季节性开花的兰花产生腋生花分生组织，在寒冷的条件下需要休眠期才能开花。然而，芽激活机制仍然难以捉摸，该研究评估了墨花发育六个阶段的多组学，以及核心基因的功能分析，以破译中国墨兰花芽萌生和生长的机制。
广东省农科院在《Horticulture Research》期刊发布题为"Integrated proteomic, transcriptomic and metabolomic profiling reveals that GA-ABA hub runs the flower development in Chinese orchid Cymbidium sinense"的文章，通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，揭示了中国墨兰花芽形成和生长的内在机制。
In Brief
•鉴定了 35551 个转录本和 7245 个蛋白质，其中有 6977 个共存于转录组和蛋白质组的基因；
•赤霉素和脱落酸信号是兰花发育的关键因素；
•GA促进墨兰花发育，ABA抑制墨兰花发育等。
研究背景
花的发育是一个复杂的过程，由多种内在和外在因素调节，植物激素在花的过渡和持续发育中起着不可或缺的作用，赤霉素 （GA） 显着影响开花过程，GA 和 ABA 在植物发育过程中起拮抗作用。芽休眠的释放与 ABA 水平的降低呈正相关，外源性 ABA 应用会导致开花时间波动，表明 ABA 可能是影响开花过渡的内部因素，然而，ABA 也起抑制作用。例如，ABI4 （ABA-INSENSITIVE 4） 是 ABA 信号通路的关键组成部分，通过拟南芥中的 FLC 激活负向控制花的转变。ABA 的这些矛盾反应可能受到许多变量的影响，如生长条件、光周期敏感性、ABA 浓度以及涉及开花途径和 ABA 串扰的物种特异性效应子。此外，为什么花蕾不能连续生长，需要休眠暂停才能继续生长和开花，一直是兰花中未解之谜。因此，理解调节花芽休眠期间生理事件和控制开花时间的机制至关重要。
技术手段
实验材料：从花发育的六个阶段 FD0-FD5 的样品；
实验方法：转录组学、蛋白质组学、非靶向代谢组学
主要结果转录组和蛋白质组
分别鉴定了 35551 个转录本和 7245 个蛋白质， 6977 个存在于转录组和蛋白质组的基因。利用蛋白质组和转录组的数据针对墨兰的不同发育阶段(0-5)探索基因在转录和翻译水平上的潜在关系。采用‘ward.D’方法对基因表达水平进行二维聚类分析。这些蛋白质或转录物被分为六类。在前三个簇（1-3）中，基因主要在花发育的早期上调，在花发育的晚期下调。相反，簇4-6中的基因在花发育的早期表现出普遍的下调趋势，在花发育的晚期表现出上调趋势。此外发现基因表达趋势主要与蛋白质浓度相关。显著富集的GO生物过程类别包括RNA剪接、mRNA加工、一元羧酸分解代谢过程、一元羧酸代谢过程、一元羧酸生物合成过程和细胞质翻译。显著富集的KEGG途径包括剪接体（pda03040）、次级代谢物的生物合成（pda01110）、碳代谢（pda01200）和核糖体（pda03040）。
图 蛋白质组和转录组数据比较分析
发现阶段特异性的基因和蛋白质
作者比较花发育阶段的上调和下调转录物和蛋白质，发现在转录组数据中，花发育阶段0（FD0）到FD3为显著上调趋势，FD4到FD5为显著下调趋势。而在蛋白组中，（FD0和FD1）显示更多下调的蛋白质，FD2显示显著上调的蛋白质。这表明在基因表达水平和蛋白质浓度方面存在明显差异。作者确定了蛋白质与转录本相关且高表达的10个蛋白以分析其在个体发育阶段的区别，发现表明Hd3a在早期花发育中的重要作用，HDT2在FD2中的顶端分生组织中具有重要作用，FD3中高表达的基因主要涉及能量产生系统，如ATP合成酶、RCA、PSBS和CAB 36，以及类黄酮途径酶，如CHS1、FLS和PAL，这与阶段FD3的快速生长和花青素苷的合成相吻合，等。
图(A)上调和下调转录本的总数，(B)上调和下调蛋白总数，(C)对应蛋白浓度的前10个高度显著转录本
WGCNA分析墨兰花发育的核心调控因子
选择于有高表达和高连接性的与蛋白组相对应的基因做WGCNA分析，共筛选出12个基因，这些基因在早期表达上调，在晚期表达下调，主要与激素和开花时间调控相关，其中发现生长调节因子（GRF 1）相互作用因子沿着生长素（PIN 3A）、细胞分裂素（CISZOG1）和赤霉素（KA0 1）调节剂在FD 5中特异性表达，随后是FD 4和FD 3。
