Alwazeer D. Hydrogen-rich solvent method in phytochemical extraction: Potential mechanisms and perspectives. Phytochem Anal. 2023 Nov 20. doi: 10.1002/pca.3304. Epub ahead of print. PMID: 37984825.

一、前言 

植物化学物质和生物活性化合物的分离来源，如农业食品废弃物和药用植物，是包括食品、农业、制药和化妆品行业等不同行业的一个重要过程。这一过程在各个领域都发挥着至关重要的作用，随着对天然和可持续原料的需求不断增加，它有望在未来获得更大的意义。

提取是分离生物活性化合物的必要和关键步骤。由于植物化学物质及其来源的多样性，提取过程不能是独特和稳定。发现生物活性化合物的物理和化学状态是另一个重要因素。在植物细胞中植物化学物质以不同形式存在，包括游离的、物理捕获的和化学交联的。游离的植物化学物质通常存在于液泡中，而被包裹和结合态的植物化学物质则存在于细胞壁中。这些因素的差异和多样性使植物化学物质与其来源的分离成为一项具有挑战性的任务。

许多传统的和新兴的提取方法被提出来用于分离的植物化学物质。其中一些方法需要特定的和昂贵的设备，成本密集型的维护和服务，更多过滤和清理步骤，昂贵的试剂，以及额外的步骤和过程。

从植物材料中提取植物化学物质的常用新兴方法有超临界流体提取、加压液体提取、微波辅助提取、超声辅助提取和即时控制压滴提取。这些方法在工艺过程中缺乏均匀性，溶解极性化合物的能力有限，仅限于特定的产品，可能会破坏不稳定生物化合物活性，需要更多的技术，更高的溶剂和功耗，以及更长的制备和工艺时间等来优化。

从植物产品中提取植物化学物质是研究、开发和制药制造领域的一个关键过程。然而，选择最合适的提取方法的过程受到一些因素的影响，如产品的组成、存在的植物化学物质的类型和实验室的预算限制。 重要的是，没有一种理想粗暴的最佳方法来提取所有的植物化学物质。考虑到植物界的多样性，每一种植物都有其独特的化学成分，需要特定的提取方法。例如，某些植物可能富含亲脂性化合物，需要非极性溶剂萃取才能高效回收，而亲水性化合物则需要极性溶剂萃取。因此，选择合适的提取方法是获得最佳植物化学物质产量的关键。

此外，大多数植物化学物质在植物基质中没有自由形式的发现。因此，一个预处理步骤通常是必要的，以将它们从基质中释放出来。这一步可以涉及多种物理化学处理，如干燥、研磨、超声处理、酸/碱加成和微波辅助方法，这取决于植物基质和需要提取的植物化学物质的类型。

近年来，植物化学物质的提取过程发生了重大变化，有毒溶剂的使用也显著减少。相反，人们更喜欢绿色和无毒的替代品，这对环境和消费者都是安全的。消费者和该行业对天然标签产品的需求推动了这一趋势。这种向植物化学物质提取可持续方法的转变，指导加工者探索绿色、安全和食品级的各种溶剂。尽管人们对水、二氧化碳和乙醇等溶剂的有效性感到担忧，但研究发现它们在提取过程中是高效的。这些溶剂由于既环保又经济，被广泛应用。

随着使用绿色和无毒溶剂的趋势继续增长，该行业需要注意它们对环境的影响。使用可持续的溶剂不仅有利于消费者，而且也有利于地球的健康。因此，该行业必须继续寻找新的和创新的方法来提取既环保又高效的植物化学物质。

二、氢气

氢分子是一种无色无味的气体，地球大气中的氢气含量约为0.53 ppm。此外，由于它不会与生物系统中周围的物质发生反应，因此被认为是化学惰性分子。（这其实是一种误解，氢气和生物体系的关系，密切到令人吃惊）

氢气具有在空气、组织和有机及非有机聚合物中高速扩散的独特性质，在生物材料和大分子中具有流动性；例如，在天然橡胶和聚乙烯中，其扩散速率估计为1 mm/min。氢气的非极性特性使其能够轻松穿透生物膜和组织，与乙醇、甲醇和己烷等有机溶剂在水中的溶解度较高相比，氢气在水中的溶解度较低。据报道，氢气可以通过各种材料轻松逸出，当储存在开放式容器中时，从富氢水中每3分钟约有2%–5%的氢气损失。只有铝等金属材料才能提供足够的保护以防止氢气逸出。从生物学角度来看，即使浓度很高，氢气也是一种惰性和非毒性气体，对体温、血压、pH值或pO2等生理参数没有影响。

另一方面，氢气可以在18.3%–59%（v/v）的空气和15%–90%（v/v）的氧气中爆炸。然而，氮气的存在可以降低爆炸的风险。对于提取操作，氢气可以在氮气混合物中安全使用，其含量不超过4/96（v/v）。此外，氢气的自燃温度为500°C。

三、富氢溶剂

气体在水中和其他溶剂中的溶解度取决于温度和压力。由于氢气非极性特性，非极性气体通常在水中溶解度较低。气体在水中的溶解度随着压力的增加而增加，反之亦然，随着温度的升高而降低。有趣的是，氢气在甲醇和乙醇等正醇中的溶解度与在水中的溶解度有很大不同。氢气在甲醇和乙醇等溶剂中，溶解度随着温度的升高而增加。不过，盐存在会导致氢气溶解度的降低。

