撰文 | 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 仲银召 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

研究背景

在哺乳动物中，肝脏作为“代谢开关”，可在进食与禁食状态下协调葡萄糖和脂质代谢，以维持机体能量稳态。在进食状态下，肝脏可储存多余葡萄糖，以维持正常血糖水平。而在禁食期间，营养物质匮乏，白色脂肪组织（WAT）发生脂解释放游离脂肪酸，其中一部分游离脂肪酸被肝脏摄取并利用，为外周组织供能，将葡萄糖优先留给大脑利用。

冷暴露是一种能迅速引起肝脏脂质代谢重塑的应激压力，通过促进WAT脂解，并导致脂肪酸进入肝脏，诱发短暂性肝脏脂肪变性。而肝脏脂质处理能力的丧失则会导致机体冷不耐受（小编注：文献 Judith Simcox, et al. Cell Metab. 2017发现冷暴露下WAT脂解释放的FFA，激活肝脏核受体HNF4α，通过转录程序促进肝脏酰基肉碱的生成，通过血液循环转移到BAT中促进产热，而抑制WAT脂解或肝脏HNF4α敲除可导致小鼠冷不耐受。文献Jaimarie Sostre-Colón, et al. Cell Rep. 2021.发现在急性冷暴露期间，胰岛素水平升高，通过肝脏AKT-FOXO1轴增强WAT脂解，释放的FFA被肝脏摄取利用，导致肝源性酰基肉碱和富甘油三酯蛋白（TRL）的产生，促进BAT产热，肝脏AKT敲除小鼠冷耐受能力下降；总之，这些文献表明了冷暴露下肝脏脂质代谢水平在适应性产热中的重要性，阻断肝脏脂质代谢可损害机体冷耐受能力）。本文研究人员在前期研究中基于非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）确定了冷暴露下肝脏中发生变化的脂质代谢途径，发现肝脏中有超过200种脂质在冷暴露下发生了显著变化，包括酰基肉碱、甘油三酯、神经酰胺、磷脂等（小编注：前期研究（Raghav Jain , et al. J Lipid Res. 2022）利用脂质组学评估了各个组织对冷暴露下血浆脂质池的贡献。首先利用脂质组学鉴定出血浆中500多种脂质响应寒冷刺激，其中两种主要随着冷暴露而增加的脂类是ACars（酰基肉碱）和Cer（神经酰胺），为了确定其来源，研究人员对9种外周组织（BAT、iWAT、eWAT、腓肠肌、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺）进行脂质组学分析，发现腓肠肌、肠和肺没有表现出明显的冷诱导的脂质变化，心脏和肾脏表现出甘油三酯的轻微下降和ACars的轻微增加，而肝脏、BAT、肠道和肾脏可能参与了冷暴露下血浆中ACars水平的变化，进一步研究发现，肝脏和肾脏增加了ACars的产生，BAT和肠道主要吸收ACars，进而维持机体冷耐受水平）。此外，研究人员还注意到LC-MS分析中有94个光谱特征未被注释，但其在丰度上具有显著的温度依赖性差异。因此，研究人员在本项研究中阐明了这些特征的身份，并进一步探索了它们在肝脏代谢稳态中的作用。

在本篇文章中，研究人员通过对光谱特征碎片化的评估，确定其中一些光谱特征为双（单酰基甘油）磷酸（BMP）脂质，其含量在冷暴露后显著增加。进一步研究发现，冷暴露促进溶酶体向脂滴定位，并激活溶酶体和自噬调控因子TFEB。敲减TFEB可降低BMP脂质水平，并导致机体冷不耐受。机制上，TFEB通过调控溶酶体磷脂酶A2组XV（Pla2g15）来降解BMP脂质。这些发现揭示了肝脏在冷暴露中的关键脂质调控机制，并为代谢性疾病的治疗提供新的靶点。

