代谢学人

Cell Metabolism：“肌”不可失——线粒体的“钙”世英雄

撰文 | 李姿萱 郭钰涵 闪光余 周文豪 邱瑾

编辑 | 孟美瑶

校对 | 李姿萱

背景介绍

细胞主要依靠线粒体中的氧化代谢和ATP合成来产生能量，线粒体功能障碍是衰老的主要特征之一，会导致一系列慢性疾病。糖尿病降糖药物二甲双胍的临床试验表明，二甲双胍能够通过触发线粒体低毒兴奋效应（mitohormesis）（小编注：mitohormesis，反复暴露于低水平的线粒体应激可以诱导各种胞浆和核反应，建立对高水平应激的韧性从而保护细胞，这种适应性反应被称为mitohormesis）来增强线粒体的适应性，从而延缓衰老。其他临床治疗分子如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+前体、线粒体复合物稳定剂等，能够在衰老期间保持线粒体完整性并重编程能量代谢。例如，Elamipretide (SS-31) 是一种合成四肽，是一种新型治疗药物，可选择性地靶向线粒体以改善线粒体功能。SS-31能够保护线粒体膜结构与呼吸链复合物的物理稳定性，其与线粒体内膜上的心磷脂结合(cardiolipin，CL），调控线粒体呼吸链复合体的组装和活性。由于CL的不饱和脂肪酸含量高，且靠近活性氧（ROS）产生的电子传递链（ETC）位置，因此极易被氧化。在正常条件下，细胞色素c（cyt c）通过与CL的特异性相互作用附着在线粒体内膜上，负责在呼吸链复合体III和IV之间传递电子。但当在病理或应激条件下，cyt c在结构和催化能力上会发生巨大的变化，导致cyt c转化为过氧化物酶，使CL被过氧化。SS-31分子结构中的亲脂性三苯基膦（TPP+）使其能穿透细胞膜，并精准定位至线粒体内膜，SS-31通过静电和疏水相互作用与心磷脂结合，通过与心磷脂的相互作用，SS-31能够阻止细胞色素 c 转化为过氧化物酶，从而减少心磷脂过氧化，从而维持电子传递链（ETC）复合物的空间构象，保护线粒体嵴结构，并维持机体正常氧化磷酸化。另外，有研究发现SS-31能够靶向富含线粒体的肾皮质，有效降低糖尿病小鼠肾皮质中的mtROS水平，逆转脂肪酸氧化（FAO）关键酶的减少，在电镜下观察到线粒体的形态改善（参考文献：1. Chavez JD, Tang X, Campbell MD, et al. Mitochondrial protein interaction landscape of SS-31. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(26):15363-15373. 2. Hou Y, Tan E, Shi H, et al. Mitochondrial oxidative damage reprograms lipid metabolism of renal tubular epithelial cells in the diabetic kidney. Cell Mol Life Sci. 2024;81(1):23.）。然而，目前尚未发现能够直接刺激线粒体ATP生成的治疗方法。

运动中的肌肉收缩是一个高度耗能过程，因此线粒体代谢在骨骼肌中尤为重要。运动可维持衰老过程肌肉中的线粒体健康，而线粒体功能障碍是骨骼肌随年龄增长而衰退的主要原因。线粒体呼吸复合体的活性降低会直接导致肌肉质量减少、力量下降和步速降低，这是肌少症（sarcopenia）的临床特征，并且会严重影响老年人的行动能力和生活质量。目前，肌少症的治疗主要依赖运动和营养方面的干预。临床研究证实，有组织的运动计划对肌少症的治疗有益；而在营养管理方面，则需要通过补充蛋白质和微量营养素来补足老年人的营养缺陷。富含多酚的饮食，如以橄榄油为主的地中海饮食（小编注：Mediterranean diet，地中海饮食，是泛指希腊、西班牙、法国和意大利南部等处于地中海沿岸的南欧各国以蔬菜水果、鱼类、五谷杂粮、豆类和橄榄油为主的饮食风格，见下图）能够降低衰老相关的慢性疾病风险，特别是心血管疾病。然而，这些有益健康的多酚类物质的性质和作用机制仍然难以确定，其在肌少症中的作用也有待探索。