3.1 富氢溶剂的制备方法

制备富氢溶剂的一种可靠且简单的方法是将氢气直接注入溶剂中。在此方法中，将纯度大于99.99%的纯氢气以特定的速率鼓泡到溶剂中数分钟，直到达到饱和点。由于氢气在水中和有机溶剂中的溶解度较低，因此不需要更长的鼓泡时间。然而，为了生产纳米气泡，更小尺寸的气泡更为合适。因此，使用小尺寸气泡材料对于高效生产纳米气泡至关重要。在进行任何鼓泡过程时，安全考虑必须放在首位。使用配备排气管的密闭锥形瓶非常重要，可以将有危险气体（如氢气）排放到实验室外部（如图1所示）。为了进一步确保安全，必须在鼓泡过程中保持实验室通风良好，打开门窗。还建议严格禁止使用任何电气开关以避免任何意外火花。最后，强烈建议在实验室安装氢气传感器，因为它可以作为额外的安全措施来监测和检测任何潜在的危险泄漏。

在实验室环境中，安全是首要考虑因素，使用镁（Mg）可以成为一种可靠且安全的氢气制备方法（图1）。当镁与水接触时，镁和水结合产生氢氧化镁（Mg(OH)2）和氢气。值得注意的是，理论上，一克镁可以产生1升氢气。然而，在实际情况下，氢气的产量可能仅能达到理论容量的10%。

提高氢气产量的最佳方法之一是使用酸，如稀盐酸或更优选的有机酸，如柠檬酸。根据我们团队的经验，我们建议使用10-100毫克粒径小于0.1毫米的镁与100-1000毫升纯水反应，以产生约10-100毫升的氢气。这个体积的氢气足以制备100-1000毫升的富氢溶剂（氢溶液）。通过向水/镁混合物中加入0.1M柠檬酸或其他有机酸，可以在更短的时间内以显著的效率获得所需氢气量。

需要强调的是，使用镁制备富氢溶液的方法更安全、成本效益更高，并且适合实验室环境。我们发现，遵循这些精确的说明，可以显著提高氢气的产量，从而获得更好的产率。重要的是要记住，这个过程需要适当的操作和专业知识才能确保更理想。

3.2 氢溶液提取过程的程序

在这里，我将总结一种制备具有高酚类和抗氧化物含量提取物的程序。这个程序基于我们的实验测定。

图1 两种氢溶液制备方法。

3.2.1 第一种选择

(1) 氢溶液按照上述方法（通过氢气鼓泡或镁法）在Erlenmeyer烧瓶（或其他适当设备）中制备（图1）。

(2) 将样品的干粉放入空Schott瓶（或等效设备）中。

(3) 将氢溶液倒入放置在Schott瓶中的样品粉末上。

(4) 用配备O型圈（以确保气密密封）和管道的高密封性高效液相色谱（HPLC）类型盖子封闭Schott瓶。

(5) 将氢气短暂注入Schott瓶的顶部空间以从顶部空间排出空气（仅在氢溶液制备步骤中进行，而不是在孵育阶段）。

(6) 将含有样品的Schott瓶放置在适当的温度、时间和摇动速度的摇动孵育器中。

(7) 根据需要过滤氢溶液-样品溶液。

3.2.2 第二种选择

(1) 将样品的干粉放入配备有高密封性HPLC类型盖子和O型圈（以确保气密密封）以及管道的Schott瓶中。

(2) 向Schott瓶中添加溶剂。

(3) 将Schott瓶密封。

(4) 通过气体管道以适当的流速和时间将氢气注入包含样品的溶剂中（仅在氢溶液制备步骤中进行，而不是在孵育阶段）（图1）。

(5) 将Schott瓶放置在所需的温度、时间和摇动速度的摇动孵育器中。

(6) 根据需要过滤氢溶液-样品溶液。

3.3 实践注意事项

我们的研究小组发现，瓶子顶部空间中存在氢气比换成空气对提取植物化学物质更有效（未发表的数据）。 在过滤步骤中，我们的实验没有显示出过滤类型（纸过滤器、离心、0.45微米过滤器）对提取物（植物化学物质、酚类、类黄酮、花青素和抗氧化剂）水平有显著影响（未发表的数据）。

四、氢溶液在植物化学提取中的应用

氢溶液在植物化学提取中的4个例子

植物化学物质是一组具有巨大营养和药用价值的生物活性物质。在这些生物活性物质中，酚类化合物在农业和食品材料中最为丰富，包括废弃的部分，例如果皮和种子。研究人员对农业食品废弃物进行了广泛的研究，以探索其作为植物化学物质来源的潜力，这不仅有利于环境，而且具有经济优势。为了提取这些有价值的酚类化合物，通常使用有机溶剂，如甲醇和乙醇以及水。溶剂的选择取决于溶剂和酚类化合物的极性。浸渍虽然效率较低，但仍是从植物材料中提取植物化学物质最广泛的方法。