敲黑板啦！

1.冷暴露导致肝脏BMP脂质积累

2.BMP脂质调节肝脏溶酶体功能和肝脏对寒冷的代谢适应

3.PLA2G15调控肝脏BMP脂质分解

4.PLA2G15的缺失导致BMP脂质增加、溶酶体脂质处理能力增强和能量消耗增加

研究结果

1.冷暴露期间小鼠肝脏中的溶酶体BMP脂质增加

为了鉴定新的调节肝脏燃料转换的脂质，研究人员在室温（RT；22℃-24℃）或冷暴露（4℃）环境下饲养小鼠6小时，并在实验过程中禁食。通过LC-MS的非靶向脂质组学鉴定肝脏脂质，共鉴定出712种脂质（图1A和图S1A），以及8000多个尚未注释的MS/MS谱图。为了在未注释谱图中寻找冷暴露下发挥重要作用的脂质，研究人员按以下特征进行筛选：（1）符合脂质的出峰时间（1.0-15min）；（2）质量在预期的脂质范围内（400-1500 m/z）；（小编注：在标准的C18反相色谱柱中，糖类由于极性较高，保留较弱，出峰时间通常较早，一般在1-3分钟内出峰。脂质种类较多，碳链越长或饱和度越高，疏水性越强，出峰时间就越晚，一般非极性脂质出峰时间通常大于10分钟。总体来说出峰时间含亲水基团的磷脂类<游离脂肪酸<甘油三酯＜胆固醇酯。对于质谱过程中的预期质量（m/z，质量电荷比），可能与物质本身的分子量、化学结构和离子化过程中的电离方式有关，目前看到的文献中游离脂肪酸的范围为200-320m/z；氨基酸范围有50-250m/z，140-280m/z，50-650m/z；8-30个氨基酸的多肽范围为400-1600m/z；蛋白质有1000-8000m/z，2000-25000m/z，3000-30000m/z；碳水化合物的范围有100-360m/z等）（3）至少存在于80%的样本中。最终筛选到1233个未注释谱图（图1B）。接下来，研究人员以假发现率（FDR）作为统计阈值（q<0.05），利用脂质分子产生的碎片模式，以及其在室温和冷暴露条件下的变化倍数进行进一步筛选（图1C）。与脂质数据库LIPIDMAPS中的信息进行比对，研究人员发现变化最显著的两个图谱均属于BMP脂质，这是一类溶酶体脂质（图S1B）。

为了验证这一发现，研究人员开发了一种靶向LC-MS方法来定量42种BMP脂质及其前体脂质磷脂酰甘油（PGs）。结果显示，在冷暴露期间，肝脏中有14种单独的BMP脂质显著增加，大多数含有必需脂肪酸，其中6种含有18:2酰基链（图1D和图S1C）。18:2脂肪酸是一种多不饱和脂肪酸，与膜流动性的增加有关，这可能意味着BMP脂质的功能发生了变化（小编注：BMP脂质的功能通常是指其能激活腔内囊泡 (ILV) 上的脂质分解代谢。具体而言，在溶酶体中，疏水性脂质和膜由亲水性酶降解。由于酶和底物分别定位在不同的相中，因此需要脂质结合和转移蛋白（如鞘脂活化蛋白Saps A-D和GM2活化蛋白），这些酶和活化蛋白在溶酶体酸性环境中带有正电荷。BMP存在于溶酶体内膜的表面（即降解发生的地方），带有负电荷，能增强上述带正电荷的酶和活化蛋白在溶酶体膜的粘附，从而促进了脂质分解。据报道，BMP酰基链中的多不饱和性能促进BMP脂质与溶酶体蛋白酶和脂肪酶相互作用，并且这可能是由膜流动性的增加介导的。因此这里研究人员发现冷暴露后含有多不饱和脂肪酸链的BMP脂质增加，可能有助于增加膜流动性，提示这可能促进BMP脂质与溶酶体蛋白酶和脂肪酶的相互作用，从而增强BMP脂质发挥介导脂质分解代谢的功能）。此外肝脏PGs没有发生变化（图S1D和图S1E）。有趣的是，在冷暴露期间，循环中的BMP（p < 0.05）和PG（p < 0.01）脂质显著减少（图S1F）。时间序列研究表明，冷暴露6小时时肝脏中BMP脂质的增加最显著（图1E），并且在冷暴露24小时BMP脂质水平仍是升高的（图1F和图S1G）。