地中海饮食（Mediterranean diets）示意图

线粒体钙（mtCa2+）能够直接调控氧化代谢并影响骨骼肌的生理功能。线粒体中钙的摄取由线粒体钙单向转运蛋白（MCU）调控，MCU是一种多蛋白复合物，由线粒体内膜上的MCU通道和调节亚基组成，前者负责将Ca2+转运到线粒体内膜，后者负责调节MCU的活性，以适应细胞的代谢需求。在兴奋-收缩耦联过程中，肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）释放Ca2+刺激骨骼肌收缩，而mtCa2+则通过线粒体的氧化代谢将骨骼肌收缩与 ATP 的产生联系起来。机制上，mtCa2+能够使三羧酸循环（TCA）中的脱氢酶活化，如Ca2+能够使丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）去磷酸化，从而激活TCA循环限速酶丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性。

有研究表明，骨骼肌中mtCa2+摄取和MCU活性增加与运动训练诱导的线粒体适应相关。在骨骼肌中刺激mtCa2+摄取和过表达MCU都能够促进线粒体代谢和肌肉结构的适应性变化。同时，mtCa2+也是肌肉正常收缩和代谢所必需的，骨骼肌中MCU基因的缺失会损害线粒体的氧化能力，降低肌肉力量和运动能力。此外，MCU的调节亚基能够调节肌肉的生理功能，在骨骼肌中线粒体钙摄取蛋白1 (MICU1) 的缺失会降低mtCa2+的摄取和能量代谢，导致肌纤维损伤、肌肉无力和疲劳。

人类遗传学研究也证实了通过MCU复合物摄取mtCa2+在肌肉生理学中的重要作用，MICU1的单基因突变会导致罕见病的发生，具有肌肉病理表型，表现为严重疲劳和嗜睡。尽管这些研究揭示了mtCa2+与骨骼肌健康息息相关，但MCU在慢性疾病如肌肉萎缩性疾病和衰老中的作用仍不清楚，且缺乏通过激活MCU来提高mtCa2+水平的治疗手段。

近期，一篇发表在Cell Metabolism上的题为“Mitochondrial calcium uptake declines during aging and is directly activated by oleuropein to boost energy metabolism and skeletal muscle performance”的研究发现线粒体钙单转运体调节因子1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1，MCUR1）的下调会导致mtCa2+摄取能力下降，还会直接导致线粒体能量代谢受损。研究人员筛选了食物中存在的5,000种天然生物活性分子，发现了橄榄苦苷（oleuropein）这种天然多酚物质能够作为MCU特异性激活剂，橄榄苦苷能够通过它的去糖基化代谢产物与MCU的MICU1亚基结合来刺激mtCa2+摄取，提高氧化代谢和肌肉性能。同时，橄榄苦苷还能够逆转随年龄增长而带来的MCUR1依赖性mtCa2+摄取障碍，提高衰老小鼠的线粒体活性和运动能力。

1. MCUR1下调介导的mtCa2+的摄取减少是导致线粒体能量代谢障碍的主要原因 

2. 橄榄苦苷能与MICU1结合，刺激mtCa2+的摄取

3. 橄榄苦苷通过MCU增强肌肉能量代谢和运动能力

4. 橄榄苦苷能改善衰老过程中的线粒体功能下降和肌肉疲劳

研究结果

1、人体骨骼肌在衰老和肌少症中MCUR1下调，mtCa2+的摄取减少

为了研究mtCa2+是否参与了骨骼肌衰老的病理生理过程，研究人员用咖啡因刺激兰尼定受体1（ryanodine receptor，RyR1）（小编注：RYR1是一种位于位于肌浆网膜上的钙离子释放通道，主要分布在肌肉细胞中，特别是心肌和骨骼肌）来模拟肌肉收缩时从肌浆网中释放Ca2+，然后比较来自成年人和老年人原代肌管的mtCa2+摄取情况（图1A），发现衰老会使骨骼肌线粒体摄取Ca2+的能力显著下降（图1A-C）。