我们的团队最近开发了一种尖端的提取方法，使用氢气注入溶剂。这项技术有助于提取植物化学物质，如酚类、黄酮类化合物、花青素和抗氧化剂。采用该方法对几种农业食品废弃物和副产品进行了分析，发现它们是非常有效的。 在萃取过程中注入氢气，显著提高了萃取效率。这种创新的方法是环保的，因为使用化学溶剂的危害减少了，这可能对环境有害。 采用该方法对各种农业食品废弃物进行了检测，结果具有良好的应用前景。提取效率较传统方法明显高于传统方法。这种新的氢气注入方法为可持续和环保的植物化合物提取领域开辟了巨大的可能性。我们的团队相信，这种新的提取方法将彻底改变提取行业，我们期待着在这一领域进行更多的科学研究。

4.1 农业食品废物 

随着世界人口的不断增长以及气候变化和全球流行病的影响，对农作物的需求不断增加。因此，研究人员和行业正在寻找新的方法来利用农业和食品废物以成本效益高的方式生产植物化学物质。 这引起了科学界和工业界的极大兴趣，并导致了一系列研究，重点是将农业食品废物转化为有价值的植物化学物质。通过创新研究，行业可以有效地利用这些被低估的材料生产出具有革命性的植物化学物质，从而革新农业和食品行业。 对农作物的需求推动了科学界和行业探索新的方法，将农业食品废物作为提取有价值植物化学物质的源。这不仅解决了废物管理的问题，还有助于以成本效益和可持续的方式增加植物化学物质的生产。 我们的研究小组最近评估了使用氢溶液作为绿色溶剂从不同农业食品废物中提取植物化学物质，包括番茄皮、苹果皮、柠檬皮、红甘蓝叶和胡萝卜。 提取物是通过将1克植物粉末加入20毫升溶剂中制备的，然后在摇动孵育器中孵育24小时（120rpm，25°C）。

通过两种方法制备氢气水溶液：氢气鼓泡和镁与水反应。在这个实验中，镁被引入到包含植物样品的溶剂中。通过比较氢气水溶液和乙醇的提取效率，评估了氢气水溶液提取植物化学物质的效率。在所有农业食品废物中，氢气水溶液提取物的总酚含量（TPCs）高于纯水提取物；在乙醇/氢气水溶液（50/50）提取物中，TPCs高于乙醇/水（50/50）提取物。当单独使用氢气水溶液或与乙醇一起使用时，酚类化合物（TPC）的提取显著提高。所有农业食品废物的TPC增加了22%至50%（表1）。同样，当氢气水溶液添加到乙醇中时（50/50，v/v），与纯水/乙醇提取物相比，TPC也有所增加。然而，这种增加不如仅使用氢气水溶液样本那么强效。此外，含有镁离子的水导致提取物的TPC降低。这可能是由于介质中存在镁离子对酚类化合物产生负面影响。使用含镁水有效地使TPC降低了17%至70%。同样，使用含镁水与乙醇（50/50，v/v）提取的TPC降低了19%至59%。溶剂中镁离子的存在可能对酚类化合物的稳定性产生负面影响。Ca2+和Mg2+离子可能与茶叶中的酚类物质结合。此外，在茶叶叶片的提取过程中使用高度矿化水会导致钙的吸收，钙可以与细胞壁中的果胶物质结合，改变其性质，从而限制有机和无机物质的提取并降低提取产量。这表明在提取过程中使用去离子（蒸馏或纯）水和其他溶剂的重要性。因此，在所有农业食品废物中，氢气水溶液提取物显示出最高的TPC，其次是乙醇/氢气水溶液（50/50）提取物。

表格1显示了氢气融入溶剂对从不同农业食品废物和副产品中提取植物化学物质的影响。 

在总黄酮类化合物的提取方面，使用氢气水溶液的效果最为显著。研究结果表明，使用氢气水溶液提取的农业食品废物的总黄酮含量（TFC）比纯水样品高16%至53%（表1）。当使用氢气水溶液代替纯水制备含水乙醇溶剂（50/50，v/v）时，TFC增加了15.3%至45%。与酚类含量一样，对于所有农业食品废物，最高的TFC水平是氢气水溶液提取物，其次是乙醇/氢气水溶液（50/50）提取物。另一方面，与纯水相比，使用含镁的水提取黄酮类化合物会降低提取效率。当使用Mg水代替纯水时，观察到黄酮类化合物的提取减少了6%至26%和12%至33%。 花青素的表现与酚类和黄酮类化合物相似。使用氢气水溶液代替纯水提高了所有农业食品废物中花青素的提取量，增加了16%至53%（表1）。当使用氢气水溶液制备含水乙醇溶剂（50/50，v/v）时，与纯水/乙醇样品相比，花青素的提取增加了15%至45%。同样，在农业食品废物中提取花青素时，使用含镁的水会降低提取效率。当使用Mg水代替纯水时，花青素含量减少了6%至26%；当使用Mg水代替纯水制备含水乙醇溶剂（50/50，v/v）时，花青素含量减少了12%至33%。 从农业食品废物中提取植物化学物质的过程中，使用氢气水溶液还可以提高对DPPH和ABTS自由基的清除活性。当使用氢气水溶液代替纯水时，DPPH清除活性增加了9%至142%；当使用氢气水溶液代替纯水制备含水乙醇溶剂（50/50，v/v）时，DPPH清除活性增加了19%至171%（表1）。 当使用氢气水溶液代替纯水进行提取过程时，ABTS清除活性也提高了14%至28%；当使用氢气水溶液制备含水乙醇溶剂（50/50，v/v）时，ABTS清除活性提高了18%至32%（表1）。 在DPPH和ABTS清除活性测定中，使用含镁的水提取会导致提取物的抗氧化活性降低高达74%。 HPLC分析证实了氢溶液中酚类化合物的增加。氢气水溶液可以有效地增加非黄酮类化合物（羟基苯甲酸和羟基肉桂酸）以及黄酮类化合物从农业食品废物中的提取。 在番茄皮的氢气水溶液提取物中，没食子酸、绿原酸、咖啡酸、儿茶素和芦丁的水平比纯水提取物增加了三倍。在红甘蓝的氢气水溶液提取物中，没食子酸、对香豆酸、表儿茶素和芦丁的水平分别增加了82倍、6.7倍、3倍和4倍。在苹果皮的氢气水溶液提取物中，没食子酸、绿原酸、对香豆酸、反式阿魏酸和表儿茶素的水平显著增加，而它们在纯水提取物中未出现。在柠檬皮的氢气水溶液提取物中，大多数酚酸和黄酮类化合物的水平在使用氢气水溶液代替纯水进行提取过程中增加；没食子酸、绿原酸、对香豆酸、反式阿魏酸、迷迭香酸、儿茶素、表儿茶素和芦丁的水平增加了约两倍。在胡萝卜的氢气水溶液提取物中，没食子酸和绿原酸的水平高于纯水提取物。

