氧气和生物进化，需氧代谢早于大氧化事件！

先有需氧生物还是有产氧气生物，这也类似一个鸡蛋谁先问题。一般观点认为，地球上先进化出光合作用的细菌，随着氧气浓度的增加，氧气毒性压力驱动了好氧微生物，或者线粒体的进化，线粒体等好氧微生物为真核生命的进化奠定了基础。但诡异的是，作为产氧气的微生物先祖，产氧气和耐受氧气，本身就是个悖论。最新研究发现，生物进化历史上是先产生了好氧能力，然后进化出产氧气的光合作用能力。

编辑总结

在探索远古时期时，问题在于最早的生物几乎没有（如果有的话）完好的化石，而且对于现存的少量化石生物，也无法精确测定它们的进化年代。大约45亿年前的一次撞击事件提供了一个校准点，那次撞击使地球表面的生命灭绝，并形成了月球。达文（Davín）等人利用分子钟、机器学习和系统发育调和方法，重现了过去40亿年地球细菌生物圈的进化过程，特别着重研究了需氧代谢的进化。他们的分析表明，细菌的最后一个共同祖先可能存在于44亿至39亿年前，而需氧生物很可能在大氧化事件（24.3亿至23.3亿年前）之前就已经出现了。耐氧性可能是产氧光合作用进化的一个先决条件，而不是其结果。——卡罗琳·阿什

结构化摘要

引言

微生物生命在生物圈中占据主导地位，但由于化石记录不完整，早期微生物进化的时间尺度一直难以确定。缺乏最大年龄校准点（即一个特定类群可能出现的最早时间点）是一个尤为突出的问题。然而，地球化学记录随着时间的推移保留了微生物代谢的印记，提供了一个补充信息来源。这段历史中的一个关键事件是大约24.3亿至23.3亿年前的大氧化事件（GOE），它标志着大气中氧气含量的大幅增加。这一转变由蓝细菌产氧光合作用的进化和碳埋藏驱动，使生物圈从以缺氧为主转变为富氧环境，引发了生物对氧气的广泛适应。在这项研究中，我们利用大气氧化与需氧代谢进化传播之间的时间联系，来校准细菌域的系统发育。

基本原理

为了确定细菌进化树的时间，我们通过将大氧化事件（GOE）与需氧谱系的年龄联系起来，引入了多个新的最大年龄校准点。我们采用了一种贝叶斯方法，该方法假定需氧节点不太可能早于GOE，但如果有来自化石或序列分歧的充分证据，也可以早于GOE。为了实施这种方法，我们将系统发育调和与机器学习相结合，将从厌氧到需氧生活方式的转变映射到细菌进化树上。通过汇总全基因组的信号，我们能够从不完整的祖先基因库中可靠地推断出需氧和厌氧表型。

结果

我们在1007种细菌的物种树中确定了84次从厌氧到需氧的转变。大多数转变发生在GOE之后，是由呼吸和耐氧基因的水平获取驱动的。然而，尽管有GOE校准，至少有三次转变早于该事件，这表明需氧呼吸在大气广泛氧化之前就已经进化，并且可能促进了蓝细菌中产氧光合作用的进化。我们的分子钟分析估计，最后一个细菌共同祖先生活在冥古宙或最早的太古宙（44亿至39亿年前），而细菌门起源于太古宙和元古宙（25亿至18亿年前）；大多数细菌科的年龄与陆生植物和动物门相当，可追溯到元古宙晚期（6亿至7.5亿年前）。

结论

我们推断，最早的需氧细菌出现在太古宙，比GOE早9亿年。GOE之后，需氧谱系的多样化速度比厌氧谱系更快，这突显了大气氧化对细菌进化的影响。这里开发的方法提供了一个框架，用于将微生物特征与地球的地球化学历史联系起来，为在地球历史背景下探索其他表型的进化提供了一条途径。

一种确定细菌进化年代并重建氧气适应历史的综合方法

我们通过整合基因组、化石和地球化学数据，并将耐氧性和需氧代谢与大氧化事件（GOE）联系起来，推断出了细菌的时间树。颜色表示厌氧（蓝色）和需氧（红色）状态，而紫色的深浅表示现存细菌门中需氧谱系的比例。纳入线粒体和质体是为了利用更丰富的真核生物化石。展示陆生植物和动物是为了进行时间上的比较。

摘要

微生物生命在地球历史上占据主导地位，但留下的化石记录稀少，极大地阻碍了我们对远古时期进化的理解。然而，细菌代谢在地球化学记录中留下了痕迹，其中最显著的就是大氧化事件（GOE）。我们结合机器学习和系统发育调和方法，推断出细菌祖先向需氧生活方式的转变，并将这些转变与GOE联系起来，以校准细菌的时间树。现存的细菌门可将其多样性追溯到太古宙和元古宙，而细菌科的历史则可追溯到显生宙之前。我们推断，大多数细菌门的祖先为厌氧生物，并在GOE之后采用了需氧生活方式。然而，在蓝细菌祖先中，需氧代谢很可能早于GOE，这可能促进了产氧光合作用的进化。

