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1科学网—氢气多功能医学效应 2024年英学位论文第一章 

2科学网—英国氢生物医学博士论文 第二章 材料方法 

3科学网—氢化酶及其在人类蛋白质组中的同源物

4科学网—氢气生物活性的理论评估

5 科学网—氢气吸入设备的性能和安全性评估

第六章：氢气生物学效应的概念验证探究

6.1 引言

正如第一章第1.2节所述，氢气穿越生物膜的能力可能具有重要影响，影响基本的细胞器生物化学和胞质反应，这为氢气在包括人类在内的动物和植物的多种疾病模型中显示出积极效果提供了可能的解释（Ohsawa等人，2007；Nishimaki等人，2018；Johnsen, Hiorth和Klaveness，2023；Zhu等人，2023）。

氢气在农业和临床环境中的主要用途之一是作为抗氧化剂，这一点最初由Ohsawa等人（2007）在缺血/再灌注损伤的啮齿类动物模型中证明。这项极具影响力的研究描述了高度活性的•OH和ONOO-分子的选择性还原，但没有减少重要的信号分子H2O2和NO•(Ohsawa等人，2007)。尽管氢气的直接抗氧化活性存在争议（第四章，第4.2.1和4.2.2节），但通过仅中和最具破坏性的ROS/RNS，这一机制可以有效地允许细胞上调抗氧化蛋白和肽的表达，例如CAT; Nrf-2; SOD) (LeBaron等人，2019a)。已知这种内源性抗氧化剂的上调能够增强对诸如人类感染性和非感染性疾病（Ge等人，2017），以及植物的盐度、干旱和温度压力（Hancock和Russell，2021）等环境压力的耐受性。此外，由于众多临床研究表明氢气是一种非细胞毒性物质，迄今为止未显示与其他医疗干预措施，包括某些药物（Nakashima- Kamimura等人，2009），化疗药物（Li等人，2019b）和免疫治疗处理（Wu等人，2019）有禁忌症，因此氢气是作为辅助疗法的理想候选者。

6.2 研究目的

为了更好地理解氧气氢化物在生理压力下对植物、无脊椎动物和人类衍生细胞的生长和复制的影响，这些初步探究评估了以450 mL/分钟的速度向处理介质中扩散氧气氢化物30分钟是否会影响受到盐分挑战的豆科种子（豌豆）的萌发和生长（方法：第二章，第2.2.2节）。为了评估氧气氢化物是否会对无脊椎动物产生影响，还使N2 Bristol Caenorhabditis elegans暴露于氧气氢化气体（方法：第二章，第2.2.3节）。最后，为了进一步判断氧气氢化物给药是否会影响人类衍生的受Epstein-Barr病毒影响的B淋巴细胞（TK6细胞）的生长和复制活动，以及这可能对恶性疾病的人类消费产生的后果，将氧气氢化气体注入细胞培养基中（方法：第二章，第2.2.5节）。

6.3 植物：在盐分压力下的萌发幼苗的理由

由于Fabaceae家族包括豆类、豌豆和豆类，它们是相对耐寒、营养丰富且可持续的食物来源。对于农业和园艺目的，通常以HRW形式应用的氢气可以被利用作为一种种子启动剂，可以促进α/β-淀粉酶活性（Zulfiqar, Russell和Hancock，2021），并导致可访问和富含能量的水溶性糖的增加，这对于萌发种子的最佳发育是必需的，通过增强抗氧化途径和刺激对以下环境压力因素的耐受性：i) 来自砷酸盐（As）、镉（Cd）、铜（Cu）和锌（Zn）的金属毒性（Zulfiqar, Russell和Hancock，2021），ii) 增加的盐度水平（Wu等人，2020），iii) 缓解植物因干旱压力而造成的损害（Jin等人，2013），以及iv) 提高对除草剂（百草枯）的耐受性（Russell, Zulfiqar和Hancock，2020）。

