代谢学人
Cell Metabolism：分子电阻介导钙输入影响脂肪产热
撰文 | 王蕊 夏志蕊 王颖雯 朱丽君 刘爽 曹玉香
编辑 | 孟美瑶
校对 | 朱丽君
背景介绍
产热原理遵循焦耳第一定律：Q(J)=I2×R×T，其中I为电流，R为电阻，T为时间。这个公式解释了解偶联蛋白1(UCP1) 如何通过对线粒体电子传递链(ETC)的质子解偶联，导致棕色和米色脂肪细胞的产热。三十多年来，UCP1被认为是哺乳动物中唯一负责非颤抖性产热的蛋白质。因此，与棕色/米色脂肪相关的代谢主流理论主要围绕UCP1依赖的产热作用。然而，许多缺乏功能性UCP1基因的哺乳动物(如猪)的脂肪细胞却保留了产热能力；此外，尽管某些有袋类动物的UCP1不具有产热功能(小编注：有袋类动物是哺乳纲中的一个独特类群，属于后兽下纲，其最显著的特点是雌性具有育儿袋，幼崽在发育极不成熟的阶段出生，随后爬入育儿袋中继续发育)，但是它们的米色脂肪组织依然可以维持体温。重要的是，已经有新的证据表明脂肪组织可以通过不依赖于UCP1的机制产生热量——即无效循环产热，其有助于全身能量平衡(小编注：无效循环是两种相反的生化反应同时进行的生物现象，也被称为底物循环，是由一系列的酶所催化的水解ATP产生热能的循环反应。这些无效循环对整体不产生影响，但是该过程消耗了ATP并以热量的形式产生能量耗散)。
目前有许多研究为脂肪组织中不依赖UCP1的产热机制提供新的见解，例如，与肌酸激酶B(CKB)介导的ATP依赖性肌酸磷酸化或线粒体定位的TNAP介导的肌酸去磷酸化有关的无效肌酸循环、当脂肪分解和脂肪酸再酯化同时激活导致产热的无效脂质循环、通过ATP依赖性的Ca²⁺泵(骨骼肌中为SERCA1，脂肪细胞中为SERCA2b)激活Ca²⁺摄取到内质网/肌浆网(ER/SR）管腔时产生热量的Ca²⁺循环(Ca²⁺通过肌醇三磷酸受体(IP3Rs)和兰尼碱受体(RYRs)。这些UCP1非依赖性途径的共同特征是ATP连接底物的无效循环，即两条相反的代谢途径同时运行，整体上没有产生任何效果(小编注：UCP1依赖的产热机制主要是通过介导质子穿过线粒体内膜，耗散质子梯度，从而产生热量。而关于UCP1非依赖性的机制则主要包括肌酸循环、甘油三酯和脂肪酸之间的转化以及Ca²⁺循环。更加详细的机制可见“代谢学人20210415期‘产热脂肪：超越你想象’”)。无效循环途径受到生理刺激的严格调节，例如去甲肾上腺素(NE)失调可导致病理性高热、RYR1基因突变导致Ca²⁺从SR室泄漏，进而使人类和猪出现恶性高热(小编注：在寒冷刺激时，皮下脂肪的交感神经纤维会释放去甲肾上腺素，与米色脂肪细胞中的β3肾上腺素能受体(AR)结合，激活cAMP/PKA信号通路，PKA会进一步磷酸化下游的转录激活因子2(ATF2)，这些转录因子随后结合到UCP1基因启动子上，促进UCP1的表达。）（小编注：在无效钙离子循环中，SERCA利用ATP水解的能量逆浓度梯度将钙转运到SR，每消耗一个ATP转运两个钙离子，而钙从SER的释放主要由RyRs和IP3R介导，当SERCA介导的钙摄入和RyRs或IP3R介导的钙外排相互抵消时，SERCA不能有效地调节细胞质钙含量，因此会不断消耗ATP转运钙离子，从而产生热量。未磷酸化调节蛋白（PLN、SLN、MLN和ALN）的结合诱导SERCA的钙结合结构域发生结构变化，并使SERCA在不影响ATP水解活性的情况下降低钙转运效率。在这种调节蛋白结合状态下，ATP酶介导的SERCA钙泵效率降低，每消耗1个ATP所能转运的钙离子减少，因此会消耗大量的ATP，而ATP水解的多余自由能则以热的形式释放） 。
