代谢学人

Cell Metabolism：肥胖的“谷”惑：抗氧化卫士变癌症帮凶

撰文 | 闪光余 刘梓棋 李姿萱 周文豪 邱瑾

编辑 | 孟美瑶

校对 | 李姿萱

背景介绍

肥胖是癌症的主要风险因素之一，在女性肥胖相关癌症中，乳腺癌是死亡的主要原因。与正常体重的女性相比，体重指数（BMI）较高的肥胖女性乳腺癌发病风险和死亡风险的概率更高。有研究表明，肥胖会引起全身代谢改变和以脂肪为主的乳腺肿瘤微环境（TME）的局部改变，从而促进癌症进展。乳腺脂肪细胞、免疫细胞和乳腺癌细胞之间的相互作用在肥胖条件下会加速肿瘤进展。然而，肥胖与乳腺癌预后不良之间的确切分子机制尚不清楚。

癌细胞的行为受到双重调控：既受自身内在因子影响，也受到肿瘤微环境（TME）中可利用的代谢物的调节。值得注意的是，癌细胞与非癌细胞的相互作用塑造了肿瘤微环境特有的代谢生态位。谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽，是细胞内含量最丰富的代谢物，其浓度在肿瘤细胞及TME中的异常升高更与肿瘤发生、发展及耐药性显著相关。其作用机制涉及：与活性氧（ROS）反应，转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），GSH/GSSG比值是反映细胞氧化应激状态的重要指标。值得注意的是，GSH不仅是构成抗氧化防御体系的核心，还在不同细胞器中发挥特异性代谢调控功能。 现有研究揭示，高GSH水平人群往往伴随肥胖表型（小编注：高GSH水平人群是从临床数据出发的，引用的文献中并未讲明具体机制，在正常细胞中GSH抗氧化可以对细胞起到保护作用，但在肿瘤细胞中，由于肿瘤细胞代谢旺盛，氧化还原反应活性极高，需要强大的抗氧化系统来对抗ROS，所以在肿瘤细胞中GSH高会促进癌症的发展，而ROS高会促进肿瘤细胞凋亡。参考文献：1、Goutzourelas N, Orfanou M, Charizanis I, Leon G, Spandidos DA, Kouretas D. GSH levels affect weight loss in individuals with metabolic syndrome and obesity following dietary therapy. Exp Ther Med. 2018. 2、Kennedy L, Sandhu JK, Harper ME, Cuperlovic-Culf M. Role of Glutathione in Cancer: From Mechanisms to Therapies. Biomolecules. 2020;10(10):1429. Published 2020. 3. Bansal A, Simon MC. Glutathione metabolism in cancer progression and treatment resistance. J Cell Biol. 2018.），但GSH-肥胖-癌症进展的三元关系仍存在机制空白。在代谢调控领域，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路作为经典代谢感知系统，其复合体mTORC1的氨基酸激活涉及两条独立路径：通过Rag GTP酶和ADP-核糖基化因子1（ARF1）介导的两种机制，最终引发v-ATP酶依赖的溶酶体定位变化。最新证据表明，GSH可能通过清除T细胞内ROS来间接维持mTOR活性，但GSH是否直接激活mTOR通路仍待验证。这提示我们亟需深入探究：在肥胖相关乳腺癌中，GSH如何通过mTOR信号网络介导代谢重编程，从而推动肿瘤恶性进展。

溶酶体整合膜蛋白2型（Lysosomal integral membrane protein type 2，LIMP 2），又称清道夫受体B类成员2（scavenger receptor class B，member 2，SCARB2），是一种重要的生物学功能蛋白，其生物学功能与其配体的相互作用密切相关。SCARB2的管腔结构域（LD）含有一个空腔，可促进外源性胆固醇与溶酶体膜以及脂滴的结合和运输。最近有研究表明，肝细胞中SCARB2的缺失可通过抑制癌细胞的自我更新能力来减缓肝细胞癌（HCC）的发生和进展。然而，SCARB2在乳腺癌中的具体作用及潜在机制尚需进一步研究。