6.3.1 豆科（豌豆）种子的萌发、生长和抗氧化能力

6.3.1.1 确定NaCl在植物生长培养基中的效果。

结果部分呈现的数据是由我的监督下MSc学生Bipana Dewan使用第二章第2.2.3节描述的方法生成的。对萌发幼苗的视觉分析强烈表明，添加50mM NaCl（Shrivastava和Kumar，2015）会降低幼苗的健康和活力（图6.1b和6.2b）。

图6.1（A/B）& 6.2（A/B）增加盐分对豆科种子萌发有害影响的摄影确认（n=3）。从上到下/从左到右。用HRW处理的种子。1a) 0mM NaCl 1b) 50mM NaCl。用水处理的种子。2a) 0mM NaCl 2b) 50mM NaCl。

图像6.1a显示，未经盐分挑战、用HRW浸种的种子可以产生良好萌发的幼苗，这通过独特的叶和根结构的出现来表明。

图像6.1b中缺少这些结构表明，在生长培养基中添加50mM NaCl会主动抑制豆科植物的萌发和随后的生长。图像6.2a表明，在没有NaCl的情况下，未处理的种子也可以产生良好萌发的幼苗。图像6.2b支持了NaCl确实抑制了未处理幼苗生长的发现。然而，目前尚不清楚与水合且未处理的种子相比，用氧气氢化物富集水处理是否能缓解盐分压力的影响。

6.3.1.2 受盐分挑战的豆科种子的萌发和生长

为了评估氧气氢化物富集水作为种子启动剂的潜力，分析了豌豆（Pisum sativum）的成功7天萌发率（图6.3）、生长百分比（图6.4）、CUPRAC（图6.5）、FRAP（图6.6）。

图6.3 种子萌发百分比。7天孵化。数据由MSc学生Bipana Dewan（2022年）在我的监督下（Grace Russell）生成。柱状图描绘了成功萌发的种子的百分比（n=18）。误差条表示±标准误（SEM）。

尽管使用单因素方差分析（ANOVA）在处理组之间没有确定显著结果（p=0.078），但在HRW处理的种子中存在改善萌发成功率的趋势。值得注意的是，与HRW处理和对照组相比，H2O处理组显示出降低的萌发成功率。因此，为了提供关于HRW种子启动潜在益处的更有意义的数据，将此协议扩展到包括各种种子以及田间和温室环境将是高度有利的。

图6.4 7天内豌豆（Pisum sativum）生物量增加。数据由MSc学生Bipana Dewan（2022年）在我的监督下（Grace Russell）生成。柱状图描绘了在不同盐浓度下Mangetout幼苗的生物量增加（n=5）。误差条表示±标准误（SEM）。

方差分析（ANOVA）未显示出处理组之间的任何统计差异（p=0.199）。然而，与萌发成功率协议（图6.3）一样，HRW应用存在增强生长的趋势，特别是在与H2O在0mM和100mM NaCl相比时。因此，未来实验可能值得扩展，包括记录下胚轴伸长、子叶扩张和第一片叶子突出的记录，从而提供更全面的幼苗生存能力图景。

（实话说，这种豆类种子实验，过于简单，只进行普通照相，简单计数和测量质量。这种实验，我女儿上小学时候都在家里做过。不过这也没有什么不可以，只要能说明问题，研究好坏不能看难易，要看研究意义。值得学习的是，这里没有统计学意义，只看到变化趋势。我们看到这种结果往往会设法增加样本量补充实验等技巧获得统计学意义，这种客观提供数据的精神很好。）

6.3.1.3 CUPRAC测定

CUPRAC测定能够测量亲水和疏水样本的总抗氧化能力（TAC）（Sethi等人，2020）。主要试剂是铜（II）-新亚铜试剂（2,9-二甲基-1,10-菲罗啉），可以氧化抗氧化剂生成有色产物。与新亚铜试剂的螯合通过提升试剂的氧化还原电位加速反应。CUPRAC记录了CUPRAC试剂与样品中抗氧化剂之间的氧化还原反应，样品中含有主要的硫醇基团（如谷胱甘肽）。在此过程中，试剂自身被还原形成铜（I）-新亚铜试剂的螯合物，该化合物在450 nm处可测量颜色。