4.2 农业副产品提取 

4.2.1 橄榄叶

橄榄叶含有高浓度的植物化学物，这些化合物是与各种健康益处相关的有益化合物。在橄榄叶中发现的最显著的植物化学物是酚类化合物。这些酚类化合物已被发现具有一系列生物活性，有助于橄榄叶提取物的整体健康益处，包括降血糖、抗高血压、抗氧化、抗菌和抗炎作用。 我们的团队研究了氢化水硼(氢气水溶液)在从橄榄叶中提取酚类化合物方面的潜在用途。将一克橄榄叶粉末加入20毫升纯水、氢气水溶液、乙醇和乙醇镁水中，然后进行24小时混合(120转/25°C)。在纸过滤步骤后，将溶剂从滤液中分离出来，使用旋转蒸发器(35°C)对乙醇性溶剂进行加热，对水性溶剂进行真空烘箱(35°C)加热。 氢气水溶液表现出比其他溶剂更高的提取效率，其提取收率为34.42%(氢气水溶液)和19.27%(纯水)(表1)。关于酚类化合物的提取，氢气水溶液表现出最高的提取能力，其提取量是纯水的两倍(49.22毫克/克提取物vs 25.16毫克/克提取物)。纯水/乙醇(50/50)的萃取物的TPC为29.44毫克/克提取物，而镁水样本的TPC为27.06毫克/克。Mg水/乙醇(50/50)萃取物包含44.92毫克/克提取物。 同样，氢气水溶液萃取物表现出最高的黄酮类含量(TFC),而纯水萃取物表现出最低的TFC(分别为46.29毫克/克提取物和12.49毫克/克提取物)。与酚类情况类似，Mg水和纯水/乙醇(50/50)略微改善了黄酮类的提取(分别为14.55毫克/克提取物和17.40毫克/克提取物),而Mg水/乙醇(50/50)显著提高了它们的提取量(分别为22.02毫克/克提取物)。 氢气水溶液还表现出从橄榄叶中提取抗氧化剂的能力。氢气水溶液萃取物对DPPH和ABTS自由基的清除活性最高(分别为22.59毫克/克萃取物和18.61毫克/克萃取物),而纯水萃取物分别为14.01毫克/克萃取物和8.50毫克/克萃取物。 总之，与纯水样本相比，在从橄榄叶中提取植物化学物的过程中，氢气水溶液的使用使TPC提高了95.63%,TFC提高了290.62%(表1),抗氧化剂活性分别提高了60.78%(针对DPPH自由基)和118.94%(针对ABTS自由基)。HPLC分析证实了光谱学分析得到的结果。当氢气水溶液而不是纯水被用于提取过程时，酚类和黄酮类物质都增加了，包括石榴酸、p-香豆酸、反式异构焦磷酸、迷迭香酸、儿茶素、表没食子酸酯和表没食子酸酯。在含氢溶剂中，即氢气水溶液中，与纯水对照组相比，焦磷酸二羟丙酮和表没食子酸酯水平分别提高了1.3-和20-倍。该研究表明，氢对酚类化合物氧化的保护作用。对于羟甲基苯甲酸这种羟甲基化程度较低的醇类酸性化合物而言，其焦磷酸二羟丙酮的提取仅提高了1.3-倍。 另一方面，纯水/乙醇(50/50)的提取略微改善了酚类化合物的提取，而Mg水/乙醇(50/50)的值与氢气水溶液相当，这可能与两种溶剂中都含有氢有关。氢化水硼溶剂相对于纯溶剂的优势解释了水能够膨胀植物材料并增加可提取性，使溶剂更容易渗透到植物组织中。然而，氢化乙醇溶剂的缺点是它能溶解其他可提取物质，如糖类和有机酸等，这些物质会一起被提取出来，因此需要额外的净化步骤来分离酚类化合物。 在最近的一项研究中，评估了氢硼烷醇(氢溶液)、氢富醇(氢气水溶液)、氢富甲醇[HRM]在从蜂巢胶中提取生物活性化合物方面的作用。结果显示，氢溶液s (氢气水溶液、富含氢的水、富含氢的甲醇[HRM])分别将酚类化合物、类黄酮化合物的提取率提高了19.08%、5.43%和12.71%,而类黄酮化合物则分别提高了28.97%、17.13%和2.06%。此外，这些富含氢的提高还使DPPH清除活性提高了4.0%、0.7%和1.0%,ABTS清除活性分别提高了0.3%、32.4%和6.7%(表1)。HPLC分析证实了这些发现。氢气水溶液表现出最高的石榴酸、氯原酸、咖啡酸、p-香豆酸、反式异构焦磷酸、迷迭香酸、儿茶素、表没食子酸酯和表没食子酸酯水平；而HRM则表现出最高的金丝桃苷水平。