近期一篇发表在Cell Metabolism的题为“Adipocyte-derived glutathione promotes obesity related breast cancer by regulating the SCARB2-ARF1-mTORC1 complex”文章发现GSH可以作为mTOR信号通路的激活剂将肥胖和乳腺癌联系起来。本文通过对正常饮食（NCD）组和高脂饮食（HFD）组小鼠TME代谢产物的检测，以及一系列体外和体内实验，确定了GSH具有促进肿瘤作用。研究人员通过多组学和生化分析发现GSH与SCARB2结合，可以激活mTORC1信号传导，GSH可以通过干扰SCARB2的N端-C端相互作用，促进ARF1与哺乳动物致死蛋白sec-13蛋白8（mLST8）相互作用，募集mTORC1定位到溶酶体上。总之，这些发现提供了对一个连接谷胱甘肽分泌与脂肪细胞和乳腺癌细胞之间通讯的新角度，同时为肥胖女性乳腺癌患者的治疗提供了相应的思路。

mTOC1被氨基酸激活的两种机制

（1）氨基酸可以诱导mTORC1运动到含有Rag蛋白的溶酶体膜，而包括MAPKSP1、ROBLD3和c11orf59基因编码的Ragulator复合物，可以与Rag GTP酶相互作用，并促进mTORC1的活化（见图SS1）。

（2）亮氨酸和谷氨酰胺可以刺激mTORC1移动到溶酶体，这个过程可以由Rag GTP酶介导，也可以不依赖于Rag GTP酶。在RagA和RagB敲除的细胞中，谷氨酰胺可以借助ARF1促进mTORC1易位到溶酶体，并且这个过程需要v-ATPase（见图SS2）。

图SS1

图SS2

参考文献：

[1] Jewell JL, Kim YC, Russell RC, et al. Metabolism. Differential regulation of mTORC1 by leucine and glutamine. Science. 2015. 

[2] Sancak Y, Bar-Peled L, Zoncu R, Markhard AL, Nada S, Sabatini DM. Ragulator-Rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 2010.

1. 肥胖上调肿瘤微环境中脂肪细胞的GSH分泌

2. 外源性GSH定位于溶酶体并促进肿瘤发展

3. GSH直接与SCARB2结合，导致ARF1依赖的mTOR激活

4. GSH/mTORC1轴可能是肥胖乳腺癌治疗的靶点。

研究结果

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研究人员采用BALB/c小鼠建立饮食诱导肥胖（DIO）模型，用来探究肥胖加速乳腺癌的机制。将小鼠进行9周NCD（正常饮食）或HFD（高脂饮食）喂养，然后向乳腺脂肪垫注射4T1细胞（图1A），经过12周观察发现，HFD组小鼠较NCD组表现出更显著的体重增长（图1B），同时伴随血液胆固醇、甘油三酯、胰岛素及血糖水平升高（图S1A-D）。肿瘤表型分析显示，HFD组小鼠的乳腺肿瘤体积和重量均显著大于对照组（图1C-D），肺转移结节数量也明显增加（图1E，S1E）。

为验证模型的普适性，研究人员进一步选用MMTV-PyMT转基因小鼠，该品系会自发形成乳腺肿瘤并产生肺转移（图1F）。实验结果显示，HFD喂养同样加速了MMTV-PyMT小鼠的肿瘤进展，表现为肿瘤体积增大（图1G）、肺转移数量增加（图1H）、肿瘤生长速度增加（图1I）以及寿命降低（图1J）。这些数据共同证明饮食诱导的肥胖能显著促进乳腺癌进展。

