氨硼烷在混合相钛酸盐纳米晶体中的纳米限域作用可实现持续的氢气释放，用于糖尿病性骨修复

尽管氨硼烷（AB）在氢气（H₂）疗法中具有潜在应用，但由于其水解速率难以控制且可能具有细胞毒性，其生物医学应用受到限制。现有的基于材料的递送策略主要关注加速氨硼烷水解以产生氢气，这进一步加剧了上述问题。本文报道了一种新的纳米限域策略，即通过独特的单端锚定对接（OEAD）机制，将氨硼烷负载在植入物表面的缺氧混合相钛酸盐纳米晶体上。这种纳米限域策略有效地限制了氨硼烷分子的释放，仅允许水分子渗透到层间空间，从而实现缓慢水解和持续的氢气释放。这显著延长了氢气释放的持续时间，并有效地避免了在炎症微环境中氨硼烷与过氧化氢（H₂O₂）相互作用所产生的细胞毒性。体外和体内实验表明，植入物表面持续释放的氢气有效地缓解了与糖尿病相关的氧化应激，并且与镁离子（Mg²⁺）的释放相结合，协同促进了有神经支配的血管化骨再生。

 1. 引言

慢性炎症是许多慢性疾病发病机制的基础，并且是组织损伤有效愈合的主要障碍[1, 2]。在组织再生中，特别是在慢性炎症条件下，一个关键挑战在于有效地调节炎症，同时促进组织再生。尽管氢气（H₂）具有抗炎和抗氧化功能[3, 4]，但其与生物材料整合并用于治疗如关节炎和动脉粥样硬化等慢性炎症疾病的潜力才刚刚开始被探索[5, 6]。与其他涉及药物或各种化合物的治疗方法相比，氢气疗法可能更有效且副作用更少，因为氢气能够快速穿透细胞膜并选择性地中和有害的自由基（如羟基自由基（•OH）），而不干扰生理上必需的自由基。

在组织修复中，临床上最具挑战性的场景之一是糖尿病患者的骨再生[7, 8]。与非糖尿病患者相比，糖尿病骨缺损的治疗失败率要高得多[7]。在糖尿病条件下，慢性炎症极大地增加了细胞内的氧化应激水平，同时伴随的神经病变和血管病变显著增加了骨科植入物失败的风险[7, 9, 10]。在这些极端情况下，植入物周围的骨再生几乎无法实现。氢气作为一种新型治疗剂，在清除活性氧物种和促进神经修复方面显示出巨大潜力[11]。这使其成为克服由糖尿病等慢性疾病引起的组织修复障碍的有前途的治疗策略，特别是在糖尿病骨缺损等具有挑战性的病例中[7, 8]。目前将氢气输送到体内用于治疗的方法，包括吸入氢气、摄入富氢水和局部注射富氢溶液，都存在关键的局限性。这些方法无法实现实现持续治疗效果所必需的局部和持续的氢气输送，并且将其与植入物整合以增强骨修复被证明极为困难。虽然生物材料介导的氢气输送系统提供了一种潜在的解决方案[12-16]，但关键挑战阻碍了其实际应用，例如控制氢气释放速率的能力下降以及难以实现与植入物表面的牢固结合[17-19]。不受控制或快速的氢气释放会导致气泡形成，从而造成组织损伤并阻碍骨整合。同时，生物医学植入物上的涂层分层会导致松动和失效，但确保释放氢气的材料与植入物表面具有强粘附性是一个重大的技术难题。因此，开发能够从植入物表面持续释放氢气的新型涂层系统对于促进骨整合和组织再生至关重要，特别是在糖尿病条件下。

尽管氨硼烷（AB）因其高储氢能力和快速释放能力在能源应用方面具有吸引力，且金属纳米催化剂和纳米限域材料可增强这些能力[20-22]，但目前的方法导致氢气快速释放，这完全不适合生物系统。在体内，快速产生的氢气可能会由于气体栓塞、血流中断和组织缺血而导致严重后果[23]。为了实现其在再生医学等治疗应用中的应用，实现对氢气释放的精确控制对于确保一致的局部治疗浓度至关重要。这需要一种与能源应用中所采用的策略截然不同的氨硼烷水解方法。此外，氨硼烷的还原特性在以过氧化氢水平升高为特征的炎症环境中带来了生物相容性挑战。必须仔细考虑氨硼烷与过氧化氢之间发生细胞毒性反应的可能性。因此，成功利用氨硼烷的治疗潜力需要一些策略，这些策略不仅要控制其氢气释放动力学，还要解决其在炎症环境中的生物相容性问题。

本研究旨在应对这些同时存在的挑战，并释放氨硼烷在治疗应用中的潜力，重点关注复杂糖尿病条件下的骨再生。通过利用氨硼烷与缺氧混合相钛酸盐之间的 -B-H-O- 键合，我们实现了氨硼烷的单端锚定对接（OEAD），促进了与生理条件兼容的温和水解过程。通过将氨硼烷限制在钛酸盐晶体的纳米级层间空间内，该方法可防止氨硼烷以分子形式释放，仅允许其与渗透到该空间的水分子发生反应。该系统不仅确保了持续的氢气释放，还避免了在炎症组织微环境中氨硼烷与过氧化氢之间潜在的有害相互作用。作为概念验证，我们将这种释放氢气的混合钛酸盐系统应用于钛骨植入物的表面，并在糖尿病骨缺损模型中进行了测试。鉴于镁离子（Mg²⁺）具有神经再生潜力[24]，我们将其预加载到钛酸盐晶体的层间空间内，使得镁离子能够与氢气协同作用，在减轻细胞氧化应激的同时促进神经血管网络的再生。通过这种创新的表面设计，我们显著增强了钛骨植入物在糖尿病条件下的骨整合能力（示意图1）。本研究为扩展氨硼烷的生物医学应用提供了有力证据，并为解决治疗糖尿病骨缺损的挑战提供了一种新的治疗策略。