接下来，研究人员比较了来自健康老年人和肌少症患者（根据肌少症的临床标准诊断的患者，即肌肉质量和功能较低的患者，图S1A）的原代肌管，发现来自肌少症患者的肌管中的mtCa2+摄取显著低于来自健康老年人的肌管中的mtCa2+摄取（图S1B和S1C），表明病理性的肌肉老化加剧了mtCa2+摄取障碍。为了探究其分子机制，研究人员分析了患有肌少症的老年人肌肉活检组织中控制 mtCa2+摄取和释放的相关基因的表达情况，结果显示，肌少症患者中mtCa2+转运调节因子MCUR1的表达显著降低（图1D），其他调控mtCa2+的基因表达没有变化。分子通路和蛋白互作组学分析证实，MCUR1能够通过MCU来调控mtCa2+的稳态（图S1D）。通过DXA评估的非典型瘦体重指数（ALMi）（图1E）（小编注：ALMI，即附肢瘦体质量指数，是通过瘦体质量除以身高的平方来计算得出的一个指数，它主要用于评估肌肉萎缩的程度。这一指数能够反映个体四肢上的肌肉量与其整体身体质量的关系）和握力评估肌肉力量（图1F），研究人员发现MCUR1的基因表达水平与肌肉质量呈正相关。在连续变量分析中，研究人员发现MCUR1在肌肉中的表达还与ALMi、握力和步态速度正相关（图1G、1H和S1E），与进行“起立-行走”计时测试或椅子起立测试所需的时间呈负相关（图1I和S1F），表明MCUR1在体能较好的老年人中表达较高。以上结果表明，在人的骨骼肌中，随着年龄增长和体力的下降，mtCa2+的转运调控发生了改变，这提示着MCUR1可能在介导随年龄增长导致的mtCa2+摄取障碍中发挥作用。

为了探究在肌少症中观察到的MCUR1下调是否会降低骨骼肌mtCa2+摄取，研究人员在来自年轻人的原代肌管细胞中使用shRNA敲低了MCUR1表达（图1J）。结果显示，在MCUR1敲低（kd）后的肌管中，用咖啡因刺激后mtCa2+的摄取显著减少（图1K和1L）。随后，研究人员在来自老年人的肌管细胞中过表达MCUR1，发现69-90岁所有老年供体肌管中的mtCa2+摄取均提高（图1N），这表明骨骼肌中MCUR1表达降低是衰老过程中mtCa2+摄取障碍的重要原因。

图1. 人骨骼肌mtCa²⁺摄取随衰老而下降

图S1. 人类肌少症加重了衰老相关的mtCa²⁺摄取障碍，MCUR1与功能性肌肉衰退的临床指标相关

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为了研究人类衰老过程中发生的mtCa2+稳态调节是否可以建立临床前模型（小编注：临床前模型研究，简单来说，就是在药物进入人体临床试验之前，在实验室中利用各种模型来模拟人体的生理和病理状态，以考察药物的作用效果和潜在风险），研究人员比较了24月龄的衰老小鼠和年轻对照小鼠骨骼肌中mtCa2+的摄取情况和调节mtCa2+摄取的基因表达，结果发现，在衰老的肌纤维中，咖啡因刺激产生的胞浆钙瞬变显著降低，而静息的胞浆钙水平不变（图S2A和S2B）（小编注：钙瞬变，calcium transient，是由兴奋和冲动到来时所诱发的细胞胞质内瞬时性钙升高）。并且，与年轻小鼠相比，用咖啡因刺激Ca2+释放后，衰老小鼠肌纤维的mtCa2+摄取能力明显降低（图2A和2B），而在静息状态下的mtCa2+水平与年轻小鼠没有差异（图2C）。研究人员观察到，与在人类中肌肉衰老期间观察到的表型类似，衰老小鼠中MCUR1表达下调了54%，而通道蛋白（MCU、MCUb和EMRE）和其他调节亚基（MICU1、MICU1.1、MICU2和MICU3）的表达没有变化（图2D和S2C）。如图2E所示，线粒体基质中的Ca2+通过激活Ca2+依赖的丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP），使PDP去磷酸化，从而激活丙酮酸脱氢酶（PDH）。研究人员在之前的研究中证明，肌肉中MCU的特异性缺失（skMCU−/−）导致的mtCa2+摄取减少会降低PDH的活性，使线粒体耗氧率（OCR）降低，并将底物代谢从葡萄糖氧化转变为脂肪酸氧化。在本研究中，研究人员发现，与年轻小鼠相比，衰老小鼠肌肉中PDH的磷酸化水平显著升高（图2F和2G），基础呼吸、ATP依赖性呼吸（在寡霉素（oligomycin）处理后测定）、最大OCR（在羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙[FCCP]处理后测定）显著降低（图2H和2I）（小编注：①ATP依赖性呼吸是在用寡霉素（Oligomycin）处理后，从而抑制线粒体ATP合酶的活性，从而抑制ATP的产生，用于检测与ATP生产直接相关的OCR部分。②最大 OCR是在用羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙[FCCP]处理后测量，FCCP是一种线粒体解耦连剂，可以增强线粒体内膜对H+的通透性，促进H+被动扩散通过细胞膜，消除细胞两侧的质子梯度，从而解除电化学质子动力梯度的限制，使呼吸链能以最大速率运行，反映细胞的最大氧化磷酸化能力。③非线粒体呼吸是在用鱼藤酮（Rotenone）+抗霉素（Antimycin）处理后测量，鱼藤酮是复合物I的抑制剂，抗霉素A是复合物III的抑制剂，两种药物共同作用能够阻断线粒体的电子传递链，从而能够计算出由不依赖于线粒体活动的非线粒体呼吸耗氧，详见示意图）。