肿瘤微环境（TME）中代谢物的异常积累是癌症的重要特征。为探究肥胖促进乳腺癌进展的关键代谢物，研究人员首先对HFD与NCD喂养小鼠的肿瘤间质液（TIF）进行非靶向代谢组学分析（图1K/S1F）（小编注：通过使用细针直接穿刺进入肿瘤组织，然后缓慢抽取间质液）。在筛选出的前十种代谢物中，谷胱甘肽（GSH）对三种乳腺癌细胞系的侵袭和增殖均显示出最强促进作用（图1L-M/S1G-M）。已知GSH的生物合成遵循经典代谢通路：半胱氨酸（Cys）在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）和修饰亚基（GCLM）作用下与谷氨酸结合生成γ-谷氨酰半胱氨酸，随后在GSH合成酶（GS）催化下与甘氨酸结合形成GSH（图1N）。研究人员证实，使用GSH合成抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine, BSO，图1O）处理HFD小鼠后，其乳腺肿瘤体积、重量及肺转移程度均显著降低（图1P-R/S1N）。为明确GSH的来源，研究团队通过敲除4T1细胞中的Gclc基因来抑制肿瘤细胞自身GSH合成（图S1O-P），并将改造后的细胞移植至HFD喂养9周的BALB/c小鼠（图1S）。值得注意的是，即便在肿瘤细胞GSH合成受阻的情况下，HFD饮食仍能加速肿瘤进展（图1T-V），提示脂肪组织或基质细胞等非癌细胞产生的外源性GSH可能在肥胖相关乳腺癌中发挥关键作用。

图1 GSH抑制阻止HFD加速乳腺癌进展的过程

图S1 TIF产生的代谢物促进了乳腺癌的发展

2

上文提到，非癌细胞中GSH的产生可能是导致HFD喂养小鼠乳腺癌进展加快的原因。HFD喂养的小鼠肿瘤组织的多重免疫组化（mIHC）染色显示，肿瘤组织的脂肪细胞（perilipin-1阳性）中GSH呈现显著聚集，而肿瘤细胞（CK19阳性）和内皮细胞（CD31阳性）的GSH表达水平较低。成纤维细胞（α-SMA阳性）和免疫细胞（CD45阳性）中的GSH水平最低（图2A-2B）（小编注：图2B 的IntDen指标指的是 Integrated Density，即积分密度。是通过图像分析软件（如ImageJ）计算得到的一个参数，可用于衡量图像中目标区域的密度和强度信息，在这里，作者用IntDen来表示GSH的荧光强度）。来自肥胖乳腺癌患者的脂肪细胞表现出更高水平的GCLC（图2C-2D），提示脂肪细胞的GSH合成能力增强。同时，肥胖患者的脂肪细胞和肿瘤细胞均显示更高GSH水平（图2E-2F）。与NCD或HFD组小鼠脂肪细胞和肿瘤细胞相比，HFD组脂肪细胞的GSH含量最高（图2G）。HFD小鼠的肿瘤间质液（TIF）GSH浓度也显著高于血液和NCD组TIF（图2H）。

研究人员进一步检测了肥胖与非肥胖动物模型中GCLC及胱氨酸/谷氨酸交换转运蛋白（SLC7A11、SLC3A2）的表达。肥胖小鼠肿瘤相关脂肪细胞的GCLCmRNA和蛋白水平显著升高（图S2A,S2D）。Slc7a11 mRNA在肥胖小鼠脂肪组织和肿瘤中均下调（图S2B），而Slc3a2 mRNA在肿瘤组织中升高（图S2C）；但SLC7A11和SLC3A2蛋白水平在两组间无差异（图S2D-E）。上述数据表明脂肪组织GSH合成增加可能会促进乳腺癌进展。

为了进一步研究脂肪细胞分泌的GSH的作用，研究人员使用单向导RNA（sgRNA）敲除前脂肪细胞（3T3-L1）中GCLC的内源性表达（图S2F和S2G）。共培养实验（图2I）显示脂肪细胞中GCLC的缺乏抑制了乳腺癌细胞的侵袭和生长。然而，这种作用会被GSH的加入而逆转（图2 J和2K）。同时在EMT 6细胞系中观察到相似的结果（图S2和S2I）。为了研究内源性GSH合成在脂肪细胞中的作用，研究人员构建了一种靶向脂肪细胞选择性缺失Gclc的小鼠模型（条件性Gclc-KO小鼠，AdipoQ-cre;Gclcfl/fl）（图S2J）。雌性AdipoQ-cre;Gclcfl/fl小鼠以及同窝对照Gclcfl/fl小鼠喂食NCD或HFD 9周，然后移植E0771乳腺癌细胞（图2L），结果显示脂肪细胞中Gclc的丧失导致乳腺癌进展较慢（图2M、2N和S2K）。此外，脂肪细胞中Gclc的缺失（图S2L）确实导致脂肪细胞和肿瘤细胞中GSH水平的降低（图S2 M）。