示意图1：展示了 AB@HyPT-Mg 通过持续释放氢气和控制镁离子释放，协同促进有神经支配的血管化骨再生的瀑布式促进效果的示意图。

 2. 结果

 2.1 混合相钛酸盐晶体表面（HyPT）与氨硼烷负载

钛酸钠以其出色的离子交换能力而闻名，这使其成为在层间区域嵌入阳离子药物的理想候选材料[25]。然而，尚未探索使用钛酸盐负载氨硼烷的潜力。在钛合金表面形成钛酸钠最直接的方法是通过与钛（TC4-H）发生碱性反应。在本研究中，我们最初合成了钛酸钠并将氨硼烷嵌入其层间。然而，该系统中氢气的释放仅能持续三天（支持信息图S1）。

为了实现氢气的持续、长期释放，我们开发了一种新型复合涂层，该涂层由钛酸钙和少量氧化钛组成。这种复合材料是通过等离子喷涂制备的，并作为碱性水热前驱体（HyP，支持信息图S2）。与传统方法不同，这种方法形成的涂层具有独特的混合相钛酸盐。如图1a和支持信息图S3所示，预制的水热前驱体在水热过程中首先发生纳米结晶，主要形成棒状晶体。随后形成薄的圆盘状晶体，这些晶体交织在棒状纳米晶体簇之间。随着反应时间的延长，微观圆盘逐渐演变成具有明显六边形的片状纳米晶体。这两种不同的纳米晶体形态（棒状和片状）相互交织，形成了分层的微/纳米结构表面（图1b）。有趣的是，棒状和片状晶体都呈现出“核壳”结构，其中壳层和核层分别呈现非晶态和晶态外观（图1c；支持信息图S4a）。能量色散X射线（EDX）图谱显示，壳层中钠含量较高，钛含量较低但显著，而核层含有钙、钠和钛，其中钙是主要元素（图1d；支持信息图S4b）。X射线衍射（XRD）分析证实了涂层中存在混合相，包括钛酸钙（CaTiO₃）和钛酸钠（主要是Na₄Ti₁₂O₂₆），这与水热处理前主要由钛酸钙和氧化钛组成的样品成分（HyP）不同（图1e）。选区电子衍射（SAED）晶体学分析（支持信息表S1）证实了这些相的存在，并验证了XRD结果。样品的额外横截面EDX图谱也证明了混合相的组成（支持信息图S5）。这些发现表明，由于特殊设计的水热前驱体以及NaOH对钛酸钙的渗透/相变作用，形成了具有独特核壳结构和混合相组成的钛酸盐纳米晶体。为了评估涂层在生理条件下的抗降解能力，我们将样品浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中1个月和5个月。在每个时间点后进行的扫描电子显微镜（SEM）分析（支持信息图S6）显示，涂层在整个浸泡期间保持了其原始微观结构，证明了其在生理环境中强大的抗降解能力。

图1：AB@HyPT-Mg的构建与表征。a）HyPT特征晶体形态的形成过程示意图；b）HyPT的扫描电子显微镜（SEM）图像；c、d）处理后形成的棒状晶体的透射电子显微镜（TEM）图像、电子衍射和EDX图谱；e）HyPT和HyP的XRD图谱；f、g）HyP、HyPT的O1s XPS核心能级谱的解卷积；h）HyPT-Mg（负载Mg²⁺的HyPT）和AB@HyPT-Mg（负载Mg²⁺和AB的HyPT）的制备过程示意图；i）HyPT-Mg的O1s XPS核心能级谱的解卷积；j）HyPT、HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg的XPS分析；k）HyPT-Mg、AB@HyPT-Mg和AB的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析。

为了更好地理解纳米晶体的形成过程，我们研究了各种参数对结晶的影响，特别关注温度、NaOH浓度和碱性水热处理的持续时间，以及它们对两种不同纳米晶体形态发展的影响（支持信息图S3、S7和S8）。结果表明，混合相钛酸盐表面分层结构的形成需要对一系列水热参数进行精细控制。值得注意的是，本研究中制备的水热前驱体（钛酸钙/氧化钛复合涂层）表现出显著的缺氧特性（氧空位，Ov）（图1f），这是由于等离子喷涂中熔融陶瓷粉末独特的快速凝固特性[26]。从O 1s X射线光电子能谱（XPS）分析可以看出，HyPT组存在大量氧空位，在约530.6、531.9和532.8 eV处显示出三个典型的XPS峰，分别归因于晶格氧、氧空位和表面吸附的氧物种（图1g）。同时，使用传统水热方法制备的对照组（TC4-H）未显示氧空位的存在（支持信息图S9）。

接下来，依次将Mg²⁺和AB负载到HyPT上，构建了能够同时释放Mg²⁺和H₂的植入物表面（AB@HyPT-Mg）（图1h），而仅负载Mg²⁺（HyPT-Mg）或仅负载AB（AB@HyPT）的表面作为对照。如支持信息图S10所示，Mg²⁺或AB的负载没有改变HyPT的形态或涂层的晶体结构，XRD分析也证明了这一点。AB@HyPT-Mg的EDX图谱显示，表面普遍存在Mg、B和N（支持信息图S11）。然而，Mg²⁺的负载导致XRD峰向高角度移动，这表明由于Mg²⁺的尺寸比Na⁺小，晶面间距减小。相反，AB的负载导致XRD峰向低角度移动，表明AB成功嵌入（支持信息图S12）。XPS数据还表明，Mg²⁺的负载不影响HyPT中的氧空位（图1i），并且AB@HyPT-Mg组中存在B、N和Mg（图1j）。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表明，AB@HyPT-Mg组中存在AB特有的B─H键，而HyPT-Mg组中不存在该键（图1k）。这些结果证实了Mg²⁺和AB成功负载到HyPT混合相涂层中。