图6.5 萌发后的Mangetout种子裂解液的CUPRAC抗氧化能力。数据由MSc学生Bipana Dewan（2022年）在我的监督下（Grace Russell）生成。柱状图描绘了经过种子启动处理的Mangetout种子裂解液的铜抗氧化能力（n=3）。误差条表示±标准误（SEM）。

使用方差分析（ANOVA）确定显著性，结果显示在种子启动处理之间没有显著的抗氧化能力差异（p=0.115）。然而，实验协议在与对照组和50mM NaCl下的H2O组相比时，以及在100mM NaCl下的H2O组相比时，识别出抗氧化活性的轻微增加。因此，对这些实验进行进一步开发可能会有益，包括多次重复实验，以及多种种子类型和土壤，以便在是否可以坚定地确定H2对生物系统中Cu2+还原有主要影响之前得出结论。

6.3.1.3 b FRAP测定

FRAP测定是一种测量将铁离子（Fe3+）-配体复合物还原为强烈的蓝色亚铁离子（Fe2+）+TPTZ复合物的方法（Benzie and Strain, 1996）。通过分光光度分析在593 nm处测定吸光度的增加来确定抗氧化活性。

图6.6 萌发后的Mangetout种子裂解液的铁还原潜力。数据由MSc学生Bipana Dewan（2022年）在我的监督下（Grace Russell）生成。柱状图是Mangetout种子裂解液的铁还原潜力的图形表示（n=7）。误差条表示±标准误（SEM）。* 表示p≤0.05。** 表示p≤0.01

方差分析（ANOVA）显示处理之间存在显著差异（p=0.03）。Tukey-Kramer事后分析结果显示，在100mM NaCl中种植的HRW启动的Mangetout种子与对照组相比（p=0.002）和H2O启动的种子相比（p=0.023），FRAP活性呈下降趋势。尽管在50mM时也观察到FRAP活性的非显著下降，但由于这一趋势并未在0mM NaCl组中出现，因此认为这可能是在萌发的初期阶段（吸胀和呼吸）抗氧化活性增强的结果，尽管需要进一步且更复杂的实验来确认这一点。

考虑到对萌发豆科种子的抗氧化分析没有显示出任何明确的抗氧化活性（图6.5和6.6），可能不仅评估对植物的影响如上所述；而且分析周围土壤中的微生物和无脊椎动物含量也是合适的。

6.4 无脊椎动物：理由- 确定氢氧气体施用对面临盐分挑战的线虫的影响。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种两侧对称的无脊椎动物（Brenner, 1974; Baxter et al., 2013），在最佳条件下寿命约为2-3周。在以下实验中使用的N2 Bristol品系的C. elegans还受益于该生物体是非感染性、非致病性、非寄生性的，价格低廉且相对易于培养。此外，C. elegans已知与大约100个与人类疾病相关的基因有同源物（The and Wilson, 1999），这意味着在进化过程中蛋白质功能得到了有意的保守（Corsi, 2006），使得C. elegans成为跨翻译实验室调查的理想选择。使用第2章第2.4节描述的方法，施用了氢氧气体，并评估了生长和复制能力以及CAT的抗氧化活性。（做植物研究，也可以用线虫研究，我们可能会认为这跨度有点大，这都是为了解决问题，研究内容是为解决问题服务的！点赞）

6.4.1 线虫的显微评估。

观察线虫形态发现，将NaCl的最佳浓度从50mM降低到25mM，无论是对照组还是经氢氧治疗的组，都显著减少了线虫的整体大小和数量。在利用50mM和100mM浓度的NaCl的群体中，无论是否接受氢氧治疗，线虫数量都没有明显差异，也没有看到种群之间的形态学差异。对于治疗组和对照组，生长在含有200mM NaCl的琼脂上的线虫通常比标准组（50mM NaCl）大，尽管线虫数量的观察表明繁殖能力没有受损。