为了研究外源性GSH在促进乳腺癌进展中的作用，研究人员进行了流式细胞术发现外源性的GSH会迅速被肿瘤细胞摄取（图2O）。此外，敲除EMT 6细胞中GSH的经典转运蛋白（Slc22a6、Slc22a8和Slc13a3）（图S2N-S2P）后，由外源性GSH引起的肿瘤促进作用显著降低（图S2Q-S2T），这表明SLC22A6、SLC22A8和SLC13A3对GSH摄取至关重要，影响乳腺癌细胞的生长和侵袭。亚细胞定位分析表明，外源GSH主要定位于4T1细胞的溶酶体（图2P,S2U），而非线粒体（图2Q,S2V）、核糖体（图2R,S2W）、内质网（图2S,S2X）或高尔基体（图2T,S2Y），提示GSH通过溶酶体途径发挥促瘤作用（图2U）。

图2 脂肪细胞源性GSH依赖溶酶体促进肿瘤细胞增殖和侵袭

图S2 脂肪细胞衍生的谷胱甘肽进入肿瘤细胞的溶酶体

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线粒体电子传递链产生的活性氧（ROS）可被内源性抗氧化剂（特别是谷胱甘肽GSH）平衡。研究人员假设癌细胞自身合成的基础GSH可作为氧化还原稳态调节剂，保护肿瘤细胞免受氧化损伤，而外源性GSH的大量摄取可能通过提高细胞内GSH水平影响溶酶体功能。为验证这一假设，研究人员通过酶联免疫吸附试验发现：外源补充GSH会显著增加Gclc缺失细胞和对照组细胞的总GSH含量，但Gclc缺失细胞会消耗大部分外源GSH（图S3A）。值得注意的是，尽管总氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量在GSH处理的未缺失Gclc细胞中无变化，但在Gclc缺失细胞中显著升高（图S3B）。进一步检测MMTV-Pymt类器官的Ctrl-Cas9和Gclc-Cas9乳腺癌细胞发现：在模拟肿瘤微环境（TME）的条件下，外源GSH同样无法有效调节癌细胞的氧化还原稳态（图S3C-E）。通过13C15N标记的GSH代谢通量分析显示，标记的GSH在Gclc-Cas9细胞中主要转化为GSSG，而在Ctrl-Cas9细胞中未发生类似转化（图S3F）。这些数据表明，外源性GSH可能并非乳腺癌细胞氧化还原稳态的主要调节剂。

为探究外源性GSH通过溶酶体促癌的具体机制，研究人员采用基于质谱（MS）的蛋白质组学分析鉴定潜在的GSH结合蛋白。结果显示，前10种候选蛋白包括肌球蛋白重链9（MYH9）、溶酶体膜蛋白SCARB2、肌动蛋白β（ACTB）、肌球蛋白重链10（MYH10）、心肌α-肌动蛋白1（ACTC1）、DEAD解旋酶46（DDX46）、细丝蛋白A（FLNA）、果胶（PLEC）、AHNAK及丝氨酸/精氨酸重复基质2（SRRM2）。其中SCARB2在溶酶体中的丰度最高（图3A）。通过共免疫沉淀（CoIP）和表面等离子体共振（SPR）分析，研究人员证实GSH与SCARB2存在直接相互作用，且两者结合亲和力显著（图3B-C）。共聚焦显微镜观察显示，GSH（绿光）可在5分钟内快速与乳腺癌细胞中的SCARB2（红光）共定位（图3D）。