建立进化时间尺度需要使用松弛分子钟（参考文献1、2），在这种分子钟中，分子进化速率（即 “时钟的滴答声”）可以利用已知年龄的化石来为进化树内部节点的每个谱系进行校准（参考文献3、4）。估计细菌定年树（时间树）存在困难，这是由于缺乏用于限制进化枝年龄的化石证据，而最大年龄校准点是一个特别突出的问题。对于绝大多数谱系而言，唯一可信的最大年龄限制是45.2亿年前的月地形成撞击（MFI）（参考文献5、6），那次撞击实际上可能使地球表面的生命灭绝（参考文献7、8）。

鉴于化石校准点的稀缺性，保存在沉积地球化学记录中的生物活动痕迹为关键谱系和代谢的年龄提供了另一种信息来源（参考文献9、10）。可以说，地球化学记录中最显著的事件是大氧化事件（GOE），大约在24.3亿至23.3亿年前，氧气开始在地球大气中积累（参考文献11-13）。GOE最终得以发生，是因为出现了一种新的原核生物代谢方式——产氧光合作用。地球化学证据表明，这种代谢方式可能在大约32.2亿年前就已经进化出来，并且被认为是蓝细菌的代谢方式（参考文献14-17）。普遍的共识是，尽管产氧光合作用大约在9亿年前就已经进化出来，但在GOE之前，大多数生物都是厌氧的（参考文献18），不过在某些环境中，局部的氧气浓度可能更高（参考文献12、19），而且在GOE之前，需氧生命进化和延续的程度仍存在争议（参考文献19-23）。随着氧气水平的上升，厌氧生物要么退回到缺氧的生态位，要么适应氧气的存在，从而产生了各种各样的生活方式，这些生物要么能够耐受氧气，要么可以在呼吸链中直接利用氧气（参考文献24）。大多数向需氧生活方式的转变可能发生在GOE期间或之后，这有可能为大多数适应氧气的谱系提供一个最大年龄，有助于确定细菌的时间树。我们开发并验证了一种概率方法，以GOE作为对适应氧气谱系的软最大年龄校准点来确定细菌进化的年代（图1 查看图片）。

图1. 一种确定细菌进化年代并重建氧气适应历史的综合方法

（A）我们使用松弛分子钟分析来推断细菌的定年系统发育树，参考了多种信息来源（灰色方框）。这些来源包括直系同源标记基因（由65个基因串联而成，其中来自线粒体和质体基因组的基因分别用黄色和绿色表示）、校准点，以及通过系统发育调和和机器学习得出的向氧气利用的祖先转变（见补充材料部分，如方框上方数字所示以及正文内容）。（B和C）化石为进化枝提供了最小年龄（也就是说，它们确定了一个特定的进化枝在过去的某个时间点存在），但确定最大年龄限制更具挑战性。在分子钟分析中，化石提供的时间信息编码在先验条件中（参考文献4）。结合序列信息，分析得出每个节点年龄的后验估计值。在某些情况下（B），来自序列数据和化石的可用信息有力地证明了某个节点确实很古老，但在缺乏有力证据的情况下（C），由于信息不足，节点年龄会向树根偏移，因为地球的年龄（基于月地形成撞击）是唯一的最大年龄限制。（B）和（C）说明了对代表这些不同情况的好氧节点应用GOE软最大年龄校准的效果。在（B）中，由于序列和化石信息推翻了软最大年龄先验假设，推断出的节点年龄仍然很古老。在（C）中，序列和化石信息没有为早于GOE的年龄提供令人信服的支持。我们的分析表明，GOE软最大年龄校准相对于一种独立的衡量标准（即细菌谱系之间的基因转移历史，见正文后文和表1 查看图片）提高了推断时间树的准确性。

结果

推断细菌进化树上的氧气适应进化

我们使用代表基因组分类数据库（GTDB）（参考文献25）中大多数目的1007个细菌基因组推断出了细菌的物种树 [图2A 查看图片和补充材料（SM）第1部分]。我们利用机器学习，根据基因组基因含量预测氧气适应情况，发现基于BacDive数据库的注释（见图S1和表S1），梯度提升方法XGBoost（参考文献26）是最准确和稳健的。在BacDive中定义的需氧生物是指那些能够在有氧气存在的情况下生长的生物。这个类别既包括那些将氧气作为呼吸链一部分加以利用的生物，也包括那些仅仅能够耐受氧气存在的生物。

图2. 细菌中氧气适应的进化

（A）细菌的物种树（使用来自1007个基因组的65个标记基因，通过自定义的位点异质替换模型推断得出），分支根据预测的在有氧气存在时的生长能力进行着色（红色表示需氧；蓝色表示厌氧）。外圈显示了现存基因组观察到的（深色）或预测的（浅色）氧气适应表型。主要的细菌门（在我们的树中有超过15个基因组）都有名称，并通过阴影加以区分。分支长度与每个位点的预期替换数成比例，如比例尺所示。（B）根据XGBoost分类器，对分类为需氧或厌氧贡献最大的基因（SHAP值）（见正文和补充材料）。每个点代表树中的一个节点。在左侧，拷贝数较高的基因预测为厌氧生活方式；在右侧，拷贝数较高的基因预测为需氧生活方式。最能诊断需氧生活方式的基因包括需氧代谢的核心成分，如血红素铜氧还原酶（HCO），以及参与血红素A生物合成的酶，血红素A是HCO超家族中分布最广泛的O₂还原酶（A家族）的辅因子。