ATP连接底物的无效循环是如何产生热量到目前仍没有得到充分的解释。根据焦耳第一定律，UCP1非依赖型的无效循环产热关键在于确定ATP连接反应中的分子“电阻”(R)。一般情况下，肌醇磷脂(SLN)通过与SERCA1结合并降低Ca²⁺运输活性，促进肌肉产热，从而在骨骼肌中降低Ca²⁺循环。然而，小鼠皮下脂肪组织不表达SLN或者其他已知的SERCA1结合肽(如磷蛋白(PLN)、肌调节蛋白(MLN)和DWORF(图S1A))。当电阻R最小时，测量的耗氧率(OCR)并不能代表反应中产生的总热量，如心肌细胞的OCR较高但是由于R值较低而产热能力低。近期一篇发表在Cell Metabolism上名为“Identification of a molecular resistor that controls UCP1-independent Ca²⁺ cycling thermogenesis in adipose tissue”的文章鉴定了脂肪组织中SERCA2b依赖性Ca²⁺循环中的分子电阻，并开发了可在细胞器上使用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)量化产热的平台，通过该方法可直接记录组织和培养细胞中分离微粒体的产热情况。
拓展阅读
肌醇三磷酸/钙信号通路
肌醇三磷酸受体（IP3R）是细胞内钙离子释放的重要调节蛋白，主要分布在内质网膜上，在细胞信号传导中发挥着关键的作用。一些外部的刺激，比如神经递质、激素和生长因子，会通过激活和不同的磷脂酶C（PLC）异构体偶联的G蛋白偶联受体（GPCR）或者蛋白酪氨酸激酶连接受体（PTKRs）来刺激肌醇三磷酸（InsP3）的形成。GPCR和PLCβ亚型偶联，PTKRs和PLCγ亚型偶联，两者在转导过程中通过PLC将PtdIns4,5P2前体水解为InsP3和DAG，从细胞膜处逐渐扩散到细胞质中，从而与内质网上的IP3R结合，使内质网释放Ca2+。此外，InsP3会被IP3R激酶3或5终止，将其转化为InsP2或InsP4，进入肌醇磷酸代谢循环，重新变成游离的肌醇；而DAG被循环回前体CDP-DAG之后，与肌醇结合重新并被磷酸化变成PtdIns4,5P2前体，以此维持InsP3信号通路。
参考文献：
[1] Berridge MJ. Physiol Rev. 2016 Oct;96(4):1261-96.
1.UCP1非依赖性的无效Ca²⁺循环产热有助于腹股沟脂肪的总热量产生；
2.C4orf3通过降低SERCA2b的能量利用效率促进Ca²⁺循环产热；
3.C4orf3是体内UCP1非依赖性产热的必需分子；
4.C4orf3/ALN的缺失导致脂肪增多和全身胰岛素抵抗。
研究结果
1 .脂肪组织中微粒体产热的直接记录
首先，研究人员采用了一台热检测分辨率高达0.04 μJ 的等温滴定量热仪（ITC）（小编注：等温滴定定量热仪可以用来检测滴定反应中非标记的、分子之间相互作用时因非共价键重组所吸收或释放的热量变化，以表征生物分子之间的相互作用。在ITC中，一般包含两个加样池，一个是含有水的参比池，一个是包含目标蛋白的样品池，两个池子之间通过一个热电偶回路相连，确保样品池和参比池的温度完全相同。在将含有配体的滴定剂加入含有目标蛋白的样品池后，样品与滴定剂发生吸热/放热反应，导致样品池和参比池的温差发生变化，从而通过热敏装置检测到反应变化的能量）来检测从小鼠肩胛骨棕色脂肪组织( iBAT)和腹股沟白色脂肪组织(IngWAT)分离的线粒体和微粒体中的产热情况(图1A)(小编注：线粒体通过UCP1介导非偶联呼吸，将质子动力势能转化为热能，而微粒体是内质网在细胞匀浆和差速离心过程中破碎形成的微小膜囊结构，主要参与蛋白质合成、脂质代谢等过程，其产热能力相对较弱)。在分离的线粒体中，研究人员添加苹果酸、丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸以激活复合物I + II，添加棕榈酰肉碱和苹果酸以激活线粒体β-氧化，随后测量了其产热情况。在分离的微粒体中，研究人员记录了毒胡萝卜素(thapsigargin，一种非竞争性的SERCA抑制剂)存在或不存在的情况下，响应ATP(1mM)和游离Ca²⁺的微粒体产生的热量(小编注：毒胡萝卜素与结合Ca2+的SERCA跨膜区(由TM3、TM5和TM7构成的疏水口袋)结合，使得SERCA 钙离子结合位点在空间上无法靠近胞质内的钙离子，从而抑制SERCA与胞质Ca²⁺的结合，引起细胞质Ca²⁺升高)。为计算SERCA依赖性产热，各样本中毒胡萝卜素组的产热速率均作为本底值从对照组数据中减去。为排除非特异性离子结合产生的热信号，研究人员依据先前建立的实验方案，在反应启动2分钟后开始记录微粒体产热，持续监测5分钟（图S1B）。需特别说明的是，在无Ca²⁺条件下，或使用不可水解的ATP类似物AMP-PNP与Ca²⁺共同处理的样本中均未检测到产热信号（图S1C）。这些数据验证了基于ITC的细胞器产热检测体系具有高度特异性。