为明确SCARB2在GSH促癌中的作用，研究人员使用CRISPR-Cas9构建Scarb2缺失的乳腺癌细胞。体外实验发现，Scarb2缺失可降低癌细胞的侵袭与增殖能力，且外源GSH无法促进Scarb2缺失细胞的恶性表型（图3E-F,S3G-H）。小鼠模型显示，GSH注射可加速乳腺癌生长和肺转移，但这一效果在Scarb2缺失的肿瘤细胞中被显著抑制（图3G-J）。人源肿瘤类器官实验进一步证实，GSH处理可诱导侵袭性分支增加，而SCARB2缺失组对GSH刺激的响应明显减弱（图S3I-J）。此外，Scarb2缺失还可抑制HFD喂养小鼠的肿瘤体积、重量及肺转移（图3K-N,S3K）。综上，GSH通过与肿瘤细胞溶酶体中的SCARB2结合驱动乳腺癌进展，且SCARB2是GSH诱导及肥胖相关乳腺癌加速的关键分子。

PDO侵袭度评估

（1）人源肿瘤PDO在两种情况下可以长出侵袭性分支：

①在模拟肿瘤微环境（TME）时，如：将肿瘤组织经过物理或酶解分离后，在细胞外基质中与类器官一起培养；并且添加从自体外周血或肿瘤组织中分离的外源性免疫细胞。

②基质胶：三维培养体系中使用基质胶可维持类器官的侵袭性结构。

（2）角蛋白14（K14）是低分化肿瘤和肿瘤侵袭的标记物。有其他癌症的研究显示，细胞间连接决定了不同的侵袭表型模式，分别称为集体侵袭和单细胞侵袭，HPV 阴性头颈部鳞状细胞癌的侵袭模式有单细胞/脊髓样（T1）、集体多细胞链（T4）、单细胞（T5）或集体链/脊髓样/单细胞（T8）侵袭，如图SS3所示。并且该研究通过数据库分析得出，单细胞侵袭模型包含变形虫样迁移的特征，而集体侵袭模型具有细胞迁移的正调节、细胞间粘附和细胞间基质粘附等过程，与单细胞侵袭相比，集体侵袭模型中与运动和粘附相关的基因转录显著增加。

（3）但从图S3I的免疫荧光染色图来看，图S3I的拍摄倍数太小，文中也没有给出能够用来计数的侵袭性分支的微观图片，所以推测这里文中的侵袭性分支增加指的是随着PDO的长大，组成PDO的细胞数变多，推测这里侵袭性分支的统计应该是对有具有k14角蛋白荧光的细胞数进行了统计。

参考文献：

[1] Haughton PD, Haakma W, Chalkiadakis T, et al. Differential transcriptional invasion signatures from patient derived organoid models define a functional prognostic tool for head and neck cancer. Oncogene. 2024

图3 GSH通过与SCARB2结合促进肿瘤细胞的进展

图S3 SCARB2对于GSH诱导的肿瘤进展是必需的

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为了探究SCARB2如何支持GSH依赖性的肿瘤进展，研究人员详细分析了SCARB2的结构和功能。SCARB2是一种III型双跨膜蛋白，由478个氨基酸组成，包括N-末端、C-末端和管腔结构域（LD）（图4A，左）。通过AlphaFold预测，研究人员获得了SCARB2的3D结构（图4A，左）。利用PyMOL分析，研究人员发现SCARB2 N端的Ser 20和Ser 13与其C端的Pro 439和Gly 446形成氢键，氢键的距离分别为2.6和2.7埃（图4A，中间）。此外，2D疏水相互作用分析显示，N端结构域中的特定残基（Leu 16、Leu 17、Leu 24和Phe 29）与C端结构域中的残基（Gly 450、Ile 438、Ile 435、Met 443和Tyr 440）存在相互作用（图4A，右）。

为验证SCARB2N端和C端之间的相互作用，研究人员进行了共免疫沉淀（CoIP）和邻近连接测定（PLA），SCARB2的N末端具有HA标签，C末端具有MYC标签，结果显示SCARB2 N端和C端可以相互作用，并且外源GSH的补充减弱了它们在转染的HEK-293T细胞中的相互作用（图4B和S4A）。有趣的是，即使在GSH存在的条件下，SCARB2的LD也不能形成同源二聚体（图S4B），这进一步证明了介导N端与C端发生相互作用的是N端与C端的氨基酸残基。同时，PLA证实了SCARB2-N和SCARB2-C在Scarb2-Cas9-4T1乳腺癌细胞中的共定位（图4C）。此外，研究人员发现外源性GSH还诱导了SCARB2的构象变化（图4D）。