为了确定进化树上厌氧和需氧生活方式发生转变的分支，我们使用系统发育调和方法ALE（参考文献27、28）（见补充材料第2部分）重建了物种系统发育中所有内部节点的祖先基因含量，并将XGBoost分类器应用于这些节点，以推断祖先生物在有氧气存在时的生长能力（补充材料第3部分）。在我们的数据集中，我们推断出84次从厌氧到需氧生活方式的转变，其中36%（30次转变）发生在末端分支。相反，观察到66次向厌氧的转变，其中60%（41次转变）影响了末端分支。

由于祖先基因含量只能在存在很大不确定性的情况下进行推断，我们探讨了假阳性和假阴性（错误地存在或不存在的基因家族）对我们祖先状态推断的影响。即使假阴性和假阳性的联合概率为50%，XGBoost仍能保持超过90%的准确率（图S1）。这种稳健性意味着许多基因家族可以区分需氧生物和厌氧生物。对XGBoost预测影响最大的基因预计直接参与需氧呼吸（如终端氧化酶及其辅因子的生物合成）以及厌氧代谢的标志性基因（如丙酮酸甲酸裂解酶；图2B 查看图片）。

为了验证我们的发现，我们仅基于用于推断物种树的修剪后的氨基酸串联序列构建了一个替代分类器（补充材料第3部分）。基于串联序列的分类器的留一法预测准确率为83.7%，并且与基于基因含量的祖先节点分类器结果吻合良好（与XGBoost的总体一致性为90%；见补充材料第3部分）。这表明氧气适应在基因组中留下了两种一致但不同的印记，一种在基因含量上，另一种在通用基因的氨基酸序列上。

用大氧化事件（GOE）校准的细菌时间树

通过在我们的参考树中识别出祖先节点和后代节点具有不同XGBoost预测需氧状态的分支，我们建立了细菌系统发育上需氧转变的图谱，在定年分析中可以将GOE软最大年龄校准应用于此图谱（图3 查看图片）。为了推断细菌进化的时间尺度，我们扩展了我们的物种树，纳入了来自真核细胞器的基因。线粒体和叶绿体分别与α - 变形菌（参考文献29、30）和蓝细菌（参考文献31、32）分支，但它们的年龄可以利用真核生物化石记录来限制，从而增加了可用于对细菌物种树进行定年的化石校准点的数量（在16个校准节点中，10个是真核生物的，真核生物记录提供了7个非冗余最大年龄校准点中的5个（补充材料第4部分）（参考文献33、34）。由于植物和藻类都有线粒体和叶绿体，相同的真核生物物种分歧在细菌物种树中会出现两次，例如，红藻和绿藻之间的分歧既出现在线粒体进化枝中，也出现在质体进化枝中。在定年分析中，这些等效节点可以 “固定”（固定为相同的未知年龄）（参考文献33、34），从而提供有价值的额外校准信息（图3 查看图片）。

图3. 细菌的定年系统发育树

（A）细菌的定年系统发育树。分支颜色代表厌氧谱系（蓝色）和好氧谱系（红色）。线粒体和叶绿体的分支分别为橙色和绿色。分支长度与地质时间（单位：十亿年）成比例。水平灰色条表示95%的最高后验密度，显示在树根以及两个主要的细菌分支，即薄壁菌门（Gracilicutes）和陆生菌门（Terrabacteria）处。垂直灰色线表示约45.2亿年前的月地形成撞击（MFI）；约32.3亿年前的绿色线反映了产氧光合作用的化石和同位素证据的存在；约23.3亿年前的红色线反映了大氧化事件（GOE）的结束（见补充材料第4部分的校准）。黑点表示在分子钟分析中直接校准的节点。用罗马数字标记的红点表示推断的可能早于GOE的向需氧状态转变的分支（图2 查看图片）。这些校准包括将45亿年前的月地形成撞击（MFI）作为细菌进化的最大时间限制，三个蓝细菌化石，色素奥克烯（用于诊断着色菌科），以及从真核生物化石记录中映射到线粒体和叶绿体的10个校准点（见图S20）。交替的背景阴影区分了地质年代。（B）基因组分类数据库（GTDB）中定义的分类等级的推断年龄。显示了由八个或更多基因组代表的门的名称。我们展示了在我们的1007个基因组数据集中，由至少三个基因组代表的主要分类群（门、纲、目和科）的最后共同祖先的年龄。年龄中位数分别为：门，21.15亿年前；纲，15.24亿年前；目，11.2亿年前；科，6.55亿年前。补充数据中包含一个带注释的时间树图。