线粒体呼吸示意图

研究人员用依托莫西（Etomoxir，脂肪酸氧化抑制剂）（小编注：主要通过抑制肉碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）的活性来阻止长链脂酰CoA进入线粒体，从而抑制脂肪酸的氧化）处理分离的年轻和衰老小鼠肌纤维，发现依托莫西对衰老小鼠肌肉的OCR影响更大，表明衰老会使线粒体的底物偏好向脂肪酸氧化转变（图2J和2K）。为了探究MCU活性降低是否是导致衰老过程中线粒体功能障碍的原因，研究人员在年轻和衰老小鼠的骨骼肌中过表达了MCUR1，结果发现，MCUR1过表达对年轻小鼠肌肉的OCR没有影响，但MCUR1过表达逆转了衰老小鼠肌肉中线粒体呼吸的下降（图2L）。接下来，为了探究提高PDH活性是否也能提高年轻小鼠的代谢和运动表现，以及是否能挽救因遗传或衰老而导致的mtCa2+摄取障碍，研究人员用二氯乙酸（DCA）抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）的活性，阻止PDH被磷酸化，从而持续激活PDH（图2E）。结果发现，在年轻小鼠中，DCA处理后，PDH磷酸化显著降低，肌纤维呼吸增强（图2M，2N，2O），运动耐力显著提高（图2P）。并且DCA处理后，在skMCU−/−肌纤维中观察到OCR增加，底物的脂肪酸氧化依赖性显著降低（图S2D和S2 E）。在衰老小鼠中，DCA也降低了PDH的磷酸化（图2Q和2 R），基础呼吸和ATP依赖性呼吸增强（图2S和2T）。这些结果表明，在衰老过程中，MCU-PDH轴活性的降低与MCUR1有关，恢复PDH活性能够逆转因衰老期间mtCa2+摄取障碍引起的能量代谢缺陷。