 2.2 氨硼烷的单端锚定对接（OEAD）：生理适应性温和水解和持续的氢气释放特性

在钛样品上成功构建了负载氨硼烷的混合相钛酸盐晶体表面涂层后，我们测试了同时负载Mg²⁺（AB@HyPT-Mg）和未负载Mg²⁺（AB@HyPT）组的氢气释放基本功能。如图2a所示，溶解氢测试表明，两组都能持续释放氢气约7天，显著长于负载在传统钛酸钠中的氨硼烷的3天释放时间。此外，使用气相色谱法在酸性（pH 5.6）、正常生理（pH 7.4）、碱性（pH 8.6）和高血糖（50 mM，模拟糖尿病环境）条件下分析了AB@HyPT-Mg的氢气释放情况。结果（支持信息图S13）清楚地表明，AB@HyPT-Mg植入物在正常、碱性和高血糖条件下至少能持续释放氢气11天，并且在这些条件下观察到的释放曲线几乎相同。这一关键发现表明，碱性条件和高血糖环境都不会显著影响AB@HyPT-Mg的氢气释放行为，表明其性能稳定，适合用于糖尿病性骨修复。在酸性条件下，释放曲线明显不同，释放持续时间显著缩短，约为3天。酸性条件下的加速释放可能是由于质子的可用性增加，促进了氨硼烷的水解[28]。此外，观察到在PBS中的游离氨硼烷在头两天内释放出所有氢气，第一天氢气浓度急剧上升至8522.95 ppm（支持信息图S14）。这种突发水解导致pH值明显变化，这可能是由于氨硼烷水解产生的大量有毒副产物NH₄⁺的释放（支持信息图S15）。相比之下，AB@HyPT组持续且可控的氢气释放并未导致pH值变化（支持信息图S15），这对生物应用是有益的。对于同时负载AB和Mg²⁺的AB@HyPT-Mg样品，Mg²⁺的释放可以持续超过48小时，如图2b所示。这种释放模式与Mg²⁺的生理功能一致，Mg²⁺在促进早期骨再生方面发挥作用，后期可能具有抑制作用[28-30]。

图2：氨硼烷的负载机制以及HyPT氢气释放模式的表征。a）使用溶解氢检测器连续7天检测AB@TC4-H、AB@HyPT和AB@HyPT-Mg的每日氢气释放量；b）使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测量HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg的每日Mg²⁺释放量；c）使用ICP-OES连续7天测量AB@HyPT和AB@HyPT-Mg的每日B释放量；d、e）AB@TC4-H和AB@HyPT-Mg在氨硼烷水解前后N/Ti和B/Ti比率变化的XPS分析；f、g）AB@HyPT-Mg在氨硼烷水解前后N1s和B1s XPS光谱分析；h）AB@TC4-H和AB@HyPT-Mg在氨硼烷水解前后O/Ti比率变化的XPS分析；i、j）在有氧空位（Ov）和无氧空位条件下，AB分子以及水解产物硼酸盐在HyPT中的相互作用（i）和吸附能（j）的第一性原理模拟计算；k）AB@HyPT的氢气释放过程模拟图：水分子进入HyPT的层间，导致氨硼烷水解并释放氢气，而硼酸盐保留在层间。

我们观察到，在氨硼烷水解过程中，对照组（AB@TC4-H）和实验组（AB@HyPT、AB@HyPT-Mg）之间硼（B）的释放行为存在显著差异。AB@TC4-H对照组持续释放硼长达5天（支持信息图S16），这与其氢气释放曲线一致（支持信息图S1），而AB@HyPT和AB@HyPT-Mg组的硼和氢气释放模式明显不同，尽管氢气持续释放6天，但仅在前两天有明显的硼释放（图2c）。实验组中硼的早期释放可能归因于涂层中存在的痕量氧化钛与NaOH之间的反应，导致形成与TC4-H组相同的钛酸钠。实验组和对照组之间硼释放模式的不同表明，HyPT和TC4-H中氨硼烷水解产生氢气的机制可能不同。

进行了全面的XPS分析，以阐明实验组和对照组样品中氨硼烷的水解机制（支持信息图S17和S18）。比较水解前后的XPS光谱，AB@TC4-H组在氨硼烷水解后N/Ti和B/Ti比率显著降低（图2d、e），而AB@HyPT-Mg组N/Ti比率降低，但B/Ti比率基本不变（图2d、e）。对高分辨率N和B光谱的分析证实，AB@HyPT-Mg组在氨硼烷水解后N含量显著降低，而B含量相对稳定（图2f、g）。相比之下，AB@TC4-H的N和B含量均显著降低（支持信息图S19）。这些结果表明，对于AB@HyPT-Mg，氨硼烷水解后B仍保留在其层间结构中。考虑到氨硼烷水解生成含氧硼酸，进一步分析水解前后O/Ti比率的变化表明，AB@TC4-H组在氢气释放前后O/Ti比率保持稳定，而AB@HyPT-Mg组的O/Ti比率显著增加（图2h）。

基于这些结果，我们推断AB@HyPT-Mg中氨硼烷的B可能与钛酸盐层间强烈结合，从而防止水解后B的释放。为了验证这一假设，我们利用第一性原理计算模拟了混合相钛酸盐（HyPT系统）对氨硼烷及其水解产物（硼酸盐）的吸附能力（图2i），同时研究了材料中氧空位对吸附能的影响。结果表明，与AB@TC4-H相比，AB@HyPT组具有更高的吸附能，这表明氨硼烷分子更难从HyPT层间解吸。此外，氧空位的存在导致材料内氨硼烷的吸附能更高（图2j）。更重要的是，HyPT对氨硼烷的降解产物硼酸盐也具有很强的吸附能力，特别是在有氧空位的条件下，吸附能达到7.84 eV（图2j）。这些计算模拟结果与氨硼烷在HyPT和对照组中具有不同水解模式的推断一致，并可用于解释AB@HyPT-Mg中氨硼烷水解前后B/Ti比率以及B释放量变化不明显的现象（图2c–h）。结合实验和计算结果，我们提出，由于HyPT对氨硼烷分子的强吸附作用，负载后氨硼烷无法以分子形式从HyPT层间释放。相反，需要水分子进入层间空间才能使氨硼烷发生水解，从而缓慢释放氢气（图2k）。与AB@HyPT-Mg相比，对照组（AB@TC4-H）对氨硼烷分子的吸附较弱，允许氨硼烷以分子形式释放并在材料层外发生水解。这也解释了XPS分析显示的对照组水解后N/Ti和B/Ti比率显著降低，以及ICP-OES检测到的B持续释放行为（图2d、e、h；支持信息图S16和S19）。