基于以上测定方法，研究人员检测了野生型对照小鼠和UCP1敲除(KO)小鼠iBAT中的线粒体产热作用。结果显示，ITC测量法检测到了野生型小鼠中大量依赖于UCP1产生的热量（小编注：主要是与UCP1 KO小鼠对比发现WT小鼠的热量更高，所以作者认为WT小鼠中有大量依赖于UCP1产生的热量），而UCP1 KO小鼠iBAT线粒体中的热量则损失了38.5%(图1B)，但也同时说明UCP1 KO线粒体中的产热可能是由于UCP1非依赖性产热或者基质中的底物反应(以上测量均在分离得到的线粒体中进行，线粒体蛋白的含量相同)。另一方面，研究人员在iBAT的微粒体中没有检测到SERCA依赖性产热(即毒胡萝卜素敏感的放热反应)(图S1D)。这一结果与研究人员之前的工作一致，表明IngWAT的Ca²⁺循环产热具有选择性，而在iBAT中可以忽略不计。因此，iBAT中的整体热量产生主要是来源于线粒体产热(图1C)，这可能是由于iBAT中的棕色脂肪细胞含有少量的ATP合酶并且产生ATP的能力有限。因此，在iBAT微粒体中的ATP依赖性产热较少。而与iBAT形成鲜明对比的是，研究人员在野生型小鼠IngWAT分离的微粒体中检测到大量SERCA依赖性产热。尽管IngWAT产生的总热量远远低于iBAT，但是其微粒体产热等于甚至高于IngWAT中线粒体来源的产热(占总热量的55.5%)。但需要注意的是，在毒胡萝卜素的存在下，IngWAT中的微粒体产热大幅度减少，说明微粒体的产热高度依赖于SERCA2(图S1E)。同样，研究人员在之前建立的脂肪细胞特异性SERCA2 KO小鼠模型的IngWAT中检测到了微粒体产热能力的消失(图S1F)。
基于现有平台，研究人员探索了UCP1的缺失是否会触发Ca²⁺循环产热的代偿性激活。首先，研究人员从β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243处理5天的野生型小鼠和UCP1 KO小鼠的IngWAT中分离了微粒体和线粒体。在线粒体中，ITC热量检测显示UCP1 KO后线粒体产热减少，表明UCP1依赖性产热介导了IngWAT中线粒体大部分产热(图1D)。另一方面，基于ITC的 pCa 6.0时ITC热量测定发现UCP1 KO小鼠IngWAT中的微粒体产热显著增加(图1E)（小编注：pCa 6.0相当于1 μM游离钙离子浓度，是内质网钙泵的典型激活阈值），并且其产热的增加伴随着IngWAT中SERCA2蛋白表达的上调(图1F)。总之，这些数据表明，UCP1非依赖性的Ca²⁺循环产热有助于IngWAT的总热量产生(尤其是在没有UCP1的情况下)。
2 .C4orf3通过降低SERCA2的能量利用效率促进Ca²⁺循环产热
研究人员通过分析转录组学数据发现，小鼠脂肪组织中无法检测到已知的SERCA1结合肽(包括SLN)(图S1A)。因此，研究人员寻找了通过与SERCA2b蛋白结合来控制Ca²⁺循环产热的脂肪细胞富集因子。首先，研究人员进行了以下生物信息学分析：(1) 先前研究发现脂肪选择性PRDM16转基因×UCP1 KO小鼠的Ca²⁺循环产热增加，因此研究人员筛选了这些小鼠IngWAT中显著表达的长链非编码RNA(lncRNAs，TPM>10) （小编注：TPM（Transcripts Per Million，每百万转录本数） 是RNA-seq中一种用于标准化和比较基因表达量的常用指标。它通过考虑基因长度和测序深度的影响，将不同样本和不同基因的表达量标准化到一个统一的水平，以便进行更准确的比较）；(2) 检测了上述鉴定的lncRNAs和SERCA1结合肽(包括PLN和SLN)之间的同源性；(3) 通过生成使用HDOCK服务器分析SERCA的3D结构，预测这些候选蛋白和SERCA蛋白之间的相互作用，并确认了5个候选蛋白(图S2A)。