BMP脂质是内溶酶体系统（包括溶酶体和内体）中腔内囊泡的结构成分，是溶酶体丰度的标志。据报道，BMP酰基链中的多不饱和性有助于BMP脂质与溶酶体蛋白酶和脂肪酶相互作用，能促进溶酶体腔内蛋白质和脂质的降解。在冷暴露期间，含有多不饱和脂肪酸的BMP脂质含量增加，这反映了溶酶体丰度的增加，或者提示溶酶体的功能发生了转变。

拓展阅读：BMP脂质合成过程

BMP脂质含有两个甘油分子，每个甘油分子的一个羟基连接一个磷酸基团。根据甘油分子上酰基团（即手性碳原子）的立体排列，BMP脂质主要分为三种立体化学构型：R,R-BMP、S,S-BMP和R,S-BMP。S,S-BMP是溶酶体BMP脂质的主要形式，溶酶体中的酸性环境使这种构型能稳定存在，可以保护BMP免受溶酶体酸磷脂酶的降解。

S,S-BMP的合成包含以下几个关键步骤：磷脂酰甘油（PG）的水解、酰基化反应和立体反转。首先在磷脂酶A（PLA）的作用下，起始物质PG（R,S）转化为溶血磷脂酰甘油（Lyso-PG（R,S）），与甘油分子相连的第二个脂肪酸被水解下来，成为游离脂肪酸（FFA）。接着Lyso-PG（R,S）在转酰基酶（CLN5或丝氨酸水解酶）的作用下，与酰基供体（Acyl donor）反应，生成BMP（R,S）。随后，通过溶酶体磷脂酶（Lysosomal lipases）的作用，BMP（R,S）进一步水解，转化为溶血磷脂酰甘油（Lyso-PG（S,R）），并生成一个游离脂肪酸。最后，磷脂酶PLD3或PLD4执行关键的立体反转，以Lyso-PG（S,R）和单酰甘油MAG作为底物，生成S,S构型的BMP。

[1] Singh S, et al. Cell vol. 2024.

[2] Amidon B, et al. Biochemistry. 1995.

图1.冷暴露期间小鼠肝脏中溶酶体BMP脂质增加

图S1.冷暴露期间，小鼠肝脏和循环中的BMP脂质发生改变

2.溶酶体在冷暴露期间定位于脂滴

为了探究冷暴露下BMP脂质的增加是否意味着溶酶体丰度的增加，研究人员通过电镜评估了肝切片中细胞器的丰度和定位（图2A）。结果显示，冷暴露下溶酶体数量没有变化，而脂滴数量和溶酶体与脂滴的共定位均增加（图2B），此外线粒体形态变长。研究人员还检测了溶酶体（LAMP1、LAMP2、RAB5和LIPA）和自噬（LC3-I和LC3-II）相关蛋白水平，发现LC3-II/-I和LAMP1在冷暴露下显著增加，而其他蛋白的水平不变（图2C）。此外，大部分溶酶体标记物的基因表达水平没有明显变化，只有Hexa和Atp6v1h在冷暴露下显著增加，而Lipa和Npc2则有所下降（图2D和图S2A）。

据报道，溶酶体可以分解神经酰胺和葡萄糖神经酰胺等复杂脂质，而葡萄糖神经酰胺酶的活性会随生理应激（如禁食和高脂饮食）发生变化。研究人员发现冷暴露导致肝脏溶酶体d18:1/24:1葡萄糖神经酰胺显著减少，并且d18:0/16:0、d18:0/24:1和d18:1/16:0葡萄糖神经酰胺也呈减少趋势，表明葡萄糖神经酰胺酶活性增加（图2E）。冷暴露促进溶酶体中BMP脂质水平（图S2G）。但是冷暴露不影响肝脏中组织蛋白酶B活性（组织蛋白酶B存在于溶酶体中，能参与多种蛋白质的降解）（图2F）。这些结果表明溶酶体发生功能变化，其脂质处理的功能增强。

