2024年4月19日-21日，第一届Green Carbon青年编委会生物方向研讨会暨“合成生物技术与绿色生物制造——高版本底盘工程”学术沙龙在青岛召开。中国科学院天津工业生物技术研究所王钰研究员应邀出席并作题为“用于生物合成元件进化的工程微生物底盘设计”的邀请报告。

用于生物合成元件进化的工程微生物底盘设计

 背景介绍 

设计构建工程微生物菌种用于生物制造，需要具有催化、调控等各种功能的生物元件。自然界中挖掘的生物元件由于催化性能、稳定性等限制，难以直接应用于微生物菌种的构建，因此通常需要对元件进行定向进化。元件的筛选和测试通量，直接决定了元件的进化效率。王钰研究员聚焦甲醇等一碳原料的转化利用，开展甲基营养微生物的DNA防御与修复、一碳代谢调控、能量产生与平衡的应用基础研究。在本次报告中，王钰研究员介绍了基于理性设计对微生物底盘进行代谢重塑，创建了特定代谢物或能量载体的人工营养缺陷型菌种，建立了生长依赖的元件高通量筛选策略，对甲醇利用、氨基酸合成等生物元件进行了进化改造。经过设计改造，微生物不仅是生物制造的核心催化剂，也是生物元件进化筛选的高效工具。

王钰研究员在“合成生物技术与绿色生物制造——高版本底盘工程”学术沙龙上作邀请报告

 报告内容 

工程微生物底盘用于生物元件进化

生物制造利用微生物底盘为生产介质，以生物质为原料，这种生产方法从根本上改变了传统化学和物理制造方式的不可持续性和高度能源依赖性，降低了生产过程对环境的不良影响。生物制造对于实现“双碳”目标至关重要，是社会可持续发展的必然选择，其关键在于能够提高效率和绿色指数。因此，下一代生物制造应运而生，旨在进一步降低生产成本、防止污染，并提高效率，实现更加自动化、连续化、绿色可持续性的生产与发展方式。

基因编辑是设计构建工程微生物菌种用于生物制造的关键技术，基因编辑的靶点主要包括催化元件如蛋白酶，调控元件如启动子等，而如何高效获得并特异性筛选这些元件是实现生物元件定向进化的关键。酶的进化主要包括突变和筛选两个步骤。构建突变文库的技术已十分成熟，如通过易错PCR、噬菌体进化或易错DNA 聚合酶等技术均可以实现。从巨大的突变文库中筛选出所需要的酶则可以通过微孔板、流式细胞仪和液滴微流控等方法实现。然而在实际的操作中，面对海量的突变体，快速筛选到目标生物元件仍是一大挑战。而建立简便快速高效的筛选方法就像是能够有效识别千里马的伯乐，是定向进化能否成功的关键。

自然界中，抗生素的筛选压力会导致微生物高频突变，具有抗生素抗性的微生物凭借生长优势，经过富集生长就会脱颖而出。受这种生长依赖的进化和筛选的启发，王钰研究员通过构建人工营养缺陷型微生物菌株，对目标生物元件进行生长依赖的筛选，建立起酶活与细胞生长速度的正向关联。通过对突变体库进行传代培养，即可实现目标生物元件的富集，建立了生长依赖的生物元件高通量筛选策略。在本次邀请报告中，王钰研究员详细介绍了物质型和能量型人工营养缺陷型微生物菌株在生物元件进化过程中的应用。

物质型人工营养缺陷型微生物菌株在生物元件进化中的应用

氨基酸是蛋白质的基本组成单元，是一类具有重要应用价值的生物基产品。生物传感器能够将化合物浓度转化为电信号、荧光信号等易于检测的信号，可实现特定化合物的精确和高通量检测。因此，生物传感器可辅助菌株的适应性进化，用于功能元件和菌株的高通量筛选。氨基酸的生物传感器可分为基于转录调控因子、核糖体开关、蛋白质相互作用以及蛋白质翻译元件的生物传感器等几种类型。尽管目前大部分的蛋白质氨基酸已有相应的生物传感器，但是部分氨基酸的生物传感器仍未见报道，限制了其在菌株与元件筛选中的应用。而开发基于氨基酸的生物传感器的最大难点是找到特异性识别某种氨基酸的转录因子或核糖体开关。