基于以上预测结果，首位的候选者是编码65个氨基酸的C4orf3。先前有研究表明C4orf3具有与PLN类似的对SERCA的Ca²⁺转运抑制的作用，因此被称为另一种调节蛋白(ALN)。研究人员发现C4orf3/ALN的mRNA在米色脂肪细胞中高度表达，而其他SERCA结合肽(MLN、SLN、PLN和DWORF)则未被检测到(图2A)。最近一项关于小鼠IngWAT的单细胞RNA测序数据分析表明，参与Ca²⁺循环的基因(如Atp2a2(SERCA2)、Itpr1和Itpr2)在P2和P5米色脂肪细胞群中富集，而在其他细胞群中低表达；C4orf3在P2、P5、P7以及其他群体(除P6、P9)中低表达(图S2B)。值得注意的是，P2米色脂肪细胞群表达具有高ATP合成能力的Atp5k，并且利用ATP相关的无效循环产热。然后，研究人员开发了一种针对C4orf3/ALN的多克隆抗体，发现内源性蛋白在IngWAT和其他几种组织(如心脏、肾脏和大脑)中高表达，但在骨骼肌中几乎检测不到(图S2C)。其次，6℃冷适应的UCP1 KO小鼠IngWAT中的C4orf3/ALN蛋白表达高于30°C时的热适应小鼠(图2B)。此外，研究人员还验证了IngWAT来源的脂肪分化细胞中SERCA2b和内源性C4orf3/ALN蛋白之间的相互作用(图2C)。
先前的研究表明，C4orf3/ALN的过表达会像其他已知的SERCA结合肽那样抑制细胞中SERCA2介导的Ca²⁺转运。然而，C4orf3/ALN在体内的生物学作用仍然未知。因此，研究人员通过使用CRISPRi系统，催化失活的Cas9蛋白(dCAS9)融合到Krüppel相关盒(KRAB)结构域，从而产生了C4orf3缺乏的小鼠。将表达靶向C4orf3有效gRNA的转基因小鼠与dCas9-KRAB小鼠杂交（小编注：dCas9由于HNH和RuvC结构域的突变而不执行DNA的切割功能，CRISPRi系统则是指将抑制基因转录的效应器融合在dCas9蛋白上，在sgRNA的引导下，转录抑制效应蛋白和靶基因相关元件作用。其中，编码基因中的KRAB结构域具有转录抑制的作用，人类基因组中大约有350个编码蛋白的基因含有该结构域。因此，dCas9-KRAB是CRISPRi系统中常用的平台之一，可以特异性地抑制靶基因的表达，而不需要对DNA进行切割），生成C4orf3/ALN缺陷小鼠(CRISPRi-C4orf3)(图2D和S2D)。随后，研究人员从CRISPRi-C4orf3小鼠和对照小鼠的IngWAT中提取了基质血管部分(SVF)。在来自原代SVF的分化脂肪细胞中，研究人员测量了响应NE(一种有效的产热刺激)的细胞内Ca²⁺通量，结果发现在对照细胞和C4orf3/ALN敲除的脂肪细胞中NE迅速升高了细胞内Ca²⁺水平，而C4orf3/ALN敲除的脂肪细胞细胞内Ca²⁺摄入则更快(图2E)。这一观察结果在体内得到了进一步的验证：在pCa 6.0时，CRISPRi-C4orf3小鼠IngWAT分离的微粒体中45Ca的摄取量显著高于同窝对照小鼠(图2F)。这些结果表明，与之前细胞中的研究一致，C4orf3/ALN缺乏的脂肪细胞比对照脂肪细胞更快地将Ca²⁺摄取到内质网中，即C4orf3/ALN的功能同其他SERCA1结合肽一样，它是SERCA的“另一种”抑制调节因子。
然而，后续数据表明C4orf3/ALN具有不同于其他抑制肽的独特功能。研究人员发现，C4orf3缺失使脂肪组织中SERCA2的ATP水解活性显著降低了17.8%（图2G和S2E）。这与其它同时降低SERCA的ATP水解活性和Ca²⁺转运活性的抑制肽形成鲜明对比（小编注：若C4orf3/ALN仅是抑制肽，C4orf3敲除小鼠中SERCA2的ATP水解活性应会升高）。当研究人员计算每单位ATP水解的Ca²⁺内流效率时，发现C4orf3/ALN缺失的脂肪组织比对照组Ca²⁺的转运效率显著提高90.6%（图2H）。值得注意的是，CRISPRi-C4orf3小鼠与对照小鼠在IngWAT中SERCA2的mRNA和蛋白表达水平均无差异（图S2F和S2G）。这些结果表明，C4orf3/ALN与SERCA2的结合改变了ATP水解与Ca²⁺转运的化学计量关系（即耦联效率），而非单纯作为抑制肽改变SERCA2表达水平。这种Ca²⁺转运效率的变化正体现了焦耳定律中的R因子（电阻）（小编注：在焦耳定律中，电流通过电阻时电能转化为热能。根据公式Q=I^2RT,C4orf3/ALN降低了Ca²⁺的转运活性，实际相当于增加了电阻“R”，因此增加了产热）。