图2. 衰老过程中受损的mtCa2+摄取通过PDH损害骨骼肌的能量代谢

图S2. 衰老小鼠体内钙稳态受损

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为了确定一种能够激活mtCa2+、逆转衰老的新型天然营养物质，研究人员对能够激活mtCa2+的天然分子进行了高通量（HT）筛选（图S3A和S3B）。研究人员以山奈酚作为阳性对照，分析了食物中存在的5571种天然分子在组胺刺激下对HeLa细胞mtCa2+摄取的影响（图3A，3B和S3C）（小编注：组胺是一种生物胺，可刺激多种类型的组胺受体。组胺能诱导钙离子摄取的增加）。经初步筛选，筛选出48个初始阳性结果（阳性命中率为1.4%（图3A和3B）），经过正交筛选（图3C），得到52个阳性结果，再将这52个阳性结果进行反筛选，以确定它们是否能够特异性地增加mtCa2+，而不会引发胞浆Ca2+的增加（图3D），进而筛选出43种特异性和可重复激活mtCa2+的分子，最终，研究人员确定橄榄苦苷为具有最佳生物活性和安全性、且能激活mtCa2+的分子（图3E）。接下来，研究人员在细胞实验中证明了橄榄苦苷是一种能够特异性激活mtCa2+（图3F和3G），并且不影响胞浆钙稳态（图3H）的Ca2+有效激活剂（图3F-H）。此外，研究人员用外源性Ca2+刺激半渗透化的Hela细胞（小编注：半渗透化的Hela细胞是指经过特殊处理后的HeLa细胞，其细胞膜部分通透，但仍保持细胞内的某些结构和功能），发现与对照组相比，橄榄苦苷能够显著增加半渗透化Hela细胞中mtCa2+摄取（图3I），这表明橄榄苦苷是直接影响MCU的活性，而不是间接调节细胞内Ca2+储存、释放或从内质网流入来刺激mtCa2+摄取（小编注：半渗透化的细胞，钙离子和橄榄苦苷可以直接通过细胞膜进入细胞，也就是说细胞质中Ca2+供应是充足的，若橄榄苦苷是间接调节mtCa2+摄取的话，橄榄苦苷刺激半渗透化的细胞理论上是不会改变mtCa2+水平的；但是橄榄苦苷刺激后mtCa2+的浓度显著增加，而mtCa2+的增加是由线粒体膜上MCU复合体调控的，可见橄榄苦苷是直接作用于MCU而非间接调控细胞内别的钙离子库）。近期有研究通过计算机模拟发现，调节mtCa2+摄取的分子可能与MICU1蛋白相互作用，于是，研究人员进行了表面等离子体共振（SPR）实验以直接检测橄榄苦苷与纯化的MICU1的体外结合（小编注：SPR的原理：SPR是借助传统光学现象，利用光在不同介质中产生消逝波后与等离子波产生共振，进而可以构建生物分子相互作用的生物传感分析技术，用以检测生物传感芯片上配位体与分析物之间的相互作用情况）， 结果显示，橄榄苦苷能以较低的摩尔剂量（Kd为4 ± 1 μM）与MICU1结合（图3J和S3D），说明橄榄苦苷与MICU1具有较强的亲和力，表明橄榄苦苷可通过MICU1直接调控MCU的活性。

由于橄榄苦苷是一种糖基化分子，在肠道吸收时可以代谢成为次级代谢物（小编注：糖基化分子是指将一个或多个糖分子通过糖苷键连接到非糖核心的复合物，一般来说糖基化合物进入肠道以后会被内部的糖苷酶快速识别并将其所带的糖分子分解代谢，从而形成次级代谢物）（图3K），研究人员检测了橄榄苦苷及其次级代谢物促进mtCa2+摄取的能力（图3L-3N）。结果发现，橄榄苦苷可剂量依赖性地激活mtCa2+摄取，EC50（半数效应浓度）为10μM（图3L）。并且，橄榄苦苷的次级代谢物也能够刺激mtCa2+摄取，其中橄榄苦苷苷元（oleuropein-a，以下称橄榄苦苷-a）是刺激mtCa2+摄取最有效的次级代谢物，EC50为5 μM（图3M），而次级代谢物羟基酪醇的效力较弱（图3N）。这些结果表明橄榄苦苷及其直接代谢产物是一种有效的mtCa2+摄取激活剂，具有良好的安全性和生物利用度。