 2.3 活性氧清除能力评估

在高糖条件下，以钛合金（TC4）作为对照，使用骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和施万细胞（SWs）评估AB@HyPT-Mg表面的细胞相容性。通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜观察确认，细胞铺展（细胞活性和功能的关键指标）在测试材料上的BMSCs中表现正常（支持信息图S20a、b）。使用CCK-8法在第3天和第7天评估细胞活力（支持信息图S20c），结果表明AB@HyPT-Mg材料对所测试的任何细胞类型的活力均无负面影响，显示出优异的体外细胞相容性。为了确定释放氢气的表面是否可以减轻神经细胞和内皮细胞中的氧化应激，使用DCFH-DA探针染色检测活性氧（ROS）水平。值得注意的是，如图3a所示，在AB@HyPT和AB@HyPT-Mg样品上生长的SWs和HUVECs中，细胞内ROS水平显著降低。此外，用过氧化氢刺激SWs和HUVECs以诱导高氧化应激状态，然后与各种样品组共培养。4小时后，使用流式细胞术检测细胞内的ROS水平。用过氧化氢处理导致对照组细胞出现高氧化应激。同时，与释放氢气的组（AB@HyPT和AB@HyPT-Mg）共培养的细胞中ROS水平显著降低，显著降至未用过氧化氢刺激的空白组的低水平（图3b、c）。这些发现表明，我们构建的释放氢气的表面具有卓越的氧化应激清除能力。

图3：AB@HyPT-Mg的活性氧清除能力评估。a）使用DCFH-DA探针测试与不同材料共培养的SWs和HUVECs中细胞内ROS的清除情况；b、c）使用流式细胞术检测各组的ROS水平。用1.5 mM过氧化氢处理SWs和HUVECs 1小时，然后与不同材料组共培养。4小时后，使用CellROX Green流式细胞术检测试剂盒对细胞进行染色并进行流式细胞术分析。空白组：未用过氧化氢处理。对照组：用过氧化氢处理且不与任何材料共培养。d）通过qPCR评估与不同材料共培养的SWs和HUVECs中与ROS清除相关的关键基因的表达。所有细胞均在高糖条件下（葡萄糖：50 mM）培养以模拟糖尿病环境。实验独立重复三次。所有数据均以平均值±标准差表示，n = 3。使用双侧学生t检验计算两组之间的统计差异。ns：无显著性，*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001，p < 0.0001。

为了研究释放氢气的表面减轻氧化应激的信号通路，评估了SWs和HUVECs中与氧化应激降低相关的基因（包括HO-1、过氧化氢酶、NQO1和GCLC）的表达[31]。与TC4组相比，释放氢气的组（AB@HyPT和AB@HyPT-Mg）在两种细胞类型中均显示出这些基因的显著上调（图3d）。有趣的是，在HUVECs中，与TC4组相比，所有材料配方均增强了这些基因的表达，而在SWs中，释放氢气的组比不释放氢气的材料组表现更好。我们假设，在神经细胞中，这些基因的表达升高更依赖于氢气的存在，而在血管内皮细胞中，基因表达可能主要受材料配方的影响。总体而言，这些结果表明，氢气释放不仅可以中和细胞内的氧化应激，还可以刺激参与氧化应激清除通路的基因表达，从而增强细胞对抗外部氧化应激的能力。

 2.4 AB@HyPT-Mg在糖尿病条件下对神经支配和血管化的促进作用及相关生物学机制

使用体外细胞模型，我们详细研究了释放氢气的表面在高糖条件下对神经支配和血管化的影响，以模拟糖尿病环境。首先，将SWs在不同材料组上培养2天，以探测其与神经发育相关基因的表达模式。与其他组相比，释放氢气的组（AB@HyPT和AB@HyPT-Mg）通常会增加对神经支配重要的基因（NGF、BDNF、GDNF、S100）的表达，同时降低神经支配抑制标志物（NCAM）的表达（图4a）。免疫荧光成像进一步显示，与在TC4对照组上生长的细胞相比，释放氢气的材料，特别是AB@HyPT-Mg，显著促进了SWs中神经再生标志物S100β蛋白的表达（图4b、c）。此外，AB@HyPT-Mg引发了神经元细胞发育的早期形态学变化，表现为细胞体增大和树突结构的出现，这些变化在第1天首次可见，并在第3天和第7天变得更加明显（支持信息图S21）。AB@HyPT作为另一种释放氢气但不含Mg²⁺的材料，也促进了神经元分化，但与AB@HyPT-Mg相比，其影响在早期时间点不太显著。不含Mg²⁺和氢气的组以及钛对照组未显示出这些效果。这些发现表明，释放氢气的材料，特别是强化了Mg²⁺的材料，对神经再生和神经支配过程具有强大的促进作用。

图4：AB@HyPT-Mg促进体外神经支配的能力。a）通过qPCR检测在不同材料上培养2天的SWs中与神经再生相关的关键基因的表达；b、c）免疫荧光成像和定量分析，检查不同材料对SWs中S100β蛋白表达水平的影响；d、e）对转录组测序数据中的差异基因进行KEGG富集分析，显示基因变化数量最多的前10条KEGG通路；f、g）对转录组测序数据中的差异基因进行GSEA富集分析，用于组间比较。所有细胞均在高糖条件下（葡萄糖：50 mM）培养以模拟糖尿病环境。实验（a、b）独立重复三次。所有数据（a、b）均以平均值±标准差表示，n = 3。使用双侧学生t检验计算两组之间的统计差异。ns：无显著性，*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001。

随后，将HUVECs在不同材料组上培养2天，以评估它们支持血管生成的能力。在大多数情况下，释放氢气的材料（AB@HyPT和AB@HyPT-Mg）显著上调了对刺激血管生长重要的基因表达（FGF2、HIF1α、eNOS、KDR），同时下调了阻碍该过程的基因（Norch1）（支持信息图S22a）。此外，还检查了这些材料对M2巨噬细胞极化的影响，M2巨噬细胞极化在血管形成中起关键作用。值得注意的是，富含AB和Mg²⁺的AB@HyPT-Mg组观察到M2极化标志物升高（支持信息图S22b）和血管生成因子的分泌增加（支持信息图S22c），突出了Mg²⁺和氢气释放之间的协同相互作用。在高糖条件下，用释放氢气的表面处理的内皮细胞和巨噬细胞中血管生成相关基因的表达增加，表明这些材料具有促进组织再生的能力，即使在糖尿病环境中也是如此。因此，将氢气释放与参与组织再生的特定离子相结合，可能为糖尿病性骨修复等具有挑战性的场景中的组织愈合提供一种创新的治疗方法。