4.2.2 粗橄榄油(COPO)

COPO是橄榄油生产过程中的副产品。它以其深绿色的颜色、高酸度(含3%以上的油酸)、令人不悦的气味和口感而闻名。COPO通常通过用溶剂处理橄榄渣或进行其他物理处理来获得。

尽管COPO可能不如橄榄油受欢迎，但它仍有其用途。这种油富含健康的脂肪和抗氧化剂，使其成为高温烹饪和炸制的良好选择。此外，该油还用于制作肥皂、化妆品和洗涤剂。

由于COPO的高酸度、令人不悦的气味和高蜡含量，因此不能用于人体消费；因此，需要对其进行精炼处理以使其可食用。然而，精炼过程(无论是物理还是化学过程)不仅会去除COPO中的不良化合物(过氧化物、降解产物、负责产生异味的挥发性化合物、游离脂肪酸等),还会损失到宝贵的生物活性化合物，如酚类和天然抗氧化剂。

我们的团队研究了使用氢气水溶液在处理COPO以改善其质量的可能性。为此，我们将30毫升的COPO与15毫升的氢气水溶液混合，然后进行分离步骤(在4°C下，3000克/分钟离心10分钟)。这个洗涤过程进行了三次。

每次洗涤过程都使COPO的颜色有所改善，即变得更纯净，生成更绿、黄的产品(低a值和高b值)。这可能是通过从橄榄油样品中清除杂质并使色素(叶绿素和类胡萝卜素)更纯化实现的。此外，洗涤水的类型对a和b值有显著影响。这一结果是通过测量颜色饱和度c*得到的，其值在氢气水溶液洗涤过的COPO样品中比正常水洗涤的样品要低。这也意味着在氢气水溶液洗涤过的样品中，橄榄油产品的色彩饱和度较低。

在植物化学实验中，使用氢溶液s(甲醇和乙醇)从COPO样品中提取酚类化合物和抗氧化剂。使用的甲醇是纯甲醇和水的混合物(60/40,v/v)。COPO洗涤样品的总酚类化合物(TPCs)和总黄酮类化合物(TFCs)如下所示：HRM + 氢富己烷(50/50,v/v)> 甲醇 + 氢富己烷(50/50,v/v)> HRM + 己烷(50/50,v/v)> 甲醇 + 己烷(50/50,v/v)。这表明，在提取过程中，当使用氢富己烷和HRM(50/50,v/v)时，从COPO样品中提取酚类化合物和类黄酮化合物的效果更好；而氢富己烷比HRM效果更好。这些结果可以通过乙烷从非极性酚类化合物(例如托克萝、托克萝醇)中提取出来得到解释，而极性酚类化合物(例如肉桂酸和苯甲酸)、酚类醇类化合物、异戊烯基类化合物、黄酮类化合物、羟基异戊烯基类化合物和类黄酮化合物则由甲醇提取。

同样地，COPO提取物的抗氧化活性(DPPH和ABTS清除活性)按以下顺序排列：HRM + 氢富己烷(50/50,v/v)> 甲醇 + 氢富己烷(50/50,v/v)> 己烷+ HRM (50/50,v/v)> 甲醇+己烷(50/50,v/v)。这些结果也可以从乙烷和甲醇分别从极性和非极性抗氧化剂中提取出来得到解释。

该研究的结果表明，在提取橄榄油样品中的酚类、类黄酮化合物和抗氧化剂成分方面，特别是在利用氢富己烷的情况下，氢溶液s的重要性不容忽视。

氢对植物化学物质提取影响的可能机制 5.1酚类物质对氧化反应的保护 酚类化合物包含一个或多个附着在芳香环上的羟基（-OH）。这些羟基对氧化反应非常敏感，特别是在有氧或其他氧化剂存在的情况下。酚类化合物的反应性质来自于羟基的存在，羟基包含一个高度反应性的氢原子。这个氢原子可以通过活性氧（ROS）提取，如超氧化自由基（O2−）、过氧化氢（horhO2）和羟基自由基（氢氧化物）。酚类化合物中多个羟基的存在可以提高它们的氧化敏感性。这是因为每个羟基都可以作为一个潜在的氧化部位，导致多个活性自由基的形成。53

酚类化合物的主要氧化产物是具有亲核性质的醌类。醌类可以由多酚氧化酶（PPOs）/O2或过氧化物酶/氢氧化氢酶解形成，或通过对苯二酚和儿茶酚的交叉反应和自氧化形成（图2A）。55自氧化由微量的过渡金属离子如Fe和Cu催化（图2B）。

