近日，《表型组学（英文）》（Phenomics）在线发表了复旦大学附属儿科医院黄国英、盛伟团队题为“MST1R gene variants predispose individuals to Tetralogy of Fallot”的研究论文。

该研究通过对10个法洛四联症（TOF）家系和50例散发性TOF患者进行全外显子测序，发现在一个家族中有两个TOF后代携带MST1R基因的隐性纯合错义突变（c.T2009G:p.V670G）。针对MST1R基因的靶向测序显示，与gnomADv2中东亚人群相比，417例TOF患者中罕见变异显著富集。缺失MST1R的人诱导多能干细胞虽保持正常多能性，但分化后形成的心肌细胞功能异常。研究结果表明，MST1R可能在心脏分化中发挥关键作用，其遗传变异与TOF的发生密切相关。

文末点击“阅读全文”可在线阅读文章。

扫描二维码 | 下载PDF原文

论文DOI链接：

https://doi.org/10.1007/s43657-024-00175-9

论文引用格式：

Feng, Z., Huang, X., Gao, Y. et al. MST1R Gene Variants Predispose Individuals to Tetralogy of Fallot. Phenomics 4, 548–561 (2024). https://doi.org/10.1007/s43657-024-00175-9

研究背景

法洛四联症（TOF）是一种复杂的先天性心脏畸形，其主要特征包括肺动脉狭窄、主动脉骑跨、室间隔缺损以及右心室肥厚。作为最常见的紫绀性先天性心脏病之一，TOF的部分病例即使经过手术治疗后预后仍不理想，给家庭和社会带来了沉重的经济和精神负担。因此，深入探究TOF的基因型与临床表型之间的关系具有重要的临床意义。遗传因素在TOF的发生中发挥着重要作用，其中约20%的患者与特定的遗传综合征有关。部分单基因缺陷，如FLT4、NOTCH1及一些VEGF通路基因的变异，已在TOF患者中被发现，与疾病的发生密切相关。

MST1R基因（又称RON）作为巨噬细胞刺激因子的受体，在胚胎发育、细胞存活以及肿瘤发生等生物过程中发挥着重要作用。然而，其在TOF发病中的具体作用尚未有相关报道。研究团队对10个TOF家系和50例散发性TOF患者进行了全外显子组测序，结果在MST1R基因发现一个隐性纯合错义变异。随后在对417例散发性TOF患者进行靶向测序后，结果显示TOF患者中MST1R罕见变异显著富集。进一步通过构建MST1R缺失的人诱导多能干细胞模型，并开展心肌细胞定向分化实验，发现缺失MST1R的细胞无法分化为正常功能的心肌细胞。

研究结果

该研究首先对10个TOF家系和50例散发性TOF患者进行了全外显子组测序。结果显示，在某一TOF家系中，两名患者均携带MST1R基因的同一隐性纯合错义突变（NM_002447.4:c.2009T>G，dbSNP: rs201024956），该突变位于Val670位点（图1a和1b）。依据ACMG标准，该变异被评估为可能致病。序列分析显示，p.Val670在多种物种中高度保守（图1c）；同时，利用AlphaFold预测MST1R蛋白结构的结果显示，670位缬氨酸的β碳与688位蛋硫氨酸的ε碳之间距离仅为4.7Å（<5Å），暗示这两个残基间可能通过疏水相互作用维持蛋白结构（图1d）。

图1 TOF家系中鉴定出MST1R基因纯合突变

随后，采用免疫组织化学方法检测TOF患者与健康对照心脏组织中MST1R蛋白的表达情况，结果表明TOF患者心脏组织中MST1R蛋白表达显著低于健康对照组（图2）。此外，对417例TOF患者进行了MST1R基因的靶向测序，共筛选出九个致病性杂合变异，并与东亚正常人群数据库的参考数据进行统计比较，结果显示MST1R变异与TOF的发生具有显著相关性（Fisher精确检验，p=0.0005，见表1）。

图2 TOF患者心脏组织中MST1R蛋白表达降低

表1 散发性TOF患者与健康对照中罕见变异的比较

为探讨MST1R在心脏发育中的作用，本研究构建了MST1R敲除（KO）的人诱导多能干细胞（hiPSCs）系。随后，对分化至第15天的MST1R KO心肌细胞进行免疫荧光染色，结果显示，与野生型心肌细胞相比，KO细胞的肌节结构明显紊乱，且异常肌节细胞的比例显著增加（图3a、3b和3c）。透射电子显微镜观察进一步表明，分化15天的MST1R KO心肌细胞存在肌节结构紊乱及Z线缺失（图3d）；与此同时，RT-qPCR检测结果显示，KO细胞中ACTN2、MYH7、MYL7和TNNT2等肌纤维结构及收缩调控基因的表达水平显著降低（图3e）。