为了阐明AB@HyPT-Mg促进神经支配的分子机制，对暴露于不同材料2天的SWs进行了转录组测序分析，并观察到不同材料组之间的差异基因表达（支持信息图S23）。基因本体论（GO）分析显示，AB@HyPT-Mg显著上调了与神经功能相关的基因，这与上述释放氢气的材料促进神经再生的观察结果一致（图4a、b；支持信息图S21和S24）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析进一步证实，释放氢气的材料调节了神经通路和免疫系统反应。AB@HyPT-Mg和AB@HyPT之间的比较分析表明，氢气释放可以调节由Mg²⁺介导的分子过程，这意味着含Mg²⁺组的功能可能受到氢气的影响（图4d；支持信息图S25）。具体而言，在没有H₂的情况下，Mg²⁺主要通过调节趋化因子产生、神经肌肉接头处的突触组装和神经递质水平等生物学过程来促进神经再生（支持信息图S24f和S25d）。在存在H₂的情况下，Mg²⁺的作用转向调节翻译、磷脂生物合成、定位和细胞分化（支持信息图S24c和S25b），这表明H₂影响由Mg²⁺调节的通路，以实现促进骨再生的协同效应。这些发现突出了Mg²⁺在不同条件下对细胞活动的不同调节作用，并为进一步研究Mg²⁺和H₂之间的协同机制提供了方向。AB@HyPT-Mg同时释放H₂和Mg²⁺导致参与神经调节和细胞代谢的基因富集，强调了对细胞活动和神经修复过程的协同影响（图4e；支持信息图S25）。基因集富集分析（GSEA）表明，与不释放氢气的对应组（HyPT）相比，释放氢气的组（AB@HyPT）中参与氧化应激清除的基因富集程度更高（图4f；支持信息图S26a）。同时，与HyPT相比，AB@HyPT-Mg组中与神经系统相关的基因富集，进一步突出了H₂和Mg²⁺释放对神经功能的综合影响（图4g；支持信息图S26b）。

使用多种体外细胞模型，工程化的释放氢气的表面显示出增强神经支配和血管化的能力，并阐明了在糖尿病背景下氢气影响神经细胞的机制。此外，上述发现揭示了H₂和Mg²⁺增强神经再生的协同机制，为AB@HyPT-Mg在受益于改善神经支配的组织修复中的应用奠定了基础。

 2.5 AB@HyPT-Mg通过促进神经支配和血管化促进体外成骨作用

为了将AB@HyPT-Mg应用于糖尿病性骨修复这一具有挑战性的场景，我们首先评估了其体外成骨能力，并通过共培养策略探索了神经血管网络在骨再生中的作用。将BMSCs在不同类型的植入物表面上生长，与SWs（图5a）或HUVECs（图5b）在transwell中共培养3天（与SWs共培养）或7天（与HUVECs共培养），在没有SWs或HUVECs的BMSCs单培养中，在释放氢气的样品上生长3天的细胞中，成骨标志物的表达没有显著增加，并且在某些情况下观察到表达下调（图5c）。当与SWs共培养时，在HyPT、HyPT-Mg、AB@HyPT和AB@HyPT-Mg表面上的BMSCs显示出成骨基因表达的显著上调（Runx2、OSX、BMP2、BSP），释放氢气的组通常表现出最显著的效果（图5c）。这些结果表明，释放氢气的表面可以通过其对神经再生的影响来促进成骨作用，特别是在高糖条件下。相反，当BMSCs在不同表面存在下与HUVECs共培养时，研究结果并未显示出对成骨分化的显著促进作用（图5d），这表明神经细胞在调节生物材料诱导的骨再生方面比血管细胞具有更关键的作用。

图5：AB@HyPT-Mg通过促进神经支配和血管化来促进体外成骨的能力。a）SWs与BMSCs在不同材料上共培养的示意图；b）HUVECs与BMSCs在不同材料上共培养的示意图；c）在高糖成骨培养基中，通过qPCR检测不同材料上单培养或与SWs共培养3天的BMSCs中成骨基因的表达；d）在高糖成骨培养基中，通过qPCR检测不同材料上单培养或与HUVECs共培养7天的BMSCs中成骨基因的表达；e）在高糖成骨培养基中，通过qPCR检测不同材料上单培养或与SWs共培养3天的BMSCs中神经因子受体的基因表达；f）示意图展示了我们设计的释放氢气的表面如何促进BMSCs的成骨分化，首先是恢复神经细胞的正常功能，并促进其分泌神经营养因子。这些因子随后通过BMSCs上的受体激活Wnt信号通路。所有细胞均在高糖条件下（葡萄糖：50 mM）培养以模拟糖尿病环境。实验独立重复三次。所有数据均以平均值±标准差表示，n = 3。使用双侧学生t检验计算两组之间的统计差异。ns：无显著性，*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001，p < 0.0001。

众多研究表明，神经细胞会分泌多种因子，这些因子与间充质干细胞（MSCs）上的特定受体相互作用，导致细胞内信号转导和信号通路激活，引发特定的细胞功能，包括与骨再生相关的功能[32-34]。为了揭示不同材料表面在与SWs共培养过程中促进BMSCs成骨分化的分子机制，我们检测了BMSCs中几种神经因子受体的基因表达水平，结果显示，与单培养相比，共培养条件下这些基因的表达显著上调（图5e）。Wnt信号通路已知是神经因子受体的下游通路，同时也是调节成骨分化的上游通路，其激活可促进成骨相关基因（如Runx2和BMP2）的表达[35, 36]。我们发现，在与SWs共培养时，生长在不同材料表面的BMSCs中，Wnt通路的关键基因显著上调，这表明实验组中的Wnt通路被激活（支持信息图S27）。结合早期观察到的与SWs共培养时不同材料表面的BMSCs成骨分化增强的现象（图5a, c），我们推断这些材料可能增强了SWs对多种神经因子的分泌，这些神经因子随后通过MSCs上的特定受体发挥作用，激活细胞内的Wnt信号通路，从而促进MSCs的成骨分化（图5f）。基于体外实验的综合结果，我们假设设计的释放氢气的表面启动了一系列再生事件。首先，它们促进神经再生，而神经再生可作为血管化的触发因素。这种协调的神经血管反应随后协同放大骨再生过程，突显了神经血管网络在成骨过程中的综合作用。