由于肝脏中BMP脂质主要由肝细胞产生，于是研究人员在肝细胞（Hepa 1-6细胞）模型中进行探究。据报道，在冷暴露中，白色脂肪组织（WAT）产生的游离脂肪酸能调控肝细胞对冷暴露的反应，于是研究人员用β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316243（CL）处理WAT外植体以诱导脂解，然后用WAT外植体培养基处理Hepa 1-6细胞（图2G），发现CL处理的WAT外植体显著促进了Hepa 1-6细胞脂滴数量（图2H），这与肝脏中的结果相似（图2B）。同时CL组Hepa1-6细胞中溶酶体标志物（Lamp2）、脂滴标志物（Plin2和Plin3）和冷暴露相关线粒体标志物（Cpt1b）的基因表达水平上调（图2I），BMP脂质种类也显著增加（图2J）。这些结果表明，冷暴露下肝细胞能响应脂肪细胞脂解，介导肝脏溶酶体中的BMP脂质变化。

综上，冷暴露下肝脏中溶酶体在脂滴中的定位增加，溶酶体脂质处理功能增强。此外，肝细胞响应WAT脂解产生的游离脂肪酸，进而导致溶酶体BMP脂质变化。

图2.冷暴露诱导溶酶体定位发生改变

图S2.冷暴露诱导肝脏中溶酶体相关基因表达改变

3.冷暴露激活溶酶体调节因子TFEB

为了探究溶酶体功能和定位的调控机制，研究人员首先检测了肝脏中溶酶体生物发生及功能相关基因表达水平（图3A）。结果表明，冷暴露促进自噬标志物Gabarapl1和Sqstm1以及溶酶体标志物Atp6v1h表达水平上调（图S2A-S2F）。据报道大部分溶酶体相关基因的启动子含有溶酶体调控位点“CLEAR”，而小眼症相关转录因子（MiTF）家族的成员能与CLEAR结合，通过调控基因转录来调节不同细胞类型中的溶酶体生物发生。肝细胞中最丰富的MiTF成员是TFEB，在营养充足时，TFEB被mTORC1磷酸化，以非活性状态滞留在细胞质中；当细胞处于饥饿、溶酶体功能受损或其他应激状态时，mTORC1失活，TFEB去磷酸化并转移到细胞核中，与溶酶体相关基因启动子中的CLEAR元件结合，调控目标基因的转录。冷暴露后，肝脏中Tfeb的基因表达水平显著下降（图S2B）。随后，研究人员发现冷暴露对肝脏中磷酸化TFEB蛋白水平有抑制趋势（图3B），并且促进核内（活性）TFEB蛋白水平（图3C）。此外，有研究表明TFEB能激活Ppargc1a从而参与调控肝脏脂质代谢，经检测发现冷暴露促进肝脏Ppargc1a表达（图S2B）。

为了探究TFEB是否调节肝细胞中的BMP脂质，研究人员在Hepa1-6细胞中敲减Tfeb（图3D），发现敲减Tfeb显著抑制了总BMP脂质和PG水平（图3E）。同样，敲减Tfeb的小鼠（TFEB KD）肝脏中BMP脂质水平降低（图3F和图S3A）。这些结果表明TFEB是肝细胞中新的调控BMP脂质的因子。

图3.肝脏特异性Tfeb敲减导致小鼠对寒冷不耐受

图S3.肝脏Tfeb敲减导致溶酶体和循环脂质发生变化，进而导致对寒冷的不耐受

4.肝脏TFEB是小鼠耐寒所必需的

接下来，研究人员利用AAV8病毒载体递送shRNA，构建了靶向肝细胞敲减Tfeb的小鼠模型（TEFB KD）（图3F和图S3G）。与RT条件相比，冷暴露条件下小鼠的核心体温显著降低，且敲减TFEB进一步加剧了小鼠体温的降低（图3G）。TFEB敲减还消除了肝脏中冷诱导的总BMP脂质差异（图3H和图3I），但不影响肝脏和循环中其他脂质的变化（图3J、图S3C和图S3D）。另外TFEB敲减不影响小鼠体重变化，也不影响脂滴和线粒体相关基因的转录水平（图S3B和图S3E），但会导致肝脏重量增加（图S3B），促进溶酶体相关基因表达变化，导致溶酶体相关基因表达上调（小编注：在S3F中，Control Cold和TFEB KD RT相对于Control RT，溶酶体基因均是促进的，理论上来说Cold促进TFEB水平，促进溶酶体功能，基因表达上调，那么敲减TFEB应该抑制溶酶体基因表达，这里作者并没有对此作出解释。我们推测敲减TFEB后，抑制了溶酶体的功能，可能引发TFEB所属的MiTF家族其他转录因子的水平代偿性上调（例如S2B中冷暴露也促进了Tfe3的水平，其可能在TFEB敲减后代偿性上调，但作者没有检测））（图S3F）。这些结果表明，肝脏TFEB对于小鼠的急性冷适应是必需的，并且TFEB能调节溶酶体相关基因转录水平和BMP脂质水平。

