RNA测序发现，中年小鼠体内出现了一个独特的APC群体，即依赖于年龄富集的定向脂肪前体细胞（CP-A）。CP-As表现出更高的增殖和成脂活性。药理学和遗传学实验表明，LIFR信号通路对于CP-A成脂和内脏脂肪扩张是必不可少的。这些发现揭示了年龄依赖的脂肪重塑的基本机制，为与年龄相关的代谢性疾病提供了重要的见解。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adj0430IF: 44.7 Q1