然后，我们进行了贝叶斯松弛分子钟定年分析，以估计进化速率和分歧时间，并在我们的重点分析中使用伽马分布来模拟各谱系之间明显的速率变化（如图3 查看图片所示）。我们在三种不同的校准策略下进行了分析：“MFI”，即将月地形成撞击（MFI）作为唯一的校准点，为细菌进化提供了一个最大年龄；“化石”，其中包括MFI校准点，以及对另外15个节点的化石和地球化学校准（见图S2和补充材料第4部分）；“化石 + GOE”，即在“化石”校准的基础上，对好氧节点的年龄增加一个GOE软上限。请注意，尽管在GOE之后向需氧状态的转变可能更为常见，但至少有一些好氧谱系在GOE之前就已经进化出来也是合理的（参考文献19-22、35-37）。为了考虑这种可能性，我们在贝叶斯分析中设置了一个软上限。传统上，软上限用于反映在解释化石记录中缺失数据时的不确定性（参考文献38），但它们也为大多数向需氧状态的转变发生在GOE之后这一假设提供了一个自然的框架。为了体现这一预期，我们降低了好氧节点早于GOE的概率，但如果有足够的化石或序列分歧证据支持，好氧节点仍然可以早于GOE（图1，B和C 查看图片，以及图S3和S23）。

GOE软上限的影响通常是使好氧细菌谱系的起源向更接近现在的时间推移，当应用这个校准时，细菌门的平均年龄会变得年轻3.28亿年。重要的是要注意，这个结果并不是由我们在GOE设置软上限的假设预先决定的，因为正如上面所提到的，数据（序列和校准点）可以克服先验假设（图1B 查看图片）。对于五个好氧节点来说确实是这样（图3A 查看图片和图5A 查看图片），包括光合蓝菌纲（Cyanobacteriia）的直接祖先（图3 查看图片中的转变I，图5B 查看图片中的节点2，以及补充材料第5部分），这与在32.25亿年前至少存在一些游离氧的地质证据相一致（见补充材料第4部分）。

图4. 在一系列分析条件下推断的最后一个细菌共同祖先（LBCA）的年龄

（A）相对于月地形成撞击（MFI）以及与后期重轰炸期相关时期的最后一个细菌共同祖先（LBCA）的推断年龄。一项仅考虑树的拓扑结构和校准点的分析，包括基于MFI的LBCA树根最大年龄（即有效先验，绿色），将大部分概率置于接近45.2亿年前的树根最大年龄校准值附近。添加序列数据的效果是使LBCA的年龄范围适度变年轻，尽管仍然接近MFI（蓝色）。在好氧节点上添加额外的软上限（GOE软上限，红色）改善了仅由树的拓扑结构和校准点所暗示的非常古老的年龄。（B）不同树根最大年龄对推断的最后一个细菌共同祖先年龄的影响，包括有和没有GOE软上限的情况。当应用GOE软上限校准时（左侧红色），推断的LBCA年龄对于树根最大年龄的选择变得稳健，即使树根最大年龄回溯到已知宇宙的年龄138亿年前也是如此，这可能是由于新的最大年龄提供了额外的速率信息。仅考虑校准点、树根最大年龄和序列数据（右侧蓝色）时，推断的LBCA年龄对树根最大年龄的选择很敏感。例如，当最大年龄比MFI更古老时，LBCA的年龄会超过地球的年龄。这种影响之前已经被讨论过（参考文献8、47、50），可能反映了在生命历史早期缺乏用于校准分子钟的最大年龄。

古代基因转移支持GOE软上限

我们基于先验假设使用了GOE软上限，即好氧生活方式在GOE之后比之前更为常见。然而，鉴于在“化石”和“化石 + GOE”分析中，一些好氧细菌谱系都早于GOE，那么询问应用GOE软上限是否能改善对细菌时间树的推断似乎是合理的。我们推断，基因家族的历史携带了系统发育信号来区分不同的定年树，因为基因转移只能发生在同时存在的物种之间（参考文献39-42）。为了利用这些信息，我们使用了一个调和模型，该模型只允许在时间上有重叠的分支之间进行基因转移（见补充材料第6部分）。在调和模型下基因家族的似然性为在不同时间树之间进行选择提供了一个指标（图S5），就像在传统系统发育学中序列似然性可用于在树的拓扑结构之间进行选择一样（参考文献43-45）。

为了评估GOE软上限对时间树的影响，我们使用来自1007个基因组的4713个基因家族，比较了对推断时间尺度的支持程度（表1 查看图片）。正如预期的那样，仅用MFI校准的时间树的似然性最低，也就是说，与基因家族历史的兼容性最差。用化石校准时间树显著提高了似然性，而将化石与GOE软上限结合起来进一步增加了似然性，并产生了最好的结果。当使用XGBoost预测器时，似然性的提高最大，不过对于所有测试的氧气适应预测器，包括第二好的ExtraTrees和基于串联的方法（补充材料第3部分），都观察到了似然性的显著提高（表1 查看图片和图S5）。