氢气可能对酚类化合物、类黄酮化合物和抗氧化剂产生影响，这些化合物与氧化性物质(ROS)反应。图解根据Waterhouse和Laurie和Schieb改编而成。 通过化学或酶催化形成的喹啉类化合物是电子不足的，具有高度活性的中间体，它们很容易与亲核基团发生所谓的Michael加成反应。它们还可以通过简单的可逆电子转移反应体系进行处理，其特点是寿命短(约1秒)和对还原剂的高反应速率。将亲核基团加到喹啉类化合物上是不可逆的。此外，一些喹啉类化合物可以通过Michael加成反应由氨基酸、多肽、蛋白质和胺类还原剂还原，形成一种络合物(图2C)。 介质(Eh)的氧化势是影响半喹啉类自由基浓度的主要因素之一。在无还原剂的情况下，在有氧条件下，氧气丰富的表层水中，带负电荷的低级喹啉类化合物(接近中性的pH条件，类似于纯水提取物)的氧化形式占主导地位。作为还原剂(亲核基团),抗坏血酸可以瞬间将氧化形式的o-喹啉还原回甲羟戊酸，从而防止高活性喹啉的剧烈反应。然而，在生物系统中，抗坏血酸的消耗会导致其完全耗尽，因为还原甲羟戊酸的内源性氧化酶会对其进行再氧化循环。这种现象导致了细胞还原势能的降低以及包括抗坏血酸在内的细胞还原剂(如硫醇、硫代硫酸盐和其他亲核基团)的耗竭，从而产生有害影响。 氢气可能对喹啉类化合物的影响： 氢分子具有向不稳定的喹啉类中间体(包括带负电荷的低级喹啉类[图2B])捐赠电子的能力。氢气与喹啉类化合物的反应可能会减少这些活性氧化物质对酚类化合物的氧化作用，从而保护酚类化合物免受氧化作用的影响。 通过比较许多农业废弃物和副产品中的氢溶液提取物与正常溶剂提取物的结果，可以观察到这些可能的减少喹啉类和半喹啉类化合物与氢气反应的效果。 此外，环境的氧化势也会影响喹啉类化合物及其被氢气还原的能力。例如，在氧化势较高的环境中，喹啉类化合物可能以氧化形式稳定存在，不易被氢气还原。相反，在氧化势较低的环境(如氢溶液提取物中的氧化势)中，喹啉类化合物可能更容易被氢气还原。 氢气可能对ROS的影响： 介质中的氧分子可在铁等过渡金属的存在下生成ROS(氢过氧根离子)[图2A]。形成的氢过氧根离子(HOO•)可以与酚类化合物反应生成半喹啉类自由基[图2A]。含有1,2-二羟基、1-羟基或1-羟基-4-羰基的酚类化合物容易发生氧化反应，生成醌式半喹啉自由基。其他属于这类酚类的例子包括咖啡酸、儿茶素、表没食子酸酯、绿原酸、原花青素、水杨酸、可溶性单宁、褐藻酸和quercetin等。因此，酚类和类黄酮通过自由基/低分子清除作用可以降低TPC和TFC水平。 酚类氧化可以被酶催化(如抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶[SOD])或非酶催化的ROS清除剂(如氢气)抑制[图2]。 分子氢具有降低热力学性质的还原性，使其成为一种有效的抗氧化剂。它参与pH为7时的生物电子传递系统，其标准还原电势为−420 mV。因此，它可以保护酚类和抗氧化剂免受氧化反应的影响，使它们对分解作用更不敏感。 此外，氢气对最强的自由基具有选择性抗氧化性能，即羟基自由基(•OH)和过氧亚硝酸根离子(ONOO−),这有助于保护细胞、酚类、类黄酮和其他抗氧化剂免受氧化反应的影响[图2A]。 我们的研究表明，使用氢溶液可以从不同的植物材料中提取酚类和类黄酮化合物。尽管如此，介质中的氢气在提取过程中可能仍有可能保护植物化学成分免受氧化反应的影响。这在植物材料受到研磨或浸泡处理时尤为重要，因为这会破坏它们的结构，使它们更容易受到氧气和氧化反应的影响。 降低性似乎在保护酚类化合物免受氧化反应方面发挥着重要作用。据报道，向水中添加SO2(还原剂)形成了具有类似氢气水溶液氧化性的弱酸性溶液，从而改善了从红酒葡萄中提取花青素和从磨碎黑莓中提取酚类化合物的效果[^66]。氢气水溶液和硫化水之间的相似性可能是解释发现氢溶液样品中酚类和类黄酮含量增加的原因。提高固体中分子的溶解度和扩散系数是解释使用SO2提取SO2改善酚类提取效果机制的理论依据，这些机制与氢气水溶液中发现的氢性质一致[^66]。然而，由于对人体健康的有害影响，食品中使用SO2受到立法限制。

5.4 PPO反应产物的清除作用

酚类化合物的氧化反应可以是酶促的，也可以是非酶促的，并且可以受到各种因素的影响，如介质的组成、pH值、温度、辐射和基质性质。对酚类化合物的稳定性产生负面影响的关键因素之一是氧化酶的存在，包括PPOs以及分子氧、自由基、溶解氧和过渡金属。因此，谨慎选择提取方法以尽量减少植物化学物质对这些因素的暴露是很重要的。

