胞外基质（ECM）作为细胞赖以生存的外界微环境，不仅为细胞提供结构支撑，还通过与细胞表面受体的相互作用调控细胞增殖、分化、迁移等关键生物学过程。在细胞生物学研究中，实现细胞与细胞外基质的温和解离、组织器官中细胞的精准分离是开展实验的前提。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）作为一种具有独特底物特异性的中性金属蛋白酶，能够在保持细胞活性的前提下，选择性降解细胞外基质中的纤维连接蛋白、层粘连蛋白等关键成分，同时避免对细胞表面的蛋白造成过度损伤。因此，Neutral Protease II在原代细胞的分离与培养、组织器官中的细胞解离以及类器官研究中有着广泛的应用。
一、Neutral Protease II的作用机理
Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）是一种源自芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）的M4 家族金属蛋白酶，其成熟肽链由约480个氨基酸残基组成，Neutral Protease II 的三维结构呈现典型的 “沙漏型” 折叠，核心区域包含一个由锌离子、两个组氨酸（His）和一个谷氨酸（Glu）组成的活性中心，即 “HEXXH” 保守序列，这一结构是金属蛋白酶催化底物水解的关键位点。Neutral Protease II 具有严格的底物选择性，主要作用于细胞外基质中的纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白 IV 型等非纤维状胶原成分，对 I 型、II 型等纤维状胶原的降解活性较低。其底物识别位点通常为含有亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）等疏水氨基酸残基的肽键，尤其偏好水解位于疏水性氨基酸 C 端的肽键，这种特异性使其能够精准解离细胞与细胞外基质之间的连接，而对细胞间直接连接（如紧密连接、桥粒）的影响较小。Neutral Protease II 的最适 pH 值范围为 7.0-8.0，属于中性蛋白酶，在生理 pH 环境下可保持较高的催化活性，Neutral Protease II 的最适反应温度为 37℃，与哺乳动物细胞的培养温度一致，进一步提升了其在细胞相关实验中的适用性。此外，Neutral Protease II 的活性依赖于锌离子的存在，EDTA 等金属离子螯合剂可通过螯合锌离子显著抑制Neutral Protease II 的活性，而 Ca²⁺则对该酶的稳定性具有一定的促进作用，在反应体系中添加适量 Ca²⁺可延长其活性维持时间。
二、Neutral Protease II在科研领域中的应用
1. Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II）用于原代细胞分离
原代细胞因其保留了体内细胞的生物学特性，在细胞功能研究、药物筛选模型的构建等领域具有不可替代的作用。然而，组织中的细胞被大量胞外基质包裹，传统的机械研磨或胰蛋白酶消化方法往往存在细胞活性低、分离效率差等问题。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）凭借其温和的解离特性，已成为多种组织原代细胞分离的首选工具酶之一。例如，在小鼠乳腺上皮细胞的分离中，将乳腺组织剪碎后用 Neutral Protease II在 37℃下孵育 1-2 小时，可有效降解乳腺组织中的细胞外基质，使上皮细胞团从间质组织中分离，后续再联合Collagenase I 消化，即可获得高活性的乳腺上皮单细胞悬液[1, 2]。类似地，在神经干细胞的分离中，Neutral Protease II 可用于从胼胝骨下方区域分离出神经干细胞。相较于胰蛋白酶，Neutral Protease II 能更好地保留神经干细胞的自我更新能力和分化潜能，分离得到的细胞在体外培养体系中可形成更多的神经球，且向神经元和胶质细胞分化的比例更高[3]。
图 1. 利用Neutral Protease II从胼胝骨下区分离出神经干细胞并形成神经球[3]
2. Neutral Protease II用于贴壁细胞传代
对于某些贴壁生长能力较强的细胞系（如成纤维细胞、上皮细胞），传统的胰蛋白酶消化法可能导致细胞表面蛋白损伤，影响细胞的后续生长和功能。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可通过特异性降解细胞与培养皿表面之间的细胞外基质成分（如纤维连接蛋白），实现细胞的温和解离。在实际操作中，将 Neutral Protease II 溶液加入培养皿中，37℃孵育数分钟后，细胞即可从培养皿表面脱落，且细胞聚集体较小，轻轻吹打即可分散，这可降低细胞机械损伤的风险。研究表明，使用 Neutral Protease II 传代的人皮肤成纤维细胞，其细胞活力和生长状态要优于传统胰蛋白酶和EDTA消化的细胞，这表明Neutral Protease II 对某些细胞的生理功能影响更小[4]。
3. Neutral Protease II用于组织器官解离
随着单细胞测序技术的快速发展，获取高质量的单细胞悬液成为该技术应用的关键前提。对于结构复杂的组织器官（如肝脏、肾脏、肺脏），Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）常与其他酶，如胶原酶（Collagenase II，AbMole，M9973）、透明质酸酶（Hyaluronidase，AbMole，M9941）联合使用，构建高效的组织解离方案。以肌肉和骨骼组织为例，Neutral Protease II可联合Collagenase I（胶原酶 I ） 、Collagenase II（胶原酶II） 、Pronase 等酶从上述组织中分离出包括间充质干细胞、骨谱系细胞、软骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞在内的单细胞混合群，这为单细胞测序技术提供了基础[5]。
图 2. 来自不同肌肉骨骼组织的单细胞分离方案示意图[5]
4. Neutral Protease II用于三维细胞培养与类器官构建
类器官培养技术能够模拟体内细胞的生长微环境，更真实地反映细胞的生物学行为。在类器官（包括肿瘤类器官、胚胎干细胞或诱导多能干细胞衍生的类器官）培养中，细胞一般接种于基质胶等三维支架中。如何从基质胶有效回收类器官细胞且不影响细胞的生物学参数，是类器官培养中的关键问题。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可用于类器官中的基质胶降解和类器官的消化传代。
图 3. Dispase与其它基质胶降解方法的比较[6]
参考文献及鸣谢
[1] John Stingl, Joanne T. Emerman, Connie J. Eaves, Enzymatic Dissociation and Culture of Normal Human Mammary Tissue to Detect Progenitor Activity, in: C.D. Helgason, C.L. Miller (Eds.), Basic Cell Culture Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 2005, pp. 249-263.
[2] Rana Mroue, Mina J. Bissell, Three-Dimensional Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells, in: S.H. Randell, M.L. Fulcher (Eds.), Epithelial Cell Culture Protocols: Second Edition, Humana Press, Totowa, NJ, 2013, pp. 221-250.
[3] J. Y. Kim, J. H. Lee, W. Sun, Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone, Journal of visualized experiments : JoVE (118) (2016).
[4] J. J. Cassiman, M. Brugmans, H. Van den Berghe, Growth and surface properties of dispase dissociated human fibroblasts, Cell Biology International Reports 5(2) (1981) 125-132.
[5] Manman Gao, Peng Guo, Xizhe Liu, et al., Systematic study of single-cell isolation from musculoskeletal tissues for single-sell sequencing, BMC Molecular and Cell Biology 23(1) (2022) 32.
[6] M. Wang, H. Yu, T. Zhang, et al., In-Depth Comparison of Matrigel Dissolving Methods on Proteomic Profiling of Organoids, Molecular & cellular proteomics : MCP 21(1) (2022) 100181.
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