 2.6 AB@HyPT-Mg在糖尿病兔骨缺损模型中促进骨再生的体内评估

我们使用糖尿病兔的临界尺寸骨缺损模型，来证实我们设计的释放氢气的表面在糖尿病条件下的体内成骨潜力，将不同表面的钛合金骨植入物植入骨缺损处。植入1个月后，显微CT成像显示，HyPT-Mg组和AB@HyPT-Mg组的骨生长情况更好（图6a, b），AB@HyPT-Mg组的效果最为显著，双重荧光标记和范吉森（VG）染色也证实了这一点（图6c, d；支持信息图S28a）。在实验组中，AB@HyPT-Mg组的骨体积增加最多，骨结构也得到了改善，这表明骨质量提高且骨重塑有效。由于某些成骨标志物在骨再生后期的表达可能会降低，我们选择在植入后早期（具体为植入后7天）评估成骨分化情况，而不是在后期（如28天）评估。对碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）进行免疫组织化学（IHC）染色（支持信息图S28b）显示，AB@HyPT-Mg组中这两种蛋白的表达显著增加，表明早期成骨分化增强。这些发现与显微CT和VG染色所观察到的强劲的长期骨再生结果一致，进一步支持了该材料在促进骨再生方面的卓越能力。这些体内研究结果表明，氢气和Mg²⁺在促进骨生长方面具有协同作用，也强调了释放氢气的表面即使在具有挑战性的糖尿病条件下，也具有促进植入物周围骨再生的出色能力。

图6：AB@HyPT-Mg在兔糖尿病骨缺损模型中促进体内骨再生的能力。a, b）植入材料一个月后，糖尿病骨缺损处的横向和三维重建显微CT图像（a）以及对显微CT数据的定量分析（b），包括骨体积占总体积的比例（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁间距（Tb.Sp）；c, d）双重连续荧光标记图像（c）和对矿化沉积率的定量分析（d）；e, f）植入材料一周后，植入物周围组织的免疫荧光染色（e）和对神经元特异性烯醇化酶（NSE）的定量分析（f）；g–i）植入材料一周后，植入物周围组织的免疫荧光染色（g）以及对血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）（h）和血管内皮生长因子（VEGF）（i）的定量分析。所有数据均以平均值±标准误表示，n = 5只生物学独立的动物。使用单向方差分析结合Tukey事后检验计算两组之间的统计差异。ns：无显著性，*p < 0.05，p < 0.01。

除了骨再生的结果外，我们还研究了释放氢气的表面对糖尿病兔骨愈合过程中神经和血管系统的影响。植入1周后，HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg植入物显示出神经标志物NSE的表达升高，AB@HyPT-Mg组的效果尤为显著（图6e, f），这表明氢气和Mg²⁺对神经生长具有协同的积极影响。AB@HyPT-Mg植入物中CD31和VEGF的表达水平也最高（图6g–i），这表明氢气和Mg²⁺的组合可能增强血管连接和骨整合。我们还对血管灌注的硬组织切片进行了成像和定量分析，以评估植入10天后植入物周围的血管分布和密度。结果显示，HyPT、AB@HyPT、HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg组植入物周围的血管生长增加，释放氢气的组在糖尿病条件下可刺激血管生长，但释放Mg²⁺的组效果更为显著（支持信息图S29）。值得注意的是，AB@HyPT-Mg组的血管生成最为密集。

关于巨噬细胞极化，AB@HyPT-Mg组的M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达水平显著降低，同时M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶-1（Arg1）的水平升高（支持信息图S30）。这表明氢气和Mg²⁺的释放具有协同作用，有利于巨噬细胞向M2型极化，这对增强组织修复和减轻炎症有益。总体而言，这些发现表明，同时释放氢气和Mg²⁺的表面有助于调节对骨再生、组织修复和减轻炎症反应至关重要的细胞活动。

 2.7 AB@HyPT-Mg在血糖正常的骨缺损模型中促进骨再生的体内评估

为糖尿病患者设计有效的植入物需要在高血糖和血糖正常的条件下都能促进骨再生。这一点至关重要，因为糖尿病患者即使经过治疗，血糖水平也常常波动。无论血糖状态如何，保持稳定的骨再生能力可确保植入物的疗效和长期成功。因此，我们在血糖正常的兔骨缺损模型中评估了我们的释放氢气的材料，以证实其在非糖尿病环境中的性能。植入1个月后的显微CT分析显示，血糖正常的兔子中骨形成的趋势与糖尿病模型中观察到的相似，AB@HyPT-Mg组的新骨形成最为显著（图7a）。定量数据证实，AB@HyPT-Mg组的骨量、骨质量和骨生长情况更优（图7b），这表明其强大的再生能力以及在糖尿病和非糖尿病骨修复中的广泛适用性。