图3. 高通量筛选鉴定天然多酚橄榄苦苷是mtCa2+摄取的有效激活剂

图S3.高通量筛选以及橄榄苦苷与MICU1的结合

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为了探究橄榄苦苷是否也能增强人类骨骼肌模型中的mtCa2+和能量代谢，探究其主要循环代谢产物橄榄苦苷-a如何在分子水平上影响肌细胞mtCa2+摄取，研究人员用橄榄苦苷-a处理从人骨骼肌分化而来的原代肌管细胞，发现用咖啡因刺激后橄榄苦苷-a能够有效地刺激原代肌管中的mtCa2+摄取（图4A），而不影响胞质Ca2+的增加（图S4A和S4B）。与在HeLa细胞中观察到的相似，橄榄苦苷-α比橄榄苦苷本体和下游代谢物羟基酪醇更能有效地提高人类肌肉细胞中的mtCa2+（图4B）。为了证明橄榄苦苷能够在多种模型中运用，研究人员用橄榄苦苷处理C2C12细胞，并使用基于荧光共振能量转移（FRET）的传感器4mtD3cpv检测荧光成像（图S4C和S4D），而后用KCl刺激细胞内钙释放（图S4E和S4F）（小编注：荧光共振能量转移（fluorescence resonanceenergy transfer，FRET）是指当一个荧光分子（称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（称为受体分子）的激发光谱相重叠，这两个荧光发色基团在足够靠近时（1-10nm），当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移），供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，FRET常用于检测蛋白质间的相互作用。推测在这里当线粒体内的钙离子浓度增加时，传感器的构象会发生变化，进而影响FRET信号的强度，研究人员可以通过检测FRET信号的变化来实时监测线粒体钙离子浓度的动态变化。KCl能够增加细胞内的钾离子浓度，导致细胞膜去极化，进而触发细胞内钙离子的释放），结果都证明了橄榄苦苷能够激活mtCa2+摄取，同时，研究人员还证明了橄榄苦苷对线粒体膜电位没有影响，说明mtCa2+的增加不是由于膜电位的变化而导致的（图S4G和S4H）。研究人员用腺相关病毒（AAV）敲低了人原代肌管细胞中的MCU（MCU-kd），发现用咖啡因诱导后mtCa2+摄取显著降低（图4C）。此外，MCU-kd完全抑制了橄榄苦苷刺激mtCa2+摄取的能力（图4D和4E），这表明橄榄苦苷刺激mtCa2+摄取需要MCU。

研究人员接下来使用由咖啡因刺激的MCU-kd和对照组人原代肌管细胞，并检测了其OCR变化，发现对照组中橄榄苦苷-a在咖啡因诱导的mtCa2+摄取期间使线粒体呼吸增加了67%（图4F-4H）；与mtCa2+相关的结果一致的是（图4E），MCU-kd完全消除了橄榄苦苷-a对线粒体呼吸的影响（图4G和4H），表明橄榄苦苷导致的线粒体代谢改变需要MCU和mtCa2+。同时，橄榄苦苷及其次级代谢物诱导的mtCa2+摄取增强不会导致原代人类肌管中的细胞大量死亡（图S5A）。

为了证明橄榄苦苷能够激活具有正常生理功能的肌纤维中的mtCa2+摄取，以及激活mtCa2+摄取后对骨骼肌的代谢影响，研究人员用橄榄苦苷处理了离体小鼠趾短屈肌（FDB）的肌纤维，结果显示，橄榄苦苷及其代谢产物增强了咖啡因诱导的线粒体Ca2+摄取（图4I、4 J、S5B和S5 C）和线粒体呼吸（图4K）。为了确定橄榄苦苷对骨骼肌性能的影响，研究人员测量了肌肉力量和疲劳，发现橄榄苦苷不会损害肌肉力量的产生（图S6）。同时，与未经过处理的对照组相比，橄榄苦苷处理的肌纤维可以在反复收缩过程中更好地维持高强度的力量，表明橄榄苦苷能够降低运动期间的疲劳（图4L）。总之，这些结果表明，在不同的骨骼肌模型中，橄榄苦苷都能增强线粒体的能量代谢，提高肌肉收缩过程中的抗疲劳能力。

为了探究橄榄苦苷如何在分子水平上激活MCU复合物，研究人员对MCU亚基的晶体结构进行了计算机对接模拟，通过分子对接和动力学分享，研究人员鉴定出橄榄苦苷和橄榄苦苷-a都可以稳定结合于人类MICU1的一个裂隙（图4M和4N），最近有研究称该裂隙是一个配体结合口袋。橄榄苦苷和橄榄苦苷-a在MICU1结合位点的方向相似，羟基酪醇基团与MICU1的Glu311结合，烯醇基团则与MICU1的N端叶（216-220）和C端叶（环441-443）结合（图S7）。

研究人员通过使用敲除了MICU1基因的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），在Ca2+刺激的半渗透化细胞中测量mtCa2+摄取量，与前文其他模型类似，橄榄苦苷能有效促进野生型（WT）细胞的mtCa2+摄取，但橄榄苦苷的作用在MICU1 KO细胞中被削弱（图4P和4Q）。