为进一步确定SCARB2与GSH结合的具体区域，研究人员构建了5个SCARB2 C末端片段，并发现C2片段对于GSH-SCARB2结合是必需的（图4F）。丙氨酸扫描鉴定了进化上保守的残基A444作为GSH-SCARB2结合的关键残基（小编注：丙氨酸扫描是研究蛋白质功能的重要方法，原理是将目标蛋白质中某个残基突变为丙氨酸来观测蛋白质结构的变化，在上文中，研究人员通过构建了5个SCARB2 C末端片段，发现C2片段对于GSH-SCARB2结合是必需的，C2片段的范围在442-452之间，N端或C端其他位点未显著影响GSH结合，因此锁定443-451区段进行扫描）（图4G、S4C和S4D），并且该残基导致了乳腺癌细胞的增殖和侵袭加速（图4H和4I）。研究人员进一步预测了SCARB2的3D结构，其中A444位置由AlphaFold突出显示（图S4E）。AutoDock Vina的预测表明GSH和A444之间存在氢键（图S4F）。这些数据表明，外源性GSH通过其在SCARB2的A444残基上的特异性结合位点促进乳腺癌的进展。

为了进一步研究GSH-SCARB2相互作用在乳腺癌进展中的作用，研究人员对GSH处理的Ctrl-Cas9（SCARB2 WT）和SCARB2-Cas9（SCARB2 KO）4T1细胞进行了RNA-seq分析。基因集富集分析（GSEA）表明，GSH的处理增强了mTORC1下游信号通路，该通路可被SCARB2敲除阻断（图5A和5B）。mTORC1通路的活性通常通过其底物的磷酸化水平进行评估，如核糖体S6激酶1（S6K1）和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）。事实上，GSH可以以时间依赖性方式导致mTORC1激活（图5C）。然而，SCARB2缺陷几乎阻断了GSH处理诱导的mTORC1活化，该效应可通过在SCARB2缺失细胞中过表达外源性野生型SCARB2（而不是A444突变）逆转（图5D、S5A和S5B）。mTORC1募集至溶酶体表面是其活化过程的关键步骤。氨基酸缺失后，GSH诱导4T1细胞中mTOR的溶酶体定位（小编注：氨基酸剥夺时机体会产生氧化应激，此时合成GSH的底物：半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量减少，而补充GSH后可以缓解氨基酸剥夺引起的氧化应激，从而活化mTOR并定位于溶酶体；也进一步凸显GSH对mTOR的活化作用），但在SCARB2缺陷细胞中被阻断（图5E和5 F）。研究人员接下来使用mTOR抑制剂雷帕霉素来测试mTORC1信号传导对GSH促肿瘤作用的贡献，结果发现，抑制mTORC1之后消除了GSH在乳腺癌细胞中的促肿瘤功能（图5G、5H、S5C和S5D）。并且在雷帕霉素存在的情况下，GSH未能激活mTORC1，表明GSH通过激活mTORC 1信号通路促进肿瘤进展（图5I和S5E）。乳腺癌细胞中的mTORC缺失（图S5F和S5G）降低了肥胖小鼠中的肿瘤体积、重量和肺结节，而与HFD喂养或GSH处理无关（图5J-5Q）。这些数据表明，mTOR的激活对于肥胖诱导和GSH加速的乳腺癌进展至关重要。

有研究报道，GSH可直接缓冲过量的ROS，激活mTOR和NFAT（活化T细胞核因子），从而调节T细胞中myc依赖性代谢重编程。有趣的是，本研究发现，在用N-乙酰半胱氨酸（NAC）中和ROS后，GSH仍然保留了其激活mTOR的能力（图S5 H和S5 I），进一步促进了肿瘤细胞的增殖和侵袭（图S5 J-S5 N），并增加了肿瘤类器官中多细胞链的延伸（图S5O）。这些数据表明，ROS缓冲对于GSH介导的mTORC1信号转导的激活可能是不必要的。

