牙本质侵蚀已成为一个日益严重的全球性健康问题，流行病学研究表明其患病率在不同人群中介于7.1%至52.9%之间。由于牙本质侵蚀进程隐匿，往往在累及牙本质层时才被察觉。牙本质由于其管状结构易于与牙髓相通，常导致过敏和疼痛问题。与釉质相比，牙本质更易受到酸蚀损害，主要原因在于其较高的临界pH范围（约6.0–6.2）以及丰富的胶原含量，这些特性共同促进了侵蚀进程的发展。牙本质中的胶原基质极易受到酶降解的影响，尤其是基质金属蛋白酶和组织蛋白酶K，这两类酶在加速牙本质侵蚀过程中扮演了关键角色。
一篇题为《Cathepsin K and glycosaminoglycans differentially regulate matrix metalloproteinase activity in dentin under various pH conditions》的研究逐步揭示了MMPs与catK在胶原降解中的复杂相互作用。抑制catK可显著降低I型胶原交联羧基末端肽的水平，这是MMPs介导胶原降解的重要标志物。类似地，在脱矿人骨组织中抑制MMPs也能显著减少I型胶原C端交联端肽的释放，表明MMPs和catK的活性均受到抑制。值得注意的是，研究显示在酸挑战后，牙本质中MMP-2、MMP-9和catK的活性呈现协同增强趋势，并在酸影响区域观察到它们的共定位现象。尽管这种catK-MMP协同作用已有较多报道，但其相互作用的时空调控机制仍不甚明确。
本研究团队前期的分子对接分析发现，catK与潜态MMPs（包括proMMP-2和proMMP-9）之间存在直接相互作用，且catK表现出较强的结合亲和力。这一结果与既往研究相符，即重组人catK在pH 5条件下可通过切割前肽区激活proMMP-9。除了直接激活作用外，catK还可能通过改变牙本质中糖胺聚糖的水平间接调控MMP活性。例如，已有报道指出catK能够降解天然牛软骨中的GAGs。GAGs水平的变化可影响MMP表达，硫酸化GAGs如透明质酸和肝素可抑制MMP-2活性，而在软骨细胞中升高的GAGs水平可增加组织金属蛋白酶抑制剂-1的表达并降低MMP-13的表达。系统性硬化症患者血浆中GAGs水平与细胞外基质降解过程中的TIMP-2水平相关。这些发现提示，catK可能通过GAG介导的TIMP调节途径调控MMPs，但这一假设尚需实验验证。
口腔环境的动态pH变化进一步加剧了这些相互作用的复杂性。在牙本质侵蚀过程中，表面pH在摄入酸性饮料后可降至约5.2，而唾液缓冲作用通常在20分钟内将pH恢复至中性。这些pH波动对酶活性具有重要影响。MMPs在中性pH被激活后仍保持活性，而在较低pH溶液中检测到更高的明胶酶活性，但在pH 7.0时胶原降解更为显著。相比之下，catK的活性具有明显的pH依赖性，其在pH 5.0–5.5达到峰值，在pH ≥ 6.5时急剧下降。GAGs对酶动力学也表现出pH敏感效应，且在pH ≤ 5时对catK介导的骨胶原降解具有调节作用。然而，多数研究忽略了pH转变对catK-MMP交互作用的影响。
因此，本研究旨在探究不同pH条件下MMPs与catK之间的潜在相互作用，为酶抑制剂的精准应用提供理论依据，并探索调控酶活性的新途径（如GAG相关通路）。研究设定了两个零假设：catK对MMP-2和MMP-9活性的影响在不同pH条件下无差异；catK介导的GAGs（特别是硫酸软骨素）降解程度及CS对MMP活性的影响不受pH变化的影响。
