高原脑水肿 （HACE） 被认为是一种终末期急性高山病 （AMS），通常发生在快速上升到 