表1. 时间约束的基因复制、转移和丢失（DTL）模型下的似然性比较

使用不同的一致时间树图，对4713个基因家族进行了调和分析。我们展示了总对数似然值（通过将每次调和分析的所有对数似然值相加得到）以及与最不可能的时间树图（仅将MFI作为树根最大年龄校准点）的差异。分析表明，结合了XGBoost对氧气利用预测的定年树明显优于（近似无偏检验P < 0.05）（参考文献93）所有其他树。时间树图包含在补充数据中。

细菌进化的修正年表

我们的分析支持这样一种观点，即细菌域内最深层次的分歧发生在地球历史的早期（图3 查看图片）。我们估计最后一个细菌共同祖先（LBCA；图4A 查看图片）存在于44亿至39亿年前，这是在月地形成撞击（MFI）之后，但很可能在与后期重轰炸期（40亿至38亿年前）相关的时期之前（参考文献46）。推断的LBCA年龄与最近结合了大量已知细菌和古菌多样性样本的分析结果大致一致（参考文献22、47、48），但比一些早期的分析结果要古老（参考文献8、49）。这些推断表明，早期地球对原核生物生命的适宜程度比有时所认为的要高（参考文献7）。在远古时期分子钟分析中经常遇到的一个困难是，年龄估计对树根最大年龄校准很敏感，由于树的其他地方缺乏信息丰富的最大年龄，推断的树根年龄与最大树根年龄相冲突（参考文献34、50-52）。我们结合不同数据集和替代校准点的分析表明，GOE软上限校准提供了新的时间信息，使得推断结果对模型选择和树根最大年龄具有稳健性（图4B 查看图片和补充材料第5部分）。例如，当将树根最大年龄设置为38亿年前（对应于后期重轰炸期的估计结束时间）时，LBCA的年龄受到最大年龄的限制，但当树根最大年龄更古老时，LBCA的年龄稳定在44亿至39亿年前。因此，即使在好氧节点上引入了GOE软上限，序列数据和化石也不支持现存细菌生命起源于后期重轰炸期之后的观点。

图5. 好氧代谢早于大氧化事件（GOE），并可能促进了产氧光合作用的发生

（A）推断的可能早于GOE的向需氧状态转变（由从蓝色到红色的转变表示）的年龄范围。所描绘的年龄范围从厌氧祖先年龄的最古老的5%尾部延伸到好氧后代年龄的最年轻的5%尾部。12次转变的中位转变年龄比GOE更年轻（即GOE之前的转变概率 > 0.5）；在5次有超过95%的概率发生在GOE之前的转变中，有3次通过机器学习分类器推断出含有血红素铜氧还原酶（HCO）/细胞色素bd（cytbd）终端氧化酶（加粗名称，另见图S18）。（B）蓝菌门（Cyanobacteriota）内的向需氧状态转变和基因含量进化。我们推断，向需氧生活方式的转变发生在通向蓝菌纲（Cyanobacteriia）和吸血菌纲（Vampirovibrionia）最后共同祖先的分支上（节点2；另见图S4和补充材料第5部分），而产氧光合作用出现得更晚，在通向蓝菌纲冠群的基干谱系内（节点3；即在全群蓝菌纲内），尽管其进化起源存在争议（参考文献94、95）。尽管蓝菌纲冠群的祖先很可能具有产氧光合作用的能力，但由于在存在系统发育噪声的情况下调和分析的保守性，一些关键基因的存在概率只是中等水平（参考文献80）。XGBoost的预测与现存和祖先蓝菌门中复合物III和IV基因的存在 - 缺失模式一致，并且为CoxA基因在CV祖先中就已经存在这一假设提供了一些支持。这些列包括参与光合作用的基因的平均概率，PS I - Psa包含光系统I的初级反应中心；PS I - Ycf涉及光系统I的组装，PS II - Psb形成光系统II的核心，对氧气的产生至关重要。总体而言，这些分析与进化出产氧光合作用的蓝细菌谱系已经具备需氧呼吸能力这一假设相一致（参考文献21、62）。约32.3亿年前的绿色线反映了产氧光合作用的化石和同位素证据的存在；约23.2亿年前的红色线反映了GOE的结束（见补充材料第4部分的校准）。交替的背景阴影表示地质年代。

我们推断，主要的后代进化枝薄壁菌门（Gracilicutes）和陆生菌门（Terrabacteria）分别在42亿至36亿年前和43亿至39亿年前辐射演化，这比最初的估计要早得多（参考文献49），但与最近的一些推断大致相符（参考文献22）。拥有最古老冠群的现存门包括芽孢杆菌门（Bacillota，以前称为厚壁菌门；36亿至30亿年前）、奇异菌门（Patescibacteria；34亿至29亿年前）、放线菌门（Actinomycetota；34亿至28亿年前）和蓝菌门（Cyanobacteriota；35亿至33亿年前）。变形菌门（Pseudomonadota，以前称为变形菌门；冠群年龄为29亿至26亿年前）尽管在现存的系统发育和代谢多样性方面较为丰富，但其冠群年龄比蓝菌门（35亿至33亿年前）以及其他主要的陆生菌门要稍年轻一些。我们推断现存的产氧光合生物——蓝菌纲（Cyanobacteriia）冠群的年龄为25亿至21亿年前。在之前的分析中（参考文献22、41、53），这个时间有所不同，范围从元古代追溯到太古代（39亿至17亿年前）。在我们的定年分析中，我们对所有需氧节点都应用了大氧化事件（GOE）的软上限，包括冠群产氧光合蓝菌纲。然而，由于这个祖先已经能够通过光合作用产生自身所需的氧气，我们还进行了一项分析，将冠群蓝菌纲从GOE软上限校准中排除，得出了一个稍早的估计值（27亿至21亿年前，图S28），这与最近使用其他定年方法的分析结果大致相符（参考文献53）。