图7：AB@HyPT-Mg在血糖正常的骨缺损模型中的体内骨再生能力以及促进神经血管再生的能力。a, b）植入一个月后，血糖正常的兔骨缺损模型的横向、冠状横截面和三维重建显微CT图像（a）以及对显微CT数据的定量分析（b）；c, d）植入一周后，血糖正常的兔骨缺损模型植入物周围组织中NSE表达的免疫荧光染色（c）和定量分析（d）结果；e–i）植入两周后，血糖正常的大鼠骨缺损模型中股骨远端和植入物周围血管分布的三维重建显微CT图像（e）以及对相应指标（包括血管数量（f）、最大血管直径（g）、最小血管直径（h）和平均血管直径（i））的定量分析。所有数据均以平均值±标准误表示，n = 5只生物学独立的动物。使用单向方差分析结合Tukey事后检验计算两组之间的统计差异。ns：无显著性，*p < 0.05，p < 0.01。 在先前证明了我们的材料在糖尿病条件下具有神经再生潜力（图5和图6）之后，我们通过评估神经元细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达，研究了该材料在血糖正常的兔子体内的作用。虽然单独的氢气并没有显著改变NSE的表达（图7c-d），但它增强了镁离子（Mg²⁺）对NSE的积极影响，表明氢气和镁离子在神经再生方面具有协同作用。在血糖正常的条件下，Mg²⁺似乎是神经再生的主要驱动因素，而氢气起到辅助作用。

为了进一步评估对血管化的影响，我们使用灌注和成像技术，在血糖正常的大鼠植入材料两周后检查了血管生长情况。计算机断层扫描（CT）显示，与钛合金（TC4）相比，AB@HyPT、HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg植入物周围的血管密度更高（图7e），并且在植入物表面观察到更多的血管（图7f）。HyPT-Mg和AB@HyPT-Mg表现出更大的最大血管直径和更小的最小血管直径，这表明新血管形成和血管重塑得到增强，突出了Mg²⁺对血管的益处（图7g，h）。尽管AB@HyPT-Mg在平均血管直径方面没有显著优于HyPT-Mg（图7i），但其更高的血管数量表明氢气可能有助于血管生成。

在这个血糖正常的骨缺损模型中，理论上愈合过程并不需要降低氧化应激。因此，释放氢气的表面所具有的补充抗氧化能力可能会降低正常的细胞内活性氧（ROS）水平，从而可能抑制骨再生。然而，我们的研究结果显示，释放氢气的AB@HyPT植入物没有产生不良影响，这可能是因为氢气能够选择性地清除有害自由基[3]。此外，同时释放氢气和Mg²⁺的AB@HyPT-Mg植入物在非糖尿病性骨再生中表现出协同效应。这些结果证实了我们的释放氢气的植入物表面具有出色的安全性，适用于血糖正常和高血糖条件下的骨缺损修复。

由于生物安全性对于任何可植入材料都至关重要，我们严格评估了所制备的植入物的长期生物安全性。对主要器官的组织学分析（苏木精-伊红（H&E）染色，支持信息图S31a）显示，没有出现不良的细胞变化或结构异常，表明AB@HyPT-Mg植入物具有出色的生物安全性。通过一系列血液检测进一步评估了全身影响。在整个研究期间，所有组别的肝肾功能都保持在正常范围内（支持信息图S31b，c）。在植入两周后，所有组别的白细胞（WBC）计数、中性粒细胞（NEUT）和淋巴细胞（LYMPH）出现短暂升高（支持信息图S31d），但这些值在四周时恢复到基线水平，表明对手术操作产生了典型的、可消退的炎症反应。所有其他血液学参数在所有组别和时间点都保持稳定（支持信息图S31d），进一步验证了植入物的生物安全性。

3. 讨论与结论

氢气在治疗炎症相关疾病方面已显示出有前景的治疗效果[4]。我们之前开发了一种自我响应的释放氢气的微针贴片，用于治疗糖尿病足溃疡，该贴片在清除氧化应激和促进糖尿病伤口部位的伤口愈合方面表现出优异的疗效[37]。然而，氢气的生物医学应用目前受到其递送方法的限制，特别是在诸如大骨缺损等具有挑战性的内部组织修复病例中。为了解决基于简单摄入的传统氢气递送方法的缺点，少数研究构建了释放氢气的表面，如镁合金[38, 39]、氧化镁浸渍水凝胶[13]和二氧化硅浸渍支架[14]。然而，由于氢气释放速率不可控，激烈的反应可能会形成氢气泡，从而抑制骨整合。本研究直接应对了氢气难以存储在植入物表面，因而难以实现原位缓慢释放这一挑战。我们采用了一种创新的氨硼烷（AB）纳米限域方法，将释放氢气的前体成功地转化为稳定的化学形式，首次实现了氢气的可控和持续释放（图2a；支持信息图S13）。通过利用氢气消除氧化应激的出色能力，我们的释放氢气的植入物表面可以恢复糖尿病骨缺损部位的正常氧化应激水平（图3）。虽然氢气的释放对减轻氧化应激起着关键作用（图3），但其对成骨的直接影响似乎有限（图6a，b；支持信息图S28）。我们的结果表明，Mg²⁺的协同作用对于大量的骨再生至关重要，这从同时存在氢气和Mg²⁺时观察到的显著增强的成骨作用中可以得到证明（图5、图6和图7a，b；支持信息图S28）。通过协同氢气和Mg²⁺对神经再生的影响，我们设计的材料表面可以在具有挑战性的糖尿病条件下，通过启动有神经支配的血管化骨再生来实现成骨（图4和图5）。本研究的发现标志着在扩展氢气疗法的应用方面取得了重大进展。

此前，氨硼烷在诸如癌症治疗等生物医学应用中已显示出一定的潜力[40-42]。然而，在本研究中，我们首次发现氨硼烷在高浓度过氧化氢的环境中对细胞具有显著的毒性，而高浓度过氧化氢是慢性组织炎症的典型特征。氨硼烷与过氧化氢结合可能会对细胞产生协同致死效应（支持信息图S32）。许多慢性疾病（如糖尿病）的一个关键病理特征是过氧化氢水平持续处于高位，这强调了在不同疾病环境中考虑氨硼烷安全性的重要性。在设计用于承载氨硼烷的底物时，有必要避免其与周围过氧化氢相互作用所导致的潜在细胞毒性，同时优化氢气的释放行为，以更好地满足病理条件下组织再生的需求。