为了测试 C4orf3/ALN-SERCA2 复合物是否会改变Ca²⁺循环产热，研究人员采用基于ITC的产热测定来测量CRISPRi-C4orf3小鼠和对照小鼠IngWAT在pCa 6.0时微粒体组分的产热量，结果表明CRISPRi-C4orf3小鼠微粒体产生的热量明显少于对照小鼠(图2I)。随后，研究人员通过毒胡萝卜素来确定两组之间的差异是否是由于SERCA2依赖性产热，结果与C4orf3改变Ca²⁺转运效率(即低R)一致，因此，C4orf3的敲除导致SERCA2依赖性Ca²⁺循环产热减少。另一方面，尽管肾脏微粒体产热有轻微的趋势但并没有统计学差异(图S2H)。 为了进一步确定ALN对微粒体产热的组织选择性作用，研究人员在dCas9-KRAB小鼠的IngWAT中注射了表达靶向C4orf3的gRNA的AAV病毒以及对照AAV病毒。相对于对照AAV，AAV-gRNA成功地将C4orf3的mRNA表达降低了66.6%(图2J)。与在全身CRISPRi-C4orf3小鼠中的观察结果一致，研究人员发现AAV-gRNA处理的小鼠IngWAT中的微粒体产热相对于对照小鼠减少(图2K)。综上所述，C4orf3/ALN对IngWAT中Ca²⁺循环产热有着独特的作用。
3 .C4orf3改变SERCA2的Ca2+转运效率的结构机制
SERCA蛋白在催化循环过程中通过动态构象变化将胞质Ca²⁺转运至内质网/肌质网（ER/SR）腔侧。当从E1·2Ca²⁺状态向E2状态转变时，SERCA2的驱动结构域（A-domain）发生近100°的旋转，同时跨膜（TM）螺旋簇TM1-4打开将Ca²⁺释放至腔侧。然而，C4orf3/ALN如何调控SERCA2b的Ca²⁺转运效率仍不清楚。与仅通过膜内结构域结合SERCA1的SLN不同，C4orf3/ALN具有异常长的膜外结构域（图S3A）。基于AlphaFold3的预测显示，C4orf3/ALN的跨膜结构域与SERCA2b的TM2、TM4、TM6和TM9形成的跨膜沟槽结合，这种结合模式类似于SLN与SERCA1的复合物。另一方面，C4orf3/ALN的胞质结构域与SERCA2b的磷酸化结构域（P-domain）紧密相邻(图3A)。
为了在实验中验证这一预测，研究人员使用Turbo-ID邻近标记蛋白质组学（小编注：TurboID 是一种工程化的生物素连接酶，能够在活细胞内将生物素（biotin）共价标记到邻近蛋白的赖氨酸残基上。这一技术通过将Turbo-ID与诱饵蛋白融合，当诱饵蛋白与靶标蛋白发生相互作用时，Turbo-ID会将生物素标记到邻近的蛋白质上，随后通过链霉亲和素磁珠富集标记的蛋白质，并利用质谱法鉴定）来探究C4orf3/ALN和SERCA2b的结合情况。首先，研究人员在米色脂肪细胞中表达了在N端融合了Turbo-ID邻近标签的C4orf3/ALN蛋白(即C4orf3/ALN的细胞质侧)，随后进行串联质谱（TMT）定量蛋白质组学分析鉴定与C4orf3/ALN相关联的蛋白。与AlphaFold3 预测的结构一致，该实验鉴定了来自P域的四个肽段和来自SERCA2b的TM2的一个肽段 (图3B)。研究人员还鉴定出了来自A、N结构域的肽，表明C4orf3/ALN和SERCA2b的复合物中，其细胞质结构域具有高度灵活性。有趣的是，研究人员用NE对米色脂肪细胞进行处理后再进行Turbo-ID邻近标记，结果检测到了相同的SERCA2b肽(图S3B)。这些数据表明，C4orf3/ALN在基础状态和NE刺激状态下均与SERCA2b相互作用。与这一结果一致地是，使用分离微粒体的交联实验表明，尽管C4orf3/ALN在E2状态下比在E1状态下与SERCA2b结合更稳定，但是整个SERCA2b的催化循环中，C4orf3/ALN都与SERCA2b相互作用(图3C和图S3C)。先前在微粒体中观察到SERCA1和SLN之间存在类似的依赖性结合，但其中SLN降低了SERCA1依赖性Ca²⁺摄取而不影响其ATP水解。