我们发现，相对进化分歧度（RED）指标——用于衡量已测序分类群之间的遗传分歧度，并且被基因组分类数据库（GTDB）用于将原核生物的多样性划分为年龄相似的分类群——与绝对地质时间具有良好的相关性，RED值与节点年龄之间的斯皮尔曼相关系数（ρ）为0.93（补充材料第5部分）。之前一项专注于真菌分类学的研究发现，RED与相对分歧时间之间也存在类似的一致性（参考文献54），这表明尽管RED相对简单，但总体上它是衡量分歧时间的一个良好指标。

我们的分析清楚地表明，原核生物和真核生物多样性在进化时间尺度上存在巨大差异，以及林奈分类等级在时间上的异质性（参考文献55、56）。例如，我们估计现存线粒体（以及现存真核生物）的最后一个共同祖先生活在18.8亿至15.02亿年前（Ma）。因此，生命的真核生物域在年龄上与一个细菌纲相当，而之前对一些类群冠群年龄的估计，如后生动物（动物）为8.33亿至6.5亿年前（参考文献57、58），有胚植物（陆生植物）为5.15亿至4.94亿年前（参考文献59），大致相当于我们分析中年龄在8.99亿至4.57亿年前的细菌科（图3  查看图片）。事实上，许多现代细菌科在太古代或元古代就已经形成（见图3  查看图片）。此外，图3  查看图片显示，现存细菌多样性中有相当一部分是在细菌门出现之前就已经进化出来的，这支持了最近提出的在域和门之间增加“界”这一分类等级的提议（参考文献60）。

需氧代谢早于大氧化事件

回到细菌进化树中需氧适应的历史，最后一个细菌共同祖先（LBCA）以及薄壁菌门和陆生菌门的共同祖先被推断为厌氧生物。实际上，大多数（49个细菌门中的38个）细菌门的祖先被推断为厌氧生物。例如，我们的分析确定了在变形菌门（Proteobacteria）内有两次早期独立的向需氧状态的转变，这与已发表的基因树一致，这些基因树显示在这个进化枝中关键呼吸酶有多次水平转移（参考文献61）。

我们发现，在有GOE软上限的分析中（84次转变中有72次发生在GOE之后，图3A  查看图片）以及没有GOE软上限的分析中（84次转变中有61次发生在GOE之后，图S23），大多数向需氧状态的转变都发生在GOE之后。然而，即使应用了GOE软上限，12次转变的后验年龄中位数也早于GOE，其中5次转变以95%或更高的后验概率发生在GOE之前（图5A  查看图片），这为在大气持续氧化之前的氧气适应提供了证据（参考文献20、23、35、62-65）。在GOE之前，微生物可能遇到过局部的氧气聚集区，这些氧气是通过非生物方式产生的，例如水的光解或辐射分解（参考文献65、66）、破碎的硅酸盐岩石与水的反应（参考文献67-69），或者在产氧光合作用进化之后，微生物席或海洋富氧区域中产生的局部高浓度氧气（参考文献70-72）。

最早推断的向需氧状态的转变发生在32亿年前，也就是至少比GOE早9亿年，发生在蓝菌纲（Cyanobacteriia）和吸血菌纲（Vampirovibrionia）的共同祖先中（此后称为CV祖先，图5B  查看图片中的节点2）。为了研究这个谱系是否已经具备需氧呼吸的能力，我们开发了第二个基于基因含量的分类器，该分类器根据重建的祖先基因含量预测终端氧化酶（即22种血红素铜氧还原酶（HCOs）以及细胞色素bd家族和亚家族）在祖先中的存在情况（见补充材料第3部分）。我们首先将用于氧气适应（需氧/厌氧）和终端氧化酶（存在/不存在）的两个分类器应用于现存生物的1007个基因组，以检查四种可能的组合是否合理。正如预期的那样，几乎所有现代需氧生物都被预测含有终端氧化酶（约97%，445个基因组中的433个）；然而，奇异菌门是一个明显的例外，因为它们中包括一些被预测为需氧生物但却缺乏终端氧化酶的生物（445个基因组中的12个）。这可能是由于它们与宿主相关的生活方式，在这种生活方式中，它们间接从需氧宿主的终端氧化酶中获益（参考文献73）。例如，属于纳诺古菌门（Nanohaloarchaeota）的古菌DPANN共生体包括一些依赖需氧宿主的耐氧生物（参考文献74、75）。值得注意的是，几乎一半的现代厌氧生物被预测含有终端氧化酶（约46%，562个基因组中的261个，有关这些情况的人工验证见补充材料第3部分），这些终端氧化酶可能用于氧气解毒（参考文献76-78）。剩下的一半被预测为缺乏终端氧化酶的厌氧生物，这也是大多数深层祖先节点的推断状态。