6.4.2 抗氧化测定 - 过氧化氢酶。

通过直接跟踪在240 nm处单位时间内的吸光度下降可以追踪过氧化氢酶（CAT）对反应性氧种H2O2的分解。计算每分钟每毫克细胞悬浮蛋白的过氧化氢酶特异性活性。摩尔浓度由光密度读数表示，这些值除以时间（分钟），然后这个给定的值除以消光系数（43.6 M-1 cm-1）（Hadwan, 2018）。这些计算出的值连同数据时间点一起用于创建结果（图6.7）（n=3）。

图6.7 线虫群体中过氧化氢酶酶活性的分光光度分析。线图解释了在50mM和200mM NaCl浓度下培养的线虫中过氧化氢酶活性。每个NaCl浓度类别都分配了对照组。蓝色 = 控制组50mM / 橙色 = 50mM + HRW / 灰色 = 控制组200mM / 黄色 = 200mM + HRW。误差条表示±标准误（SEM）。

使用单因素方差分析（ANOVA）来评估组间是否存在统计差异。使用这些测试没有看到显著差异（p=0.98），因此不需要进一步的事后分析。尽管这些数据产生了负面结果，但可能在这里开发的施用协议（第2章，第2.2.4.2节）没有使线虫暴露于足够的氢氧气体量。

6.5 人类衍生的TK6细胞：理由 - 急性（单次）和慢性（每日）治疗。

关于氢氧可能对哺乳动物生理的影响，永生化的、感染Epstein-Barr病毒的B细胞淋巴母细胞（TK6细胞）为调查氢氧施用在免疫细胞中是否有任何毒性或其他有害影响提供了一个有价值的模型。B细胞是适应性体液免疫系统的关键，负责调节抗原特异性免疫球蛋白（Ig）抗体的产生。然而，当被Epstein-Barr病毒（EBV）感染时，这些细胞可能变得非功能性，将细胞机制用于永生化，这与某些癌症的起始和发展有关（Farrell, 2019）。此外，据估计全球约1.5%的癌症病例与EBV感染有关（Farrell, 2019）。TK6细胞复制迅速，大约24小时翻倍，且在实验室环境中易于维持。作为一种非贴壁细胞系，在悬浮介质中培养，假设提出的方法（第2章，第2.2.5节）也将允许细胞容易地接触到溶解的氢氧气。

6.5.1 急性治疗

单次治疗的结果（第2章，第2.2.5.1b节）表明，氢氧输注显著减少了培养中TK6细胞的增殖（图6.8 (A)），而不影响存活率（图6.8 (B)），证明了治疗不是细胞毒性的。初步结果显示，与对照组相比，在所有时间点（24小时，p=<0.01；48小时，p=0.03；以及72小时，p=0.01）急性氢氧治疗显著减少了细胞增殖（图6.8 (A)）。与对照组数据相比，细胞活力（图6.8 (B)）基本不受氢氧治疗影响（p=0.55），并且只在48-和72小时点之间注意到统计上相关的差异（p=<0.01），这可能表明是对测试的物理操作而不是治疗本身的细胞应激反应。

图6.8 (A-D)。柱状图表示TK6细胞在暴露于氢氧后的增殖和存活率（n=3）。紫色条代表对照组。黄色条代表氢氧处理组。（A）单次氢氧应用，细胞群体计数。（B）单次氢氧应用，细胞存活率。（C）每日氢氧治疗，细胞群体计数。（D）每日氢氧治疗，细胞存活率。误差条表示±标准误（SEM）。*（p<0.05）。