考虑到C4orf3/ALN特有的长胞质结构域，研究人员探究了该结构域在功能上是否为SERCA2依赖性Ca²⁺循环产热过程中必需的。为此，研究人员构建了一个缺失胞质结构域的截断突变体（突变体TM）。此外，研究人员构建了在胞质结构域上三个进化保守的片段进行三个氨基酸替换的C4orf3突变体（突变体A、B和C）（图3D和S3D）。再将全长（野生型）C4orf3和这些突变体与SERCA2b一起在293T细胞中异位表达（图S3E）。研究人员发现所有构建体都显著降低了SERCA2的Ca²⁺转运率（图3E）。缺乏胞质结构域的突变体（突变体TM）虽然蛋白水平低于野生型，但是仍有效降低了SERCA2依赖性Ca²⁺ 的转运速率。以上结果表明，C4orf3/ALN对SERCA2 Ca²⁺转运的抑制作用是通过在其TM结构域上SERCA2-C4orf3/ALN的相互作用介导的。相比之下，野生型C4orf3/ALN利用其胞质结构域显著激活SERCA2 ATP水解。突变体A和C没有改变SERCA2的ATP酶活性（图3F），这表明C4orf3/ALN胞质结构域的A和C片段是C4orf3/ALN激活SERCA2 ATP水解的必要条件。在这些细胞纯化的微粒体中进行的基于ITC的产热实验发现，全长C4orf3/ALN能有效地刺激微粒体产热，而缺乏胞质结构域（突变体TM）或结构域A/C（突变体A和C）的C4orf3突变体不能刺激微粒体产热（图3G和S3F）。C4orf3/ALN对微粒体产热的影响依赖于SERCA2，因为在缺乏SERCA2的细胞中，ALN和突变体的异位表达不影响微粒体产热（图S3G）。研究人员还发现HEK293细胞微粒体的总产热量明显低于IngWAT，这可能是由于内质网膜组成或Ca²⁺循环调节剂的变化所致。以上结果支持了Alphafold3预测的SERCA2b-C4orf3/ALN复合物的结构，其中C4orf3/ALN的细胞质区域部分与负责ATP水解的SERCA2b P结构域相互作用（图3A）。总之，C4orf3/ALN通过其自身的TM结构域的相互作用降低了SERCA2的Ca²⁺运输效率，同时通过细胞质区域增加了其ATP酶活性，从而促进微粒体Ca²⁺循环产热。
4.C4orf3/ALN 是体内不依赖 UCP1 产热所必需的
研究人员旨在确定 C4orf3/ALN 对脂肪组织产热和能量平衡是必须的。为此，研究人员将 CRISPRi-C4orf3小鼠和同窝对照小鼠暴露于6℃环境中。然而，研究人员发现在寒冷暴露期间两组小鼠的直肠温度没有任何差异（图4A）。由于寒冷诱导的肌肉战栗在两组中同样活跃（图S4A）（小编注：研究人员采用肌电图（EMG）进行记录，可用专用的肌电仪进行检测。在肌肉产生机械性变化的过程中，肌肉受到神经支配，并产生电化学梯度的变化，可以通过EMG来检测，并进一步转化为可分析的图形，并且EMG活动（以微伏为单位）与肌肉收缩量以及收缩肌的数量呈线性相关，肌肉收缩越强烈，激活的肌肉中运动单位的数量越多，记录的电压振幅就越高），研究人员接下来检测了脂肪组织中可能的代偿性非颤抖性产热反应。结果表明，当组织受到NE刺激时CRISPRi-C4orf3小鼠iBAT的OCR显著高于对照组。同样，在对照和NE刺激条件下，CRISPRi-C4orf3小鼠IngWAT的OCR高于对照组（图4B）。IngWAT中OCR升高伴随着包括Ucp1, Cidea, Elov3和Dio2在内的产热基因mRNA表达增加（图4C）。尽管CRISPRi-C4orf3小鼠与对照小鼠iBAT中UCP1蛋白表达水平没有差异，但是相比于对照小鼠，CRISPRi-C4orf3小鼠iBAT中Ucp1和Dio2 mRNA表达有升高的趋势（图S4B 和S4C）。