5.TFEB DNA结合位点改变会影响冷暴露下的脂质代谢

为了探究TFEB对BMP脂质的调节作用，研究人员室温或冷暴露6h的小鼠肝脏中的TFEB进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）（图4A和图S4A）。研究人员发现，TFEB的大部分结合位点都集中在蛋白编码基因上（图S4B），冷暴露使TFEB的内含子结合比例由61.1%下降至48.4%，在基因间区域的结合比例由24.1%增加至36.2%，而启动子结合比例没有明显变化（RT为7.8%，冷暴露为6.0%）（图4B）。研究人员通过ChIP-qPCR实验检测TFEB与已知靶基因（如Ctsa、Ctsb和Npc1）的结合以验证ChIP-seq结果（图4C和图S4C）。利用LC-MS对TFEB共免疫沉淀进行分析，研究人员发现冷暴露导致TFEB结合蛋白发生变化（图S4D），提示TFEB结合蛋白的改变可能导致了TFEB的功能变化。而在TFEB KD小鼠中，TFEB敲减消除了冷暴露介导的Ctsa和Ctsb表达水平下降（小编注：CTSA和CTSB都是溶酶体中的组织蛋白酶，理论上来说冷暴露促进溶酶体功能应该上调二者表达，并且也有文献表明TFEB能促进CTSA和CTSB表达，那么冷暴露促进TFEB水平也应该上调CTSA和CTSB表达。这里作者并没有解释为什么冷暴露反而抑制了二者表达水平，查阅了其他文章也没有看到讲冷暴露后CTSA和CTSB如何变化的。结合前文图2F，冷暴露也并不影响CTSB活性，因此我们推测有可能冷暴露下，肝细胞溶酶体倾向于处理脂质，从而抑制了蛋白水解酶的表达。总之冷暴露可能通过某些未知的机制影响了CTSA和CTSB的表达或活性），证实了TFEB对其的调控作用（图4D）。随后，研究人员对ChIP-seq分析出的具有TFEB结合位点的基因进行Reactome分析，发现75%的Reactome通路与脂质代谢相关（小编注：目前没有看到讲TFEB结合到基因间区域如何调控其表达，文献报道讲的都是TFEB结合到启动子区域调控基因转录。通常转录因子结合到基因间区域可能通过与增强子区域结合，促进转录活性；或招募染色质重塑复合体（如SWI/SNF、ISWI、CHD等），染色质重塑复合体可以改变染色质结构，使启动子区域的DNA暴露更多，从而促进转录）（图4E）。这些数据表明TFEB在冷诱导的肝脏脂质代谢过程中发挥重要作用。

图4.ChIP-seq表明TFEB介导冷暴露期间肝脏脂质代谢重编程

图S4.ChIP-seq表明TFEB介导冷暴露期间肝脏脂质调控

6.TFEB通过Pla2g15调节肝细胞BMP脂质

由于敲减TFEB的肝细胞中BMP脂质水平发生改变，研究人员推测TFEB能直接调控参与BMP脂质代谢的酶。于是研究人员将ChIP-seq鉴定出的TFEB结合基因、溶酶体中的蛋白和冷刺激后显著改变的基因进行overlap（图5A），筛选出24个基因，进一步锁定4个脂质代谢调节因子（图5A）。在这4个基因中，只有Pla2g15的表达受冷暴露和TFEB调节（图5B和图5C）。并且Pla2g15的基因表达和蛋白水平在冷暴露下均下调（图5D）。ChIP-seq结果显示，Pla2g15在RT条件下转录活跃，ChIP-qPCR证实了TFEB与Pla2g15启动子的结合（图5E）。研究人员发现在Pla2g15转录起始位点下游1543个碱基对的编码序列中也存在一个CLEAR位点（序列：GTCACGTGTG），并通过荧光素酶报告基因检测证实了TFEB与Pla2g15启动子区域和CLEAR位点的结合（图5F和图S5A）。