6.5.2 慢性治疗

对每日治疗方案的分析（第2章，第2.2.5.5c节）显示，在对照组和治疗组中每个时间点细胞数量都显著下降（图6.8（C）），尽管治疗之间没有统计上的显著差异（p=0.64）。在24小时至48小时（p=0.05）和48小时至72小时（p=0.03）之间观察到细胞计数的显著减少。对于每日治疗组，细胞存活率（图6.8（D））在72小时时显著降低（p=0.03）。与对照组相比，也在72小时时间点注意到氢氧处理细胞存活率的大幅降低（p<0.01）。汇总这些数据强烈表明，细胞的物理处理耐受性不佳，导致生理和繁殖压力，因此认为重复的氢氧给药方法无效，并对协议进行了调整（第6.6.3.3节）。

6.5.3 确定丝裂原效能

为了评估氢氧给药是否会在生长刺激下影响TK6细胞的增殖，有必要评估哪种丝裂原化合物在刺激TK6细胞增殖方面最有效（第2章，第2.2.5.8节），因此将培养的细胞暴露于四种不同的丝裂原：16µg/mL ConA、80 µg/mL LPS、16µg/mL PHA和16µg/mL PWM。图6.9详细说明了对刺激的复制响应。

图6.9。在TK6细胞中确定丝裂原效能（24小时）。从左到右。对照组、Con A、LPS、PHA和PWM的细胞增殖。误差条表示±标准误（SEM）。（n=2）。

数据显示，添加ConA、PHA和PWM后产生了显著效果。然而，单因素方差分析表明，丝裂原化合物之间没有显著差异（p=0.18），这被认为是生物变异性的结果。尽管ConA不是B细胞特异性丝裂原，但ConA丝裂原增强了TK6细胞的增殖，与PHA和PWM一致。由于ConA在供应链中易于获得，易于处理且相对便宜，因此选择这种丝裂原进行进一步实验。

6.6 建议

6.6.1 确定富氢水施用对植物生长的影响。

图6.2至图6.6所示的观察结果表明，在培养基中加入50mM和100mM NaCl会减少对照和HRW组中萌发幼苗的生长。通过氢氧化水处理种子的方式（第2章，第2.2.3.10节）生成的数据被认为是不确定的，因此建议博士论文限制其范围，专注于从人类来源获取的数据。

6.6.2 确定氢氧气和富氢水施用对受盐胁迫线虫的影响。

对HRW应用于受盐胁迫线虫的抗氧化效应的分析提供了不确定的数据（图6.7）。这很可能是由于难以确保线虫充分暴露于氢氧气所致。以所描述的方式（第2.2.4.2节）用氢氧处理培养的线虫被认为无效，因此建议博士论文限制其范围，专注于从人类来源获取的数据。

6.6.3 细胞培养和治疗方案

6.6.3.1 急性治疗

急性治疗的参数无需更改，除了细胞培养基和培养量。

6.6.3.2 慢性治疗

由于最初的慢性治疗未成功，这可能是由于每天处理和操作细胞所致，因此在持续的学术研究中引入了一种新方法（第7章），即每天添加10 mL氢氧融合的培养基，这一操作减少了上述物理干预。对照组每天将接收10 mL未融合的培养基。

6.7 总结与结论

表6.1总结了这些集体实验的发现，并突出了开发这些概念验证调查的适当性。决定是否将这些协议包括在内、调整以适应或从核心论文中排除，主要基于四个标准：可负担性、实验可重复性、生成数据的相关性以及程序的可持续性。每个主题在适合包含在博士论文中的适宜性方面从1-5（低到高）进行了评分。中点得分为10或以上被视为适合继续研究。

表6.1 评估概念验证实验适合包含在博士论文中的适宜性。等级从低到高的适宜性（1-5）标记。

总之，尽管本章并非所有实验都得出了明确结果，但检索到的数据揭示了作为新型抗氧化剂和细胞保护化合物应用氢氧的一些潜在有趣方面。这些初步实验为后续章节记录的博士研究奠定了基础。由于独立研究的局限性，并非所有在此创建的有趣或相关数据都能进一步研究。然而，未来研究氢和氢氧治疗的效应可能会希望调整或扩展此处呈现的工作，而其他人可能会从此处开发的融合方法中受益。