终端氧化酶分类器预测，在五次高可信度的GOE之前的需氧转变中，有三次涉及终端氧化酶：早期蓝菌门（概率为94%）、绿弯菌门（Chloroflexota；概率为89%）和粘球菌门（Myxococcota；概率为99%；图5A  查看图片中的转变I、II和IV）。氧气适应信号与终端氧化酶在祖先中存在的信号相结合，为CV祖先已经能够利用氧气这一假设提供了有力支持。然而，在CV祖先中，呼吸链单个成分存在的概率只是中等水平（图5B  查看图片；另见图S8），因此，汇总全基因组数据的机器学习分类器提供了重要的额外证据。这一发现与我们之前仅基于现存蓝菌纲和吸血菌纲中不同类型终端氧化酶的存在就推断CV祖先是厌氧生物的结论形成了对比（参考文献17、61），突显了系统发育调和与机器学习相结合所提供的新见解。

氧气适应分类器和终端氧化酶分类器的结果比较表明，终端氧化酶的出现有时会明显早于向需氧生活方式的转变，薄壁菌门内的一些深层厌氧节点被高可信度地预测编码终端氧化酶（图S18）。这一结果与之前的研究一致，之前的研究表明一些关键的耗氧酶的起源可以追溯到GOE之前（参考文献23）、最后一个细菌共同祖先（参考文献20），甚至是最后一个普遍共同祖先（参考文献21）。需氧呼吸进化的一个合理情景是，GOE以及随之而来的大气氧含量增加，为能够利用这种资源获取细胞能量的新蛋白质机制的进化创造了强大的选择压力（参考文献79）。然而，我们的研究[以及其他一些研究（参考文献20、21、23、35、63）]反而表明，需氧呼吸可能是更逐渐地进化而来的，最早的终端氧化酶适应于处理最初由非光合方式产生的微量氧气，如前所述。如果是这样，那就意味着编码终端氧化酶但似乎并不将其用作能量转换手段的现代厌氧生物（参考文献76-78），可能是HCO进化早期阶段的最佳现代类似物。未来涉及CV祖先中HCO祖先序列重建的研究，可能会深入了解推动这种酶进化的选择压力。

关键的产氧光合作用基因首次出现在蓝菌纲祖先中（图5  查看图片中的节点3），晚于这个谱系中的需氧代谢。这支持了这样一种假设，即氧气适应是产氧光合作用进化的必要先决条件，并且可能促进了产氧光合作用的进化，因为它使早期蓝菌纲能够管理甚至利用所产生的氧气（参考文献21、62-64）。然而，要确定这些事件的顺序具有挑战性，因为随着系统发育信号在进化时间中进一步稀释，证明某种特征的不存在变得更加困难（参考文献80）。鉴于最近的研究表明，光能营养可能在细菌进化中出现得更早（参考文献81、82），我们不能排除产氧光合作用早于蓝细菌谱系中的需氧代谢，或者与之共同进化的可能性。为了探究这些不确定性对我们的细菌时间树的影响，我们进行了分子钟分析，在分析中我们不假设在32亿年前进行产氧光合作用的生物是蓝菌纲的基干类群（见补充材料第4部分），而是对CV祖先在GOE时使用一个保守的较年轻的最小年龄（图S4）。在这个分析中，推断出的CV祖先更年轻（29亿至24亿年前），但我们的其他结果并未受到重大影响。

细菌进化的节奏和模式

我们通过将定年树与基因树 - 物种树调和相结合，估计了需氧生物与厌氧生物的基因含量进化速率。每百万年留下系统发育信号的基因转移和丢失数量，经基因组大小归一化后，在需氧生物和厌氧生物中大致相似，每百万年大约记录有一次转移和一次丢失，而推断的基因复制速率则大约低100倍。基因转移在需氧代谢的传播中起到了重要作用，包括电子传递链成分以及其他与向需氧生活方式转变相关的基因的转移（补充材料第7部分）。

为了评估细菌基因库随时间的进化情况，我们应用了非度量多维标度法，使用重建的祖先基因库作为祖先状态，来量化现代细菌和祖先细菌基因含量之间的差异（见补充材料第7部分）。绘制随时间变化的差异图（图6A  查看图片）表明，细菌基因库的大多数变异在35亿年前就已经形成，即在陆生菌门和薄壁菌门进化枝辐射演化期间，这支持了基因家族的“太古代扩张”（参考文献83）。