为了探究Pla2g15是否调节肝细胞中的BMP脂质水平，研究人员在Hepa1-6细胞中敲减Pla2g15，发现Pla2g15敲减导致BMP脂质增加（图5G），其中包括BMP 18:1_18:2，这是冷暴露下小鼠肝脏中增加的主要BMP脂质之一。以上数据表明，TFEB调节Pla2g15的基因转录，PLA2G15可能调控肝细胞BMP脂质。

图5.TFEB通过Pla2g15调节肝细胞中BMP脂质

图S5.在Hepa 1-6细胞中过表达Tfeb

7.Pla2g15介导冷暴露下的BMP脂质变化

研究人员设想TFEB通过与Pla2g15启动子结合抑制其转录，PLA2G15将BMP脂质降解为溶血磷脂酰甘油和脂肪酸；而冷暴露促进TFEB与Pla2g15启动子结合，抑制PLA2G15表达，进而导致BMP脂质水平上升（图6A和图6B）。于是，研究人员特异性敲减小鼠肝脏的Pla2g15（Pla2g15 KD）（图6C和图S6A），发现Pla2g15敲减增强小鼠冷耐受性（图6D），同时抑制冷暴露介导的肝脏BMP脂质增加（图S6D-E）。在原代肝细胞中，敲减Pla2g15也促进了BMP脂质水平（图6E-F和图S6B-C）。有趣的是，Pla2g15敲减也消除了其他冷暴露导致的肝脏脂质变化（包括神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、游离脂肪酸、己糖神经酰胺和醚脂质）（图6G）。

拓展阅读：TFEB功能

TFEB是MiT转录因子家族的成员，能与协调溶酶体基因表达的启动子元件（即CLEAR元件）结合。在营养充足、没有溶酶体应激等正常条件下，V-ATPase、Ragulator和Rag GTPase形成一个活性复合体，该复合体在溶酶体表面结合并激活mTORC1。随后，mTORC1磷酸化TFEB，磷酸化的TFEB与14-3-3蛋白结合，从而被限制在细胞质中。在饥饿、溶酶体应激或V-ATPase抑制的条件下，mTORC1从溶酶体表面释放并失活,不再能磷酸化TFEB，因此未磷酸化的TFEB转移到细胞核中，与靶基因的CLEAR序列结合，从而调控靶基因表达。TFEB基因自身的启动子中也有CLEAR序列，因此TFEB也能促进自身的表达。此外，MCOLN1是溶酶体钙离子通道，在溶酶体表面形成了一个高浓度的Ca2+区域，较高的Ca2+浓度激活了钙调磷酸酶（CN），它使TFEB去磷酸化，促进TFEB激活。具体的功能而言，TFEB参与调控自噬、溶酶体生物合成、溶酶体胞吐和内吞、膜修复等过程相关基因表达，与癌症、代谢障碍等疾病密切相关。例如，据报道，TFEB能上调溶酶体生物发生相关基因如Ctsl、Lamp2，自噬相关基因如Becn1、Wipi1、Atg5，线粒体生物发生相关基因如Pgc1a的转录水平；此外，TFEB能与TFEB启动子中CLEAR元件结合，促进自身的表达。TFEB能正向调控自噬体形成，促进自噬体-溶酶体融合，增强细胞的清除功能；在肿瘤中，TFEB能诱导自噬依赖性细胞死亡，发挥抗癌作用；然而在三阴性乳腺癌中，TFEB能抑制癌细胞凋亡水平；在人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，线粒体自噬能激活TFEB，而激活的TFEB又能促进线粒体生物发生相关基因表达，参与线粒体稳态控制；在肥胖中，TFEB能诱导脂肪组织巨噬细胞中GDF15表达，从而改善肥胖、脂肪组织炎症和胰岛素敏感性。

[1] Martini-Stoica H, et al. Trends Neurosci. 2016.

[2] Tan A, et al. Cell Death Differ. 2022.