王钰研究员团队独辟蹊径，将改造靶点瞄准氨基酸合成蛋白质过程中的关键酶——氨酰tRNA合成酶。通过对氨酰tRNA合成酶进行改造，降低其对氨基酸的亲和性，导致蛋白质的合成速度下降，细胞生长受阻，构建了物质型的人工营养缺陷型微生物菌株。利用特定手段使氨酰tRNA合成酶和氨基酸的结合域突变后，该菌株不能有效结合氨基酸并催化氨酰tRNA合成，导致多肽链的合成受阻，进而造成蛋白质的合成受阻，细胞生长缓慢。若突变菌株能够高产目的氨基酸，就可缓解这种结合受阻，从而使蛋白质的合成恢复，细胞生长得以恢复，会形成较大的菌落而被鉴别出来。

以该种营养缺陷型微生物菌株为出发菌株，即可筛选出高产氨基酸的目标元件。由于二十种蛋白质氨基酸和许多非天然氨基酸都具有它们特定的氨酰tRNA合成酶，通过构建各类氨基酸的全细胞生物传感器，能够为筛选氨基酸高产菌株和元件开辟一条具有普适性的新路径。

氨酰tRNA合成酶突变株用于筛选氨基酸高产突变株的原理示意图

能量型人工营养缺陷型微生物菌株在生物元件进化中的应用

NAD(P)H生命体最重要的一类能量载体。以甲醇为代表的一碳原料，具有来源广泛、成本低廉、便于运输等优势，被认为是一种极具前景的生物制造原料。NAD⁺依赖型甲醇脱氢酶能够催化甲醇氧化生成甲醛，同时伴随着NADH的生成，是甲醇生物利用的首步反应。然而，甲醇脱氢酶较低的催化活性和严格的NAD⁺辅因子偏好性限制了其在甲醇生物转化利用中的应用。因此，构建营养缺陷型突变菌株用于甲醇脱氢酶的活性和辅因子改造具有重要意义。

为此，王钰研究员团队构建了生长偶联的甲醇脱氢酶突变体筛选系统，首先敲除编码二氢硫辛酸脱氢酶的lpd基因，该基因是丙酮酸脱氢酶复合体、α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及甘氨酸裂解酶复合体中的关键亚基，该基因的敲除会导致这些复合体酶失活，使菌株当以乙酸作为唯一碳源时，无法再生成NADH，成为了NADH营养缺陷型（NADHₐᵤₓ）菌株。在同时添加乙酸盐和甲醇的基本培养基中，甲醇脱氢酶催化甲醇氧化合成的NADH可供给细胞生长，从而建立了甲醇脱氢酶活性与细胞生长速度的正向关联。此外，还构建了NADPH营养缺陷型菌株（NADPHₐᵤₓ），用于NADP⁺辅因子偏好性甲醇脱氢酶的筛选。通过建库和筛选，将甲醇脱氢酶的活性提高了20倍，将NADP⁺辅因子的偏好性提高了90倍。

建立NADH营养缺陷型微生物菌株及筛选高酶活甲醇脱氢酶

ATP是细胞内的另一种能量载体，当将电子传递链中的铁-卟啉人工替换为锌-卟啉后，由于锌-卟啉不能进行电子传递，导致ATP合成受阻，从而得到一个ATP营养缺陷型菌株，该菌株可以用来进行血红素合成酶的定向进化。当野生型细胞加上锌卟啉之后生长就会变弱，若突变体库中存在血红素合成酶活性较高的突变体时，就会因为合成较多的ATP而导致生长加快，从而实现血红素合成酶的定向进化。同样的，通过建库和筛选，显著提高了血红素合成酶的活性。

建立ATP营养缺陷型微生物菌株及其在筛选高酶活血红素合成酶的原理示意图

专家介绍

王钰 研究员

王钰，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，博士生导师，国家自然科学基金优秀青年基金获得者；入选《麻省理工科技评论》亚太区“35岁以下科技创新35人”、“伦世仪教育基金”杰出青年学者、日本生物工学会DaSilva Award奖等荣誉。Green Carbon青年编委，兼任中国生物工程学会青年工作委员会和一碳生物技术专业委员会、中国遗传学会微生物遗传专业委员会、中国化工学会生物化工青年委员会委员，以及中国科学院青年创新促进会生命分会副会长等职务。主要从事工业微生物的基因编辑育种和碳一原料的生物转化研究，主持国家自然科学基金委优青项目、中国科学院关键核心技术攻坚先导专项等项目，以第一或通讯作者在Nat. Commun.、Nucleic Acids Res.、Trends Biotechnol.、Metab. Eng.等期刊发表论文40余篇，申请专利40余项。

 原文链接 

王钰研究员与Green Carbon丨用于生物合成元件进化的工程微生物底盘设计

Green Carbon

期刊官网：Green Carbon官网

投稿网址：Green Carbon投稿

公众号：Green Carbon公众号

知乎：Green Carbon知乎主页

科学网：Green Carbon科学网主页

微博：Green Carbon微博主页