上述结果引发了研究人员的假设，即寒冷暴露触发了CRISPRi-C4orf3小鼠中UCP1介导的产热反应代偿性激活。为此研究人员从寒冷暴露小鼠的IngWAT和iBAT 中分离出线粒体进行验证。在IngWAT中，研究人员发现C4orf3/ALN缺陷小鼠与线粒体复合物I和II活性相关的OCRs显著高于对照小鼠（图4D）。此外，C4orf3/ALN 缺陷小鼠IngWAT中复合物Ⅱ（SDHB）、复合物Ⅲ（UQCRCII）、复合物Ⅳ（MTCO1）和复合物Ⅴ（ATP5A）中线粒体亚基的蛋白表达水平高于对照小鼠（图S4D）。相比之下，两组之间的iBAT线粒体呼吸和复合物亚基表达没有差异（图S4E和S4F）。为了直接检测这些组织中产热变化，研究人员将从寒冷暴露小鼠中分离的线粒体进行基于ITC的产热测定。研究人员发现CRISPRi-C4orf3小鼠IngWAT的线粒体产热显著高于对照小鼠（图4E）。CRISPRi-C4orf3小鼠IngWAT中TNAP蛋白水平有增加的趋势；然而，使用TNAP抑制剂SBI-425（对肌酸循环进行药理学抑制）并没有改变CRISPRi-C4orf3小鼠的线粒体呼吸（图S4G）。以上结果表明UCP1依赖性产热介导CRISPRi-C4orf3小鼠线粒体产热的代偿性激活。
因此，研究人员通过将CRISPRi-C4orf3小鼠与UCP1 KO小鼠杂交，繁育出同时缺陷UCP1和C4orf3/ALN的小鼠（DKO小鼠）。随后，用β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243慢性处理小鼠5天以刺激两组小鼠米色脂肪的生成。这些小鼠首先置于室饲养，再暴露于6℃。与先前关于UCP1 KO小鼠WAT产热的研究一致， CL316243处理的UCP1 KO小鼠能够在冷暴露后维持其核心体温长达6小时（小编注：以往文献中公认的UCP1 KO小鼠是冷不耐受的结果还是成立的，但是研究人员提供的参考文献中提示给予UCP1 KO小鼠CL316423治疗能够提高小鼠基础产热和刺激产热，这也提示CL316423刺激下UCP1非依赖性产热途径（如肌酸循环、Ca²⁺循环）可能被激活 DOI: 10.1152/ajpendo.00197.2003）（图4F）。然而，DKO小鼠的直肠温度迅速下降，在5h后降至30℃以下。在冷暴露6h后， DKO小鼠出现过低体温，因此研究人员终止实验以避免体温过低导致的死亡。为了进一步确定C4orf3/A：N在DKO小鼠IngWAT中的UCP1非依赖性功能，研究人员对在pCa6.0条件下收集的微粒体进行了Ca²⁺摄取试验。与CRISPRi-C4orf3小鼠的结果一致，研究人员发现DKO小鼠微粒体中Ca²⁺摄取显著高于对照Ucp1 KO小鼠（图4G），而它们的ATP酶活性略低于对照Ucp1 KO小鼠（图4H）。因此，DKO小鼠IngWAT微粒体的SERCA2效率（Ca²⁺摄取/ATP水解）高于对照Ucp1 KO小鼠（图4I）。重要的是，ITC分析显示，与对照Ucp1 KO小鼠相比，DKO小鼠SERCA依赖性微粒体产热显著减少（图4J）。以上结果表明，C4orf3/ALN是体内UCP1非依赖性的产热和冷适应所必需的。
5.对C4orf3和UCP1缺失的代偿反应
为了进一步了解与C4orf3/ALN和UCP1缺失相关的分子变化，研究人员接下来对DKO小鼠冷暴露5h后的IngWAT进行了RNA-seq分析。通过RNA-seq分析发现UCP1缺失导致包括Atp2a2（SERCA2）、Ryr2和Itpr1在内的参与Ca²⁺循环产热基因表达升高（图S5A），这与研究人员之前的研究结果是一致的，表明脂肪组织中存在非UCP1依赖性的产热机制。同样，在UCP1缺失的情况下，肌酸循环基因Slc6a8和Ckm的表达升高（图S5B）。此外与其他基因型相比，研究人员发现276个基因在C4orf3/ALN和UCP1缺乏小鼠中优先上调（表S1）。对该基因集进行（Gene Ontology，GO）分析，发现上调的通路与(1)前体代谢物和能量的产生 (2)脂质分解代谢过程和(3)脂肪酸代谢过程相关（图5A）。以上基因包括β1-肾上腺素能受体（Adrb1）、肉碱棕榈酰基转移酶Ⅱ（Cpt2）、脂肪营养素（Pnpla3）、磷脂酶CΔ3 （Plcd3）、乙酰辅酶A（CoA）乙酰转移酶1/2（Acat1和Acat2）、Sirt3和Prkag2 (AMPK亚基γ2)（图5B）。DKO小鼠的呼吸交换率低于UCP1 KO小鼠（图5C和5D），这与转录组数据相印证，即当Ca²⁺循环和UCP1产热失活时，IngWAT作为冷适应代偿途径的脂质分解代谢过程和脂肪酸氧化增强。