这些细胞和计算机模拟实验都证明了橄榄苦苷是通过一种依赖于MCU的机制激活了对mtCa2+的吸收，而这种机制依赖于与MICU1的直接结合（图4O）。分子对接分析表明，橄榄苦苷和MICU1之间的关键相互作用之一是与MICU1的E311侧链形成氢键，该侧链深深地插入被配体占据的MICU1的亚口袋中。为了验证橄榄苦苷的结合模式，研究人员将E311突变为E311A（谷氨酸突变为丙氨酸），在不产生空间位阻的情况下消除了氢键（图4M和4N）（小编注：谷氨酸形成的氢键是非常强的，它的侧链含有一个羧基（-COOH），既可以作为氢键供体也可以作为氢键受体；丙氨酸是结构较为简单的氨基酸之一，它的侧链是甲基（-CH3），甲基具有极高的非极性和疏水性，它不具有活跃的氢或者可以接受氢的孤对电子，故而很难形成氢键）；在MICU1 KO细胞中，重新引入WT MICU1可恢复橄榄苦苷诱导的mtCa2+摄取（图4R），而引入MICU1 E311A突变体，则橄榄苦苷不能诱导mtCa2+摄取。为了证明与MICU1 E311结合是橄榄苦苷刺激mtCa2+摄取的关键，研究人员采用了平行突变的方法，在MICU1的预测橄榄苦苷结合位点产生空间位阻，即将MICU1的L308和Y334残基突变为L308 W和Y334 W以封闭配体结合口袋，结果显示，引入L308 W/Y334 W突变不能恢复MICU1 KO细胞中橄榄苦苷对激活mtCa2+摄取的响应（图4R）。此外，在不存在橄榄苦苷的情况下，这些突变均不影响mtCa2+的摄取（图4Q和4R）。以上使用2种独立诱变的实验结果证明了橄榄苦苷是通过直接与MICU1结合从而激活MCU来促进mtCa²⁺摄取。

图4. 橄榄苦苷通过MICU1调控的mtCa2+摄取激活线粒体能量代谢

图S4. 橄榄苦苷-a增加mtCa2+摄取但不影响胞浆Ca2+水平及线粒体膜电位（Mmp）

图S5. 橄榄苦苷-a增加肌纤维中的mtCa2+摄取但不影响人原代肌管细胞的死亡

图S6. 橄榄苦苷不会损害肌肉力量的产生

图S7. 橄榄苦苷-a和橄榄苦苷与MICU1的结合模式

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为了确定橄榄苦苷对机体能量代谢和肌肉性能的影响，研究人员通过给年轻小鼠口服富含橄榄苦苷的橄榄叶提取物（OLE），发现单次口服OLE能够急性增加小鼠肌纤维中mtCa2+的摄取（图5A和5 B）。在口服OLE后2-8小时内，OLE能够诱导骨骼肌中PDH的持续去磷酸化并且增强其活性（图5C和S8A）。在急性OLE摄入后，骨骼肌中PDH活性增加了44%（图5D）。PDH是丙酮酸氧化和线粒体氧化代谢的限速因子，与PDH活化一致，口服OLE使小鼠肌纤维中的耗氧量增加（图S8B）。成年小鼠长期口服OLE一个月后，小鼠肌纤维中mtCa2+摄取持续增加（图5E和5F），PDH磷酸化水平降低、活性增强（图5G、图5H、S8C，线粒体呼吸增强（图5I），但不影响线粒体DNA含量（图S8D），表明小鼠肌纤维中PDH活性和线粒体呼吸的增强不是由线粒体密度的变化导致的。

接下来，研究人员测量了对照组和OLE处理一个月后的年轻小鼠的腓肠肌肌肉质量，发现OLE饮食不会影响肌肉质量（图S8E）。与用橄榄苦苷处理分离的肌纤维结果一致（图4L），在电刺激肌肉力量测定中，口服OLE能够提高肌肉的抗疲劳能力，从而增强肌肉性能（图5J）。此外，口服OLE增强了小鼠跑步机耐力测试中的运动表现（图5K）。为了探究OLE对线粒体生物能和肌肉性能的影响是否由MCU介导，研究人员给MCU缺失的小鼠（skMCU−/−）长期口服OLE，结果显示，OLE对skMCU−/−小鼠的OCR、跑步机性能和PDH磷酸化没有影响（图5N、5O和S8G）。这些结果表明，MCU是OLE诱导的mtCa2+的摄取增强、急性或慢性激活PDH、增强线粒体呼吸和运动能力的核心靶点。