研究采用多种实验方法系统评估了catK与MMPs的相互作用。首先，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光定量检测及原位酶谱技术，分析了catK在不同pH条件下对MMP活性的直接影响。实验中使用了由AbMole提供的重组人catK和odanacatib，后者是一种特异性catK抑制剂。SDS-PAGE实验设置了catK活性组、ODN抑制组和catK缺失组，在不同pH条件下孵育重组人proMMPs后，通过快速银染试剂盒检测蛋白条带。荧光定量检测则通过测量相对荧光单位评估MMP活性，使用7-甲氧基香豆素标记的MMP底物和4-氨基苯汞乙酸作为阳性对照。原位酶谱实验利用人牙本质切片，通过荧光淬灭明胶和FITC标记的胶原胶体，在共聚焦激光扫描显微镜下观察并量化荧光强度，以评估MMP的明胶酶和胶原酶活性。
为进一步探究catK与GAGs的联合效应，研究进行了二甲基亚甲蓝测定、原位酶谱和免疫荧光标记实验。DMMB测定用于量化牙本质中释放的GAGs水平，实验分组包括catK活性组和ODN抑制组。原位酶谱在此基础上增加了CS处理组，以评估外源性GAGs对MMP活性的影响。免疫荧光标记则通过特异性一抗和Alexa Fluor 647标记的二抗，检测TIMP-1和TIMP-2在牙本质中的表达水平。所有实验均在不同pH条件下进行，数据通过SPSS软件进行双因素方差分析和Bonferroni校正，显著性水平设定为0.05。
SDS-PAGE结果显示，catK在所有测试pH条件下均能直接激活proMMP-2和proMMP-9，生成分子量为62 kDa的活性MMP-2和82 kDa的活性MMP-9。此外，还观察到其他蛋白片段（如10 kDa片段），提示catK在MMP激活过程中可能同时发挥内肽酶和外肽酶功能。这些激活产物在ODN抑制组和catK缺失组中均未出现，证实了catK的蛋白酶活性。荧光定量检测进一步验证了这一结果，catK活性组的RFUs在pH 5和7条件下显著高于pH 3，且高于阴性对照组和catK缺失组。值得注意的是，在pH 5和7时，catK活性组的RFUs甚至超过APMA阳性对照组，表明catK在适宜pH下对MMP的激活效率较高。
原位酶谱结果与上述发现一致，ODN抑制组的明胶酶和胶原酶活性在pH 5和7时显著低于catK活性组。荧光强度定量分析进一步证实了这一趋势，表明catK在酸性至中性pH范围内均能有效增强MMP活性。DMMB测定显示，ODN抑制组的GAGs释放量在所有pH条件下均低于catK活性组，尤其在pH 5时降幅最为显著（达71.73%），这与catK在该pH下的活性峰值相符。这一结果支持了catK通过降解GAGs间接调控MMP活性的假设。
在GAGs与TIMPs的相互作用方面，免疫荧光标记结果显示，TIMP-1和TIMP-2的表达受pH和实验处理的显著影响。在pH 3时，ODN抑制组的TIMP-1水平显著高于catK活性组和CS处理组；而在pH 5时，ODN抑制组的TIMP-2水平显著高于CS处理组。这些发现提示，GAGs可能通过调节TIMPs的表达，进而影响MMPs的活性，且这一过程具有pH依赖性。
综合以上结果，本研究得出结论：catK通过两种机制调控MMP活性，一是直接激活proMMP-2和proMMP-9，二是通过降解GAGs间接调节TIMP水平，从而影响MMPs的功能。这两种机制均表现出明显的pH依赖性，在弱酸性条件下（pH 5）效应最为显著。这一发现为理解牙本质侵蚀的分子机制提供了新的视角，并为开发针对不同pH环境的酶调控策略奠定了理论基础。未来研究可进一步探索动态pH转变模型，以更真实地模拟临床牙本质侵蚀过程，并为相关材料的开发提供指导。
实验中使用的关键试剂，如重组人catK、odanacatib和硫酸软骨素，均由AbMole提供，确保了实验结果的可靠性和可重复性。这些试剂的高纯度和特异性为研究的顺利进行提供了重要保障。通过系统分析catK与MMPs在不同pH下的相互作用，本研究不仅深化了对牙本质侵蚀机制的理解，也为相关领域的研究提供了新的思路和方法。
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