[3] Kim J, et al. Nat Metab. 2021.

图6.Pla2g15介导冷暴露下的BMP脂质变化

图S6.Pla2g15是肝脏中BMP脂质的调节因子

8.PLA2G15是BMP脂质磷脂酶

PLA2G15是一种磷脂酶A2家族蛋白，为了探究其能否直接降解BMP脂质，研究人员制备了含有二油酰基BMP和非水解性醚溶血磷脂酰胆碱（lyso-PC 18:0）的脂质体，并将其置于酸性缓冲液中，以模拟溶酶体环境。接着向其中添加活性或失活的纯化人类PLA2G15蛋白（用催化丝氨酸抑制剂二异丙基氟磷酸酯（DFP）处理能够阻断PLA2G15的催化丝氨酸残基，从而抑制其活性），并通过薄层层析（TLC）监测二油酰基BMP脂质的降解产物油酸。添加活性PLA2G15后检测到油酸的特征性迁移带，添加失活PLA2G15则检测不到，表明活性PLA2G15使二油酰基BMP发生了降解（图7A）。

磷脂酶A2酶含有一个由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的催化三联体，有助于水解磷脂分子中位于sn-2位置的酯键。为了探究PLA2G15是否通过这个催化位点直接作用于BMP脂质，研究人员将PLA2G15中的丝氨酸165突变为丙氨酸，产生失活的PLA2G15（dPla2g15）。接着分别将野生型PLA2G15或dPla2g15与冷暴露小鼠肝脏裂解液孵育15分钟，发现野生型PLA2G15抑制BMP脂质和PG含量，而dPla2g15不能（图7B和图S7A）。研究人员基于CRISPR-Cas9技术在293T细胞中敲除Pla2g15基因（Pla2g15 KO），并通过转染Cas9抗性Pla2g15载体恢复Pla2g15的部分表达（图7C和图7D）（小编注：如图7C所示,本研究将携带hPla2g15 sgRNA的慢病毒载体转染到293T细胞中，该载体包含Cas9蛋白和sgRNA。sgRNA含有与目标DNA序列互补的靶向序列，能定位到hPla2g15上，并指导Cas9蛋白剪切hPla2g15，从而实现基因敲除（KO Control）。接着通过慢病毒载体将含有hPla2g15 sgRNA抗性序列的hPla2g15重新引入细胞中，即在原先sgRNA识别的DNA序列中引入突变，使原先设计的sgRNA无法通过互补配对与新转入的DNA结合，从而阻止Cas9蛋白诱导hPla2g15双链断裂，使细胞重新表达 hPla2g15。文中没有具体描述突变的引入是否会影响其蛋白质功能，我们推测可能引入的是同义突变，应该不会对蛋白质产生影响）。发现Pla2g15敲除导致BMP脂质种类增加（图7E），恢复表达后则降低了18:1_18:1、18:0_18:1等几种BMP脂质的含量（图S7B）。此外，研究人员发现Pla2g15全身敲除（Pla2g15 KO）显著抑制了肝脏BMP脂质水平，而利用肝特异性AAV病毒在Pla2g15 KO小鼠中回补Pla2g15降低了BMP脂质水平（图7G、图7H和图S7C）。

图7.PLA2G15在体内降解BMP脂质

图S7.PLA2G15能降解BMP脂质

总结：   

本文中，研究人员揭示了冷暴露下肝脏BMP脂质的变化及其调控机制。首先通过非靶向脂质组学分析，发现冷暴露显著增加肝脏BMP脂质水平，这一变化依赖于溶酶体转录调控因子TFEB。冷暴露下，TFEB活化并结合Pla2g15启动子，抑制其表达，减少溶酶体PLA2G15磷脂酶介导的BMP脂质水解，进而提高肝脏BMP脂质水平。敲减Tfeb可降低肝脏BMP脂质水平并导致小鼠冷不耐受，而敲减Pla2g15可提高肝脏BMP脂质并增强小鼠的冷耐受水平。总之，这些结果揭示了肝脏TFEB-PLA2G15-BMP脂质代谢轴在寒冷适应中的关键作用，提示靶向溶酶体脂质代谢或可为代谢性疾病干预提供新策略。

链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413125002530?via%3Dihub