6.C4orf3的缺失导致肥胖和全身胰岛素抵抗的增加
鉴于C4ORF3在小鼠和人类脂肪组织中高表达，研究人员检测了C4ORF3 在正常体重、超重和肥胖人群的人皮下脂肪组织中的表达。表1 提供了患者人口统计学数据。研究人员发现，相较于非肥胖健康人，3级肥胖人群（BMI>40）和肥胖合并2型糖尿病人群C4ORF3的mRNA表达水平显著降低（图 6A）。ATP2A2 （SERCA2）的mRNA表达水平在在1级和2级肥胖人群中略有升高，但在3级肥胖和肥胖合并2型糖尿病人群中下调。来自2型糖尿病认识门户（http://type2diabetesgenetics.org/）的人类遗传关联研究（全基因组关联研究 [GWAS]）发现C4ORF3与BMI（p=4.54e-8）、低密度脂蛋白胆固醇（p=2.14e-9）和冠状动脉疾病（p=2.80e-10）之间存在中度但显著的相关性。以上结果表明C4orf3/ALN在系统能量平衡中可能的作用。
因此，研究人员检测了C4orf3/ALN 缺失导致全身能量平衡和葡萄糖稳态改变的程度。为了尽量减少UCP1应对寒冷和饮食诱导的产热的贡献，实验在热中性条件（30℃）和普通饮食中进行。利用回声MRI扫描发现20周龄的CRISPRi-C4orf3小鼠的肥胖率明显高于同窝对照组，并且表现出瘦体重减少的趋势，尽管两种基因型小鼠的肌肉重量、握力和肌肉纤维类型组成没有显著差异（图6B和S6A-S6C）。在30℃条件下，两组之间全身 OCR 无统计学差异（图S6D和S6E）。研究人员还发现两种基因型小鼠之间的食物摄入量没有差异（图6C）。并且两组之间的总体重没有显著差异（图6D）。但是CRISPRi-C4orf3小鼠的EpiWAT和IngWAT的组织质量显著高于对照组小鼠（图 6E）。组织学分析显示，CRISPRi-C4orf3小鼠IngWAT和Epi WAT中的脂肪细胞大小显著大于对照WAT（图6F）。在雌性CRISPRi-C4orf3小鼠中，肥胖率持续升高（图S6F）。
最后，研究人员探究了C4orf3/ALN缺失是否会因肥胖的增加而影响这些小鼠的全身胰岛素敏感性。胰岛素耐量试验表明，CRISPRi-C4orf3小鼠即使在正常饮食的情况下，胰岛素耐受能力也显著低于对照小鼠（图6G）。此外，CRISPRi-C4orf3小鼠的空腹胰岛素水平也显著高于对照小鼠（图6H）。研究人员还发现CRISPRi-C4orf3小鼠肝脏中的甘油三酯含量显著升高，表明其参与胰岛素抵抗（图6I）。并且相比于同窝对照小鼠，雌性CRISPRi-C4orf3小鼠表现出全身系统性胰岛素抵抗（图S6G）。以上结果表明C4orf3/ALN 缺失会导致更严重的肥胖和系统性胰岛素抵抗。
总结
脂肪组织产热通过UCP1和UCP1非依赖途径促进能量平衡。在UCP1非依赖性的产热机制中，一种是通过脂肪组织中SERCA2b参与Ca²⁺循环，但其中潜在的分子基础仍然不清楚。本研究报道了内质网膜锚定肽C4orf3/ALN，其能够将SERCA2b的Ca²⁺转运与ATP水解解偶联，从而使SERCA2b-C4orf3复合物产热。C4orf3/ALN的缺失提高了SERCA2b依赖性Ca²⁺运输的能量效率，而不影响SERCA2的表达，从而减少脂肪组织产热，导致小鼠肥胖。而C4orf3的基因缺失导致冷刺激后UCP1依赖性产热的代偿性激活。研究人员证明C4orf3和Ucp1的基因缺失会损害小鼠冷适应能力。综上所述，本研究发现并证明C4orf3是SERCA2b介导的Ca²⁺输入的分子电阻，在UCP1非依赖的产热和能量平衡中起关键作用。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413125001123?via%3Dihub
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