在本研究中，我们引入了一种新颖的纳米限域方法，利用独特设计的钙钛矿/二氧化钛复合前体与氢氧化钠相互作用，制备了用于负载氨硼烷的混合相钛酸盐。这实现了氨硼烷在底物内的单端锚定对接（OEAD），防止其以分子形式释放，并且仅在水分子进入底物时通过水解反应释放氢气（图2k）。这种方法控制了氨硼烷在原位的缓慢水解，从而实现了氢气的逐渐释放。与现有的旨在提高氨硼烷热分解温度或提高水解产氢效率的策略相比，该方法避免了氨硼烷分子在过氧化氢存在下对细胞的毒性。我们的策略能够使氢气缓慢释放超过11天（支持信息图S13），而传统的负载氨硼烷的方法（如通过对钛合金进行碱水热处理获得的钛酸盐）在3天内就会完全释放氢气（支持信息图S1）。我们的氢气释放时间也超过了其他释放氢气的植入物[13, 14]。重要的是，我们的释放氢气的植入物表面表现出优异的生物活性和氧化应激清除能力（图3；支持信息图S20），完全满足在病理条件下使用氨硼烷时的氢气释放要求。通过体外和体内功能验证，我们的释放氢气的表面在糖尿病条件下显示出优异的促进骨再生的能力（图5和图6）。

有趣的是，我们注意到氢气和Mg²⁺在协同促进骨再生方面的联合作用（图6和图7），为氢气疗法和补充Mg²⁺的双重应用提供了新的见解。我们设计的材料表面能够实现Mg²⁺的早期释放，因此满足了补充Mg²⁺的必要时间要求，因为Mg²⁺在骨再生的早期阶段具有有益作用，而不是在后期阶段[28-30]。这些设计表面的功能通过同时释放氢气得到增强，氢气能够恢复骨相关细胞的正常氧化状态，从而协同促进骨再生。通过转录组测序，我们发现释放氢气的植入物表面在糖尿病条件下促进骨修复的一个重要机制是增强神经血管网络再生（图4d–g）。近年来，一些研究利用Mg²⁺和氢气的联合作用来治疗神经损伤[39, 43]，尽管其具体的潜在机制尚未被探索。本研究揭示了新的知识，即氢气与Mg²⁺协同促进神经再生，从而也促进了骨再生。这些知识对于探索基于Mg²⁺和氢气联合应用的新治疗途径（包括治疗神经损伤和相关病理）是有用的。此外，已知氢气在抗衰老方面发挥着重要作用[16]，这使得我们提出本研究中构建的释放氢气的植入物表面也可能在衰老条件下增强骨修复，这是我们在后续研究中将探索的方向。

综上所述，本研究开创了一种新颖的纳米限域策略，通过混合相钛酸盐纳米晶体来调节氨硼烷（AB）的水解，实现了从植入物表面可控且同时释放氢气和Mg²⁺。通过将氨硼烷牢固地固定在缺氧的混合相钛酸盐晶体的层间空间内，该方法实现了缓慢水解和氢气在原位的持续释放。这有效地解决了氨硼烷在生物医学应用中遇到的先前挑战，如有害的细胞毒性和不可控的释放动力学。体外和体内研究证实了这些新型释放氢气的表面的协同效应，通过同时持续释放氢气和短期释放Mg²⁺，减轻了与糖尿病相关的氧化应激，并促进了有神经支配的血管化骨再生。这种创新策略为在具有挑战性的病理环境中的组织修复提供了一个有前景的治疗途径。

4. 实验部分

实验细节，包括材料和试剂、材料表征以及体外和体内实验，列于支持信息中。

 材料构建

将碳酸钙（CaCO₃）-二氧化钛（TiO₂）复合粉末（质量比57.3:70）进行球磨，在80°C下干燥，过筛（80目），并与5%的聚乙烯醇（PVA）溶液混合。在100°C下干燥并过筛（80-100目）后，使用9M等离子喷涂系统将该粉末等离子喷涂到TC4钛合金基底上。对涂层进行超声清洗和干燥，然后在氢氧化钠（3M，180°C，6小时）中进行水热处理，得到混合相钛酸盐（HyPT）。通过氯化镁（MgCl₂，250 mM，12小时）离子交换获得负载镁离子的HyPT（HyPT-Mg）。最后，将HyPT和HyPT-Mg浸入25 mM的氨硼烷溶液中（2小时）以负载氢气前体，得到AB@HyPT和AB@HyPT-Mg。详细步骤见支持信息。

 氢气释放检测

将样品置于含有1 mol/L氨硼烷溶液的烧杯中，然后浸入真空环境中12小时。随后将样品洗涤以去除任何残留的游离氨硼烷。使用便携式氢气溶解仪（ENH-2000，RUSTLEX，日本）测量样品在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中的氢气释放情况。每24小时更换PBS缓冲溶液，并记录氢气释放值，以评估所构建的释放氢气表面的持续释放氢气的能力。对于气态氢气浓度的检测，使用气相色谱仪（Agilent 7890B，美国）。具体而言，将负载氨硼烷的材料置于15 mL小瓶中，并加入5 mL PBS。然后密封小瓶，每两天测量小瓶空气中的氢气浓度。

 细胞培养

将骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养在含有10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素的α-改良 Eagle培养基（α-MEM）中。人骨髓间充质干细胞（hBMSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自赛业生物科技有限公司，施万细胞（SWs）购自武汉普西拉生物技术有限公司，大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）从成年Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离。对于rBMSC的分离，在人道安乐死后将大鼠浸入75%乙醇中。切开后肢的皮肤和皮下组织。无菌切除股骨和胫骨，清除周围组织，并在含有200 U/mL青霉素/链霉素的PBS中清洗。切割骨端以暴露骨髓腔，用完全培养基冲洗直至骨骼变白。收集骨髓，离心后重悬于培养基（补充20%血清）中并铺板。48小时后，去除非贴壁细胞，每三天更换培养基直至传代，得到用于进一步实验的rBMSCs。将RAW264.7巨噬细胞和施万细胞系培养在含有10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养在含有10% FBS和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中。所有细胞在37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养。每两天更换培养基。使用第2至9代的细胞进行细胞实验。每两个月进行支原体检测。

 动物实验

动物实验设计已获得空军军医大学第三附属医院实验动物伦理检查实验室的批准（批准号：2021(070)）。动物饲养在配备齐全的动物设施中，温度为20–25°C，湿度为30–70%，处于相同的明暗周期（12:12）。