图6. 地质时间尺度上的细菌进化

（A）太古代细菌遗传多样性的早期进化（参考文献83）反映在基因含量差异的迅速增加上（见补充材料第7部分）。（B）该折线图展示了需氧和厌氧谱系的相对多样化速率（到下一次物种形成事件的等待时间的倒数之比），揭示了自GOE以来的地球历史的大部分时间里，需氧生物的多样化速率持续较高。在元古代结束之前，速率达到平衡，之后自GOE以来，需氧生物的多样化速率又回升到较高水平。虚线表示比值为1，即需氧和厌氧谱系的多样化速率相等。由于节点数量较少，末端分支被省略，并且自1亿年前以来的比值未计算。（C）通过水平基因转移（HGT）传播的需氧代谢。自GOE以来的地球历史的大部分时间里，从厌氧到需氧生活方式的转变数量超过了相反方向的转变数量。该图展示了在每个时间段内，定年物种树上需氧与厌氧转变速率的比值。虚线表示比值为1，即两个方向的转变速率相同。自约2亿年前以来的节点数量较少，这大大增加了两种分析的不确定性，这反映在节点后验年龄估计的宽置信区间上。由于节点数量较少，自1亿年前以来的比值未计算。（D）根据图3  查看图片得出的需氧谱系数量。（E）根据参考文献（11、13、84）绘制的随时间变化的大气氧含量定性草图。灰色线表示约45.2亿年前的月地形成撞击（MFI）；约32.3亿年前的绿色线反映了产氧光合作用的化石和同位素证据的存在；约23.3亿年前的红色线反映了GOE的结束（见补充材料第4部分的校准）。交替的背景阴影区分了地质年代。

接下来，我们研究了向需氧代谢的转变对细菌进化的影响。为了比较需氧生物和厌氧生物的相对多样化速率，我们使用了一个基于物种形成事件之间时间间隔的指标（图6B  查看图片和补充材料第7部分）。这项分析表明，氧气适应主要有两个时期：从GOE开始，需氧生物迅速建立起多样化优势（图6E  查看图片），这种优势持续了接下来的约15亿年，之后有所减弱，但在最近的5亿年里又有所回升。在一个互补的指标中，即衡量需氧和厌氧代谢之间转变方向的指标（图6C  查看图片和补充材料第7部分），需氧生物较高的多样化速率也很明显。我们认为这种模式反映了GOE时期需氧生态位的形成，以及随着大气游离氧含量在古生代经历第二次持续上升（参考文献84、85），额外的高氧需氧生态位的出现，同时也反映了早期厌氧谱系因氧化作用而选择性灭绝，以及它们生态位空间的缩小和碎片化。在中元古代，需氧谱系的逐渐增加（而非突然增加）（图6D  查看图片）与这一时期相对较低的氧含量一致（参考文献84、86、87），这可能抑制了需氧生物的多样化。

除了需氧谱系具有相对优势的两个时期外，这两个多样化指标还记录了早期趋势的后期逆转，即大约在2亿年前，厌氧生物具有优势（图6  查看图片）。这些推断存在不确定性，因为由于物种形成节点数量较少，这一时期的置信区间较宽。尽管如此，这种信号似乎有可能反映了对新的缺氧生态位的适应，例如早期动物的胃肠道，或者腐烂生物质内的厌氧生态位（参考文献88、89）。未来可以通过扩展分类群数据集，并使用本研究中开发的方法分析已经多样化进入这些缺氧生态位的细菌谱系，来检验这一假设。

讨论

我们的分析展示了一种将细菌基因含量与表型联系起来，并追溯这些关系随时间变化的新方法。通过将系统发育调和与机器学习相结合，我们预测了细菌进化树中祖先节点的氧气利用表型。我们通过汇总与表型直接和间接相关的许多基因家族的信号，来弥补在远古时期系统发育分辨率的损失。虽然这种方法假设在现代生物中预测需氧代谢的基因对它们的祖先也具有预测性，但我们的分析表明，我们捕捉到的信号对大量噪声具有鲁棒性，因此能够可靠地追踪远古时期从厌氧到需氧的转变。这使我们能够根据生物圈氧化的记录来校准细菌进化，极大地扩充了早期生命有限的化石记录，并为远古时期进化的研究带来了新的分辨率水平。我们的时间树突显了细菌和真核生物分类之间的差异：大多数现存的细菌门在太古代和元古代早期辐射演化，早于生命的真核生物域的出现。留下现存后代的最早需氧生物生活在太古代（32.2亿至32.5亿年前），比GOE早约9亿年，并产生了蓝菌纲和吸血菌纲，这表明需氧代谢在有限的谱系中早于产氧光合作用和GOE进化。然后，GOE推动了需氧代谢的激烈多样化和传播时期，随后在元古代末期出现了多样化的第二阶段，这与中元古代的氧化还原静态以及此后氧化栖息地的扩展相一致。这是由于基于氧气的呼吸复合物的广泛转移，并且成为需氧生物的谱系随后经历了比同时期厌氧生物更高的多样化速率。类似的技术可以应用于根据地球历史研究其他表型特征的进化，也可以进一步研究古菌内的氧气适应，或者同时研究两个域内的氧气适应，以更全面地了解早期地球上生物对大气氧化的反应。我们预计，高分辨率的微生物生命时间树将极大地丰富我们对生物进化与地质进化之间相互作用的理解。