在氧气的存在下，PPO可以催化酚类化合物的氧化，形成高活性的中间体，即醌类，它可以与不同的化合物进入各种反应，形成一种称为黑色素的棕色化合物。酚酸和一些类黄酮均已被鉴定为潜在的PPO底物。酚类化合物可以通过迈克尔加成反应与蛋白质反应形成彩色的加合物，而醌类和氨基酸巯基（半胱氨酸和谷胱甘肽）之间的反应产生无色的加合物。

酚类化合物分别在植物细胞的不同隔室中处于稳定/潜伏状态。细胞结构解体后，PPO和酚类化合物被释放并相遇，引发氧化反应，产生高度亲电性的醌类，可以氧化其他酚类化合物。形成的邻醌可以参与酚类化合物或蛋白质的亲核加成，导致酚类化合物和其他化合物之间形成二聚物和共价键。例如，非PPO底物的原花青素可以通过涉及咖啡酰喹宁酸邻醌的偶联氧化还原反应转化为相应的邻醌（图3）。

图3 氢气对多酚氧化酶产物影响的可能机制。

PPO在酚类化合物氧化过程中形成的邻醌也可参与ROS作为二次反应产物的间接生成。邻醌反歧化产生的半醌自由基与O2的相互作用导致超氧阴离子（O2−）的形成和邻醌的再生（图3）。超氧阴离子非常不稳定，会很快通过SOD酶解或非酶解形成过氧化氢（H2O2）。相对稳定的过氧化氢可以通过Fenton反应与铁（II）等二价金属离子发生反应，生成羟基自由基（OH），这是一种强的非选择性氧化剂。 氢已被证明能够清除羟基自由基（OH），但不能清除过氧化氢（H2O2）（图3）。因此，培养基中氢作为还原剂的存在（如氢气水溶液提取物）可以通过清除ROS保护酚类化合物和黄酮类免受化合物的氧化反应。

另一方面，氢作为还原剂的存在与醌的潜在反应可以限制羟基自由基的形成通过降低半醌的形成，超氧阴离子的底物，这是过氧化氢的底物，这是羟基自由基的底物（图3）。

石桥认为，包括不稳定的半醌在内的醌中间体由于其高反应活性，可能与氢发生非酶反应（图3）。在另一项研究中，氢可能中和半醌自由基，导致复合物III产生的超氧化物水平降低。醌中间体可以通过氢的正向电子转移完全还原为酚类（喹诺），这减少了Q池中半醌相关超氧化物的形成，从而增加了Q池的抗氧化潜能（图3）。 进一步研究氢气对PPOs活性和基因表达的影响具有重要意义。由于PPO含有一个含铜的活性位点，这将为氢作为还原剂对其活性的可能影响提供信息。

5.5缺氧

由于氢气鼓泡过程，氢气水溶液含有的溶解氧比纯水少，溶解氧的缺失也可能保护酚类化合物在萃取过程中免受酶氧化和非酶氧化。据报道，橄榄糊在氮气氛（氮）下的脱解过程避免了酚类化合物特别是邻二酚的氧化。据报道，PPO和过氧化氢酶（CAT）都能够氧化邻二酚和非邻二酚。

5.6氧化还原稳态

氢在常温常压下溶解于水中1.6 mg/l，氧化还原值（Eh）为−283mV，显示出一种还原特性，有助于保持细胞内的氧化还原状态，允许保护抗氧化剂和酚类物质免受氧化反应（图4）。 

图 4氢气对细胞内稳态影响的可能机制。

参与生物电子转移系统的2H+/氢的标准还原电位为−420mV（pH 7），表明溶解氢具有热力学还原能力，维持细胞内氧化还原稳态，保护酚类和抗氧化剂免受氧化反应。

该细胞具有一个氧化还原稳态系统，调节许多关键功能。这种氧化还原稳态受到不同因素的调节，包括酶（过氧化氢酶、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶）、金属离子（Fe、Cu、Mg等），代谢物（ATP/AMP、GAPDH和三羧酸循环中间体）、气体信号分子（ROS、氢、氢氢、CO、NO等），和内部抗氧化剂（抗坏血酸、维生素E、β-胡萝卜素、尿酸盐和thiols）.13，ROS的产生导致氧化还原稳态的扰动。然而，培养基中氢的存在可以清除最强的ROS，即OH和ONOO−，从而维持细胞的氧化还原稳态（图4）。

5.7溶剂物理性质的变化

氢加入水导致水中形成小簇（5到6个分子），而普通水形成13-16个分子的簇（图5）。氢气水溶液的小簇被认为在生物物理和生物活性方面更活跃。氢气水溶液具有帮助提取植物化学物质的特性，如低表面张力、高溶解力、高溶解能力、高扩散速率、较高的活性性能和更好的穿透生物膜。这些特性有助于增加溶剂和样品之间的接触面，使溶剂能够更好地穿透植物材料，解决植物化学物质（图5）。