图3  MST1R缺失心肌细胞的表型特征

对分化15天的hiPSC心肌细胞进行转录组测序和功能富集分析，共鉴定出672个显著上调基因和577个显著下调基因，并通过火山图直观展示了这些差异表达情况（图4a）。GO分析结果显示，这些差异基因主要富集在肌肉收缩、肌肉组织发育和心脏收缩等生物过程中（图4b）；KEGG分析揭示，与钙信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号传导及心肌收缩相关的通路均发生了显著改变（图4c）。热图则展示了这些生物过程和通路中差异表达基因的分布情况（图4d）。综合上述结果，可见MST1R缺失导致hiPSC心肌细胞分化异常（图4e和图4f）。

图4 hiPSCs分化至15天心肌细胞的RNA-seq分析

研究结论

本研究对10个TOF家系和50例散发性TOF患者进行了全外显子组测序，鉴定出MST1R基因的一个隐性纯合错义突变。在对417例散发性TOF患者进行靶向测序后发现，MST1R基因与TOF的发生存在显著关联（Fisher精确检验P = 0.0005）。构建了MST1R基因缺失的人诱导多能干细胞（hiPSCs），结果显示，MST1R基因敲除的hiPSCs无法分化为正常的心肌细胞。研究结果扩展了对TOF相关遗传变异的认识，并揭示了MST1R在心脏分化中的潜在新作用。

复旦大学附属儿科医院黄国英教授和盛伟研究员为共同通讯作者，复旦大学附属儿科医院冯志宇博士和复旦大学附属儿科医院厦门医院黄湘晖主任护师为共同第一作者。本工作得到了以下项目的资助：国家重点研发计划（项目编号2021YFC2701000和2016YFC1000500）、国家自然科学基金（项目编号82270312、82200264和82370309）、上海自然科学基金科技创新行动计划（21ZR1409900）以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（项目编号2019-I2M-5-002）。

Abstract

Tetralogy of Fallot (TOF) is the most common cyanotic congenital heart malformation. While a few susceptibility genes for TOF have been identified, research on the genetic basis of TOF is limited. The MST1R gene encodes the macrophage-stimulating protein receptor with tyrosine phosphatase activity that is involved in immune defense. In this study, we performed whole-exome sequencing on 10 TOF families and 50 sporadic TOF patients and identified a recessive homozygous missense mutation in MST1R, c.T2009G:p.V670G, in two offspring with TOF in a single family. Targeted sequencing of the MST1R gene showed enrichment for rare variants in 417 TOF patients compared with East Asians in gnomADv2. MST1R-deficient human induced pluripotent stem cells maintained normal pluripotency but differentiated into non-functional cardiomyocytes. Taken together, our findings indicate that MST1R may play a critical role in cardiac differentiation and genetic variations in MST1R may be associated with the pathogenesis of TOF.

通讯作者

黄国英，复旦大学附属儿科医院教授，博士生导师，国家重点研发计划项目首席专家。现任复旦大学上海医学院儿科学系主任，国家新生儿先心病筛查项目管理办公室主任，上海市出生缺陷防治重点实验室主任；兼任中国医师协会儿科医师分会会长，中华医学会罕见病分会副主任委员，中华儿科学会副主任委员/心血管学组组长，Pediatric Medicine主编，中华儿科杂志副总编。长期从事儿童遗传性心血管罕见病的病因机制及早期干预策略研究；承担国家重点研发计划、自然科学基金重点项目、面上项目等重要课题20余项, 在Lancet, Annals of Internal Medicines, Circulation 等国际权威期刊发表论文500多篇；主编/副主编专著教材32部;专利等知识产权23项，获得谈家桢临床医学奖、上海市科技进步一等奖、宋庆龄儿科医学奖、上海市市长质量奖等奖项。

盛伟，复旦大学附属儿科医院研究员，博士生导师。现任职于复旦大学附属儿科医院儿科研究院，上海市出生缺陷防治重点实验室；兼任中华医学会心血管组基础组副组长，中国优生科学协会环境与生殖健康分会副主任委员，全国卫生产业企业管理协会精准医疗分会常务理事，中国优生科学协会儿科临床与保健分会委员，中国医疗保健国际交流促进会遗传与发育疾病学分会委员、中国药理学会药物基因组学专业委员会专家委员，上海市浦东新区转化医学联盟专家委员会委员和中国科学技术史学会第九，十届理事会理事。主要从事儿童遗传性心血管罕见病的病因机制及早期干预策略研究；主持／参加国家自然科学基金面上项目，科技部外专项目，国家重点研发计划项目项等项多项国家级科研项目；在国际刊物上发表SCI论文60余篇。