图(A) 78个潜在转录本及其相应的蛋白质浓度概述，(B)基于WGCNA分析的转录本基因相互作用网络
代谢组分析
代谢组鉴定出69种与主要植物激素相关的潜在化学物质，其中细胞分裂素类最多（26种），其次是生长素类（20种）、GA类（9种）和茉莉酸类（8种）。细胞分裂素活性主要集中在花发育中期（S1-S3）。然而生长素并没有表现出明确的模式之间的六个阶段的变化。且GAs在花发育的早期和晚期保持了明显的浓度梯度。大多数活性GA在休眠解除后的后期表现出高浓度，而只有两种非活性GA在花发育的休眠早期表现出高浓度。ABA含量在休眠期较高，后期维持较低水平。
图 代谢组的主要植物激素，使用UHLC进行分析，共鉴定出69种与代谢物相关的代谢物
GA和ABA是墨兰花发育的关键因子
作者分离了与蛋白组和转录组关联分析相关的20种GA和ABA的潜在调节物，发现在墨兰花发育的早期阶段，GA和ABA的转录水平和蛋白浓度是相反的，这表明它们在芽休眠和解除有重要作用，在花发育的早期阶段，仅GA2ox基因的蛋白质浓度高，而大多数其它蛋白质在后期阶段显示高表达，代谢组数据还证实在花发育的后期阶段期间除了在早期阶段期间的一些无活性GA外，大部分GA为高含量。
图 基于多组学的主要赤霉素和途径中酶的概况
作者鉴定了14个与GA、生长素、糖、细胞周期和阿坝相关的枢纽基因，发现GA调节基因（GASA 1）位于连接由生长素、细胞分裂素、糖和开花时间调节基因形成的子网络的中心。
图 基于WGCNA的GA和ABA相关性分析以及枢纽基因的鉴定
作者对墨兰施用外源GA发现其显著促进了芽和花序轴的伸长，也显著增加了花发育相关基因（CsSTK 和 CsAG）、GA 生物合成 （CsGA2ox2、 CsGA2ox8） 和信号转导 （CsSCL8） 基因以及生长素途径基因（CsAUX、ARFs 和 CsbZIPs）的表达，而潜在的负调节因子 CsCKX （细胞分裂素氧化酶/脱氢酶） 和 CsTCP14表达显著降低。
图 施用外源GA对花发育和开花途径基因的影响
ABA抑制墨兰花发育
施用外源ABA后抑制了芽的生长，而喷施ABA抑制剂后，花枝伸长显著提前，达到37.37
± 3.15cm，开花时间显著缩短（76.50 ± 7.55 天），持续开花寿命显著延长（30.50 ± 4.12
天）。为了了解ABA在花芽发育中的调控作用，作者对ABA及其抑制剂处理前后的花芽做了转录组分析，发现CsAP1 及其与花发育和/或激素信号相关的共表达基因具有最显著的差异表达变化，对CsAP1进行功能预测发现，其具有潜在的ABA 反应元件 （ABRE） 位于 ATG（终止密码子）上游 2000 bp 处，施用外源ABA处理花芽后，发现CsAP1的表达水平在处理后 4 h 首次下降，5 h 后观察到显著增加，然后在 12 h 后再次下降。CsAP1 的亚细胞定位分析表明膜和细胞核中有明亮的信号
图 ABA 和 AP1 对花芽萌生和发育调节的关系
作者在拟南芥过表达CsAP1，发现CsAP1可影响花器官形态和花序结构，因而作者确定了开花和花发育相关基因的几个关键调节因子的表达，并发现它们的表达显著增加。为进一步验证CsAP1作者在墨兰原生质体中瞬时过量表达了CsAP 1，并观察到其表达显著增高，且发现CsAP1在墨兰中过表达可诱导下游开花相关基因SEP1、SEP4、AGL6、AP3-2、AP3-3和AP3-4的表达，其转录组数据也支持了CsAP1与ABA间的相互关系，从大量的花和激素调节因子来看，在花发育的不同阶段，CsAP1的表达与GA一致，而与ABA相反。
因而作者提出ABA信号通路介导的花发育分子调控模型：在正常情况下，ABA可以通过其应答元件ABRE对抗CsAP1的作用，最终影响ABCDE模型中花同源基因（包括SEPs、AGL6和AP3s）的功能, 而ABA抑制剂则能释放ABA的抑制作用，打破墨兰花芽的半内休眠状态。
研究结论
总而言之，该研究通过多组学方法对中国墨兰花发育的6个阶段进行了研究，沿着核心基因的功能分析，提出了ABA信号通路介导的花发育分子调控模型，揭示中国兰花花芽发生和生长的内在机制。
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