为了进一步了解氨基酸对mTOR的溶酶体定位和激活的依赖关系，研究人员研究了调控mTOR溶酶体定位的两条关键通路Rag和ARF1 GTP酶途径的作用。通过实验发现，RagA/B缺失可以消除293T细胞和4T1细胞中缬氨酸刺激的mTORC1激活（图S5P和S5R）。然而，Rag GTP酶的功能障碍对GSH刺激的mTOR信号通路的激活没有影响（图S5Q和S5S）（小编注：这里的Rag GTP酶指的是RagA/B GTP酶；相当于排除了这个途径，因此作者在下一节的内容中直接围绕ARF1为GSH促进mTOR溶酶体定位的关键因子，并进行实验验证）。这些数据表明，GSH通过非Rag GTP酶依赖性机制激活mTOR信号通路。

图4 GSH与SCARB2的A444结合，从而诱导SCARB2的构象变化

图S4 外源GSH通过结合SCARB2的A444位点抑制SCARB2的N端和C端相互作用

图5 GSH通过增强SCARB2/ARF1之间的相互作用激活mTORC1信号传导

图S5 GSH不通过Rag GTPase途径激活mTORC1信号

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为了进一步探究GSH如何通过ARF1和SCARB2激活mTOR信号通路，研究人员进行了以下实验。首先，研究人员添加了GSH，发现GSH的添加增强了4T1乳腺癌细胞中ARF1和SCARB2之间的相互作用（图6A），并且在ARF1和SCARB2的GSH S-转移酶（GST）下拉测定中也观察到了类似的结果（图S6A）。进一步分析发现，SCARB2的N末端对于这种相互作用是必需的（图6B）。当加入SCARB2的C末端时，无论是否有GSH刺激，ARF1和SCARB2-C之间的相互作用都减弱了（图S6 B）。然而，SCARB2和ARF1之间的相互作用不受NAC的影响（图S6C）。此外，GSH还增加了mTOR、ARF1和LAMP2的共定位（图6C）。使用布雷菲德菌素A（BFA）（一种ARF1鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）抑制剂）抑制ARF1或使用sgRNA缺失Arf1（图S6D）后，GSH在激活mTOR中的功能被阻断（图6D和6E），表明ARF1可能是GSH介导的mTOR激活的关键组分。组成型失活的ARF1（Arf1-GDP）的再表达未能逆转该现象，而组成型活性的ARF1（Arf1-GTP）的再表达恢复了mTOR活性（图6E）。为了进一步研究ARF1在GSH促进的乳腺癌进展中的作用，研究人员检测了其对EMT6细胞增殖和侵袭能力的影响。Arf1的缺失不仅抑制了增殖，而且降低了用GSH处理的EMT 6细胞的侵袭潜力（图6F和6G）。此外，GSH诱导mTOR在4T1细胞中的溶酶体定位，这种作用在Arf1缺陷细胞中被消除（图S6E）。

为了进一步探索ARF1对体内乳腺癌进展的影响，研究人员将Arf1缺失和未缺失的EMT 6细胞移植到肥胖小鼠中（图6H），结果发现，Arf1的缺失减少了HFD喂养小鼠的肿瘤体积和重量以及肺转移（图6I、6J和S6F）。然而，Arf1的缺失消除了GSH的促肿瘤作用（图6K、6L、6M和S6G）。这些数据表明，ARF1是GSH介导的促进乳腺癌进展所必需的。