图5. 急性和慢性口服橄榄苦苷通过MCU增强肌肉能量代谢和性能

图S8.年轻成年小鼠长期口服OLE表型

上文的研究表明，在衰老和肌少症中，MCUR1下调会导致mtCa2+摄取和代谢下降（图1A-1J），因此，为了探究MICU1结合橄榄苦苷是否能逆转这一过程，研究人员用橄榄苦苷处理MCUR1 kd的人原代肌管细胞，结果显示，橄榄苦苷可以有效地刺激MCUR1 kd的人原代肌管中的mtCa2+摄取（图1K、6A和6B），即橄榄苦苷对mtCa2+摄取的促进作用大于因MCUR1下调而导致的肌肉MCU活性受损。同时，橄榄苦苷还逆转了来自老年人供体的原代肌管细胞中mtCa2+摄取的下降（图6C和6D）。由于在人类衰老过程中发生的MCUR1和mtCa2+的摄取下降与小鼠模型中是一致的（图2A-2G），研究人员进一步使用了线粒体功能障碍的少肌症大鼠模型和衰老小鼠模型进行体内研究。在少肌症大鼠模型中，用OLE长期喂食大鼠三个月后，PDH磷酸化降低了60%（图6E-6G），线粒体氧化代谢增强。在线粒体活性和跑步表现下降的小鼠衰老模型中，长期喂食OLE增强了衰老肌纤维的线粒体呼吸（图6H），运动能力和肌肉质量显著恢复（图6I），但线粒体DNA含量无显著变化（图6K），这与在年轻小鼠的观察结果一致（图S8D）。但与年轻小鼠不同的是，OLE增加了衰老小鼠的肌肉质量，对年轻小鼠的肌肉质量没有影响（图6J，图S8E）。此外，在小鼠骨骼肌MCU存在条件下，长期喂食OLE能够显著降低骨骼肌PDH磷酸化水平（图S8F）；而当特异性敲除骨骼肌MCU后，长期喂食OLE不改变骨骼肌PDH磷酸化水平（图S8G）；表明OLE对糖酵解的改善过程依赖MCU。这些结果表明，橄榄苦苷可逆转衰老期间MCUR1的下调，以恢复MCU活性，并改善了跨物种的衰老骨骼肌的代谢和功能损伤（图6L和S9）。

图6. 橄榄苦苷可逆转跨物种年龄相关的mtCa²⁺摄取、能量代谢和肌肉性能的下降

图S9. 橄榄苦苷对年轻MCU-KO小鼠作用模型

 总结   

线粒体功能下降是衰老的标志之一，对全身的生理衰退和慢性疾病的发展有直接作用。骨骼肌作为高能量需求的组织，对线粒体的依赖极高。但随着衰老，线粒体能量产生能力下降，肌肉力量会逐渐减弱、质量降低，最终形成肌少症。目前的抗衰老干预多是间接作用，如补充营养和增强自噬，缺乏能够直接增强线粒体ATP产生能力的手段。钙离子调控是线粒体氧化代谢和肌肉收缩的桥梁，钙离子通过线粒体钙单向转运体（MCU）进入线粒体，激活代谢酶驱动ATP合成。衰老导致MCU的关键组分MCUR1表达下降，使线粒体钙离子摄取受限，能量代谢和肌肉性能进一步下降。线粒体钙离子摄取与骨骼肌健康密切相关，但其在肌肉衰退和肌肉老化相关疾病中的具体作用尚未完全阐明。

本篇文章讨论橄榄苦苷在衰老和肌少症中激活mtCa2+摄取的作用。在衰老状态下和肌少症中，人类骨骼肌表现为MCUR1下调，mtCa2+摄取能力下降，进而影响肌肉代谢和功能。橄榄苦苷能够与MICU1特异性结合，激活MCU复合体，刺激mtCa²⁺摄取，逆转MCUR1下调导致的mtCa2+摄取障碍，显著提升线粒体呼吸、改善线粒体功能和能量代谢，改善运动表现和抗疲劳能力，表现出潜在的抗衰老治疗前景。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124004170?via%3Dihub#bib15

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