图5 氢气对溶剂物理性质的影响的可能机制。根据Lapin等人对原理图进行了调整。

氢的这些独特特性可以解释氢气水溶液不仅在提取植物化学物质方面的有益作用，而且在不同的植物、食物、动物和人类研究中的有益作用。

5.8裂解多糖单加氧酶（LPMOs）

LPMOs是一种单铜酶，参与多糖的解聚，如纤维素、其他聚糖、木聚糖、几丁质、果胶和淀粉。它们的作用模式依赖于在还原剂（电子供体）存在的情况下，使用分子氧或过氧化氢作为共底物的聚合物碳水化合物的糖苷键的氧化断裂。在34种还原剂中，抗坏血酸被认为是LPMOs的最佳电子供体。阿魏酸和对香豆酸是并入细胞壁结构的主要羟基肉桂酸衍生物。

在橄榄叶的氢气水溶液提取物中发现的这两种酚酸含量的高增加可能与LPMOs可能水解细胞壁多糖有关，其中还原剂（氢）可能发挥电子供体的作用（图6）。此外，氢是一个强大的还原剂与一个小尺寸，可以让它渗透和达到Cu2+LPMO的活性网站，减少铜+，促进细胞壁多糖的解聚和释放被困的酚酸（图6）。然而，由于到目前为止还没有LPMOs的植物来源的报道，81种微生物污染作为这些酶的外部来源可能被认为发生在提取过程的长浸渍阶段。

图6 氢对溶解多糖单加氧酶（LPMO）影响的可能机制。

另一方面，据报道，植物细胞壁富含酚酸和酚酸，即香豆酸、阿魏酸和迷迭香酸。与正常纯水提取物相比，橄榄叶中香豆酸、主要壁结合酚酸和阿魏酸的水平分别增加了约20倍和1.3倍。

5.9植物物质的物理结构和形态结构的变化

由于氢的高扩散能力，将植物材料浸入氢溶液中可能导致组织结构的各种变化。一项对浸在各种气体起泡水中的新鲜绿茶叶片进行的研究表明，与使用其他气体（O2、二氧化碳、氮和空气）起泡水中的样品相比，氢气水溶液样品的酚类含量有所增加。作者注意到经过氢气水溶液处理的绿茶叶片表面的物理和形态损伤，这在其他气体（氮、二氧化碳、o2和空气）中没有发现。氢气水溶液处理后对植物材料结构的这种修饰可能有助于壁面偶联酚类物质的释放，从而导致酚类物质含量的增加（图7）。 

图7 氢气对植物材料结构影响的可能机制。

用(A)蒸馏水（DW）和(B)富氢水（氢气水溶液）处理的绿茶叶片的扫描电镜（SEM）图像。根据Ryu等人进行了修改。 在绿茶氢气水溶液提取物中发现的高酚类含量与溶剂中没有o2无关，因为在氢气起泡水中发现的溶解氧值高于氮气和空气起泡水。

5.10空化

空化是一个旨在产生大量微小气泡（空洞）的过程，这些气泡随后在液固界面坍塌，释放大量能量，在大量反应部位产生较高的局部温度和压力。氮气气泡在固液界面破裂，导致植物材料的细胞壁结构发生降解（图8）。结合在细胞壁上的酚类化合物可以在气泡爆炸后被释放出来，导致酚类物质在溶剂中的溶解。

图8 氢气泡空化对植物材料结构影响的可能机制。

产生空化的方法有两种：声学（超声波）空化和水动力空化。超声波空化法是从植物材料中提取植物化学物质的一种有效方法。然而，超声波空化会加热介质，导致温度升高，从而破坏耐热化合物。 在Ryu及其同事（2019年）的研究中，将不同的气体（氢气、氮气、二氧化碳和空气）在含叶水中0.5 L/min冒泡10 min制备绿茶叶片灌注液。结果表明，起泡样品的TPC和抗氧化活性高于非冒泡样品。然而，在我们团队发表的研究中，没有鼓泡的影响，因为氢溶液是在添加植物样品之前就准备好的。这意味着空化现象不可能是我们实验室研究中植物化学提取量增加的机制。

六、结论

提取是在包括食品、制药和化妆品行业等各种行业中不可或缺的过程。适当的提取也是与生物活性相关的分析的关键步骤，例如植物化学成分的测定，其中包括酚类、黄酮类和花青素。此外，提取过程在抗氧化活性测定试验中起着重要作用，如DPPH、ABTS、FRAP和CUPRAC试验。因此，为了获得准确的生物活性分析结果，确保提取过程的效率非常重要。已经提出了几种提取方法，特别是新兴的方法，但它们都有特定的要求。这些新方法需要昂贵的设备、困难的维护和大量的能源消耗。

我们的研究团队在过去几年一直致力于开发氢溶液提取方法。我们的研究结果表明，这种方法具有最理想的提取特性。它不需要额外的设备，几乎不使用能源，并且不会产生任何废物或有害物质。我们的团队通过从不同的农业食品废料和副产品中提取植物化学物质来测试这种方法。在所有被检测的产品上，使用氢溶液s显著提高了提取产量、TPCs、TFCs、总花青素含量以及不同酚酸和黄酮类化合物的谱图。该方法还增加了抗氧化活性，提供了显著的结果。所有关于氢溶液的研究都集中在极性植物化学成分上；需要开展新的研究来评估这种新颖方法对非极性化合物提取的影响。

氢溶液提取方法将对研究人员、实验室和行业有益，特别是对于那些预算有限和资金有限的机构来说。氢溶液提取方法可以高效地提取植物化学物质，而无需投入大量资金购买额外的仪器或增加已有的废物流。这是一种环保的方式，以最小的投资实现最佳效果。