为了探究GSH通过ARF1和SCARB2激活mTOR通路的机制，研究人员鉴定了mTORC1的潜在ARF1相互作用亚基，并观察到ARF1和mLST8亚基之间的相互作用，但未观察到mTOR或Raptor（mTOR调节相关蛋白）之间的相互作用（图6N、S6H和S6I）。mLST8是mTORC1和mTORC2的共同亚基，通过mTORC1信号通路促进肿瘤进展。缺乏mLST8会抑制mTORC1的活化。为了证实mLST8亚基在GSH促进的乳腺癌进展中的关键功能，研究人员采用siRNA敲低EMT6细胞中的Mlst8表达（图S6J）。Mlst8的缺失抑制了EMT6细胞的侵袭和生长，并且外源GSH未能促进Mlst8缺失的细胞中的乳腺癌进展（图6O、6P、S6K和S6L）。这些数据表明，mTORC1需要mLST8与ARF1相互作用，从而促进GSH诱导的乳腺癌进展（图6Q）。

图6 Arf1的缺失阻碍了HFD和GSH的促肿瘤作用

图S6 Arf1的缺失阻断了GSH的抗肿瘤作用

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为了探究患有激素受体阳性乳腺癌的肥胖女性对他莫昔芬（TAM）治疗反应较差的原因，研究人员进行了以下实验。首先，研究人员发现TAM在高脂饮食（HFD）喂养的小鼠中治疗乳腺癌的效果有限，但在正常饮食（NCD）喂养的小鼠中效果良好（图7A-7C和S7A）。此外，TAM能够抑制非肥胖小鼠乳腺肿瘤中S6K1和4E-BP1的活化，但不能抑制肥胖小鼠肿瘤中这些分子的活化（图7D）。这些数据表明，mTOR的激活可能导致TAM治疗反应不良。进一步的研究发现，脂肪细胞中Gclc的缺失阻碍了雌性HFD BALB/c小鼠乳腺癌的进展，并进一步增强了TAM的功效（图7E-7G）。在Adipoqcre;Gclcfl/fl小鼠中，TAM处理的肿瘤中S6K1和4E-BP1信号传导途径的活性进一步受到抑制（图7H）。这些数据表明，降低GSH含量结合TAM可能是肥胖女性乳腺癌更有效的治疗策略。

为了验证这些发现，研究人员还在临床样本中进行了相应实验。他们检查了不同BMI值的乳腺癌患者样本中相关蛋白的定位。在超重和肥胖的女性中，GSH和SCARB2的共存显著上调（图7I）。此外，研究人员观察到在超重和肥胖女性中，ARF1、mTOR和溶酶体存在共定位（图7J）。此外，在超重和肥胖的女性中，三种典型的GSH摄入转运蛋白的表达水平显著高于体重指数正常的女性（图7K）。Kaplan-Meier生存分析显示，在腔型A型乳腺癌、Her2阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌（TNBC）患者中，SCARB2高表达与显著的不良预后相关（图S7B-S7D）。总体而言，肥胖导致脂肪细胞GSH分泌增加，通过转运蛋白进入肿瘤细胞，并与溶酶体膜上的SCARB2结合。这种相互作用激活了mTORC1信号，促进了乳腺癌的生长和转移。

图7 抑制GSH/mTOR联合TAM治疗乳腺癌合并肥胖的疗效观察

图S7 SCARB2高表达患者预后较差

总结   

肥胖是导致乳腺癌预后不良的主要风险因素之一，但肥胖诱导的肿瘤微环境（TME）代谢物对乳腺癌生长和转移的影响尚不明确。本篇文章中，研究人员对肥胖和正常小鼠模型进行了TME代谢组对比分析，发现肥胖加速的乳腺癌TME中谷胱甘肽（GSH）水平升高。在脂肪细胞中敲除谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC），即谷胱甘肽合成的关键限速酶，可减少与肥胖相关的肿瘤进展。 

机制上，研究人员发现GSH进入肿瘤细胞并直接与溶酶体膜蛋白-2（清道夫受体类B成员2，SCARB2）结合，干扰其N和C末端之间的相互作用，促使SCARB2的N端暴露从而与GTP酶ARF1结合，促进了ARF1和mLST8的相互作用以将mTORC1募集到溶酶体，导致mTOR信号通路的激活。总之，研究人员证明了GSH通过作为mTOR信号通路的激活剂，将肥胖与乳腺癌进展联系起来。针对GSH/SCARB2/mTOR轴的调控可能有益于肥胖乳腺癌患者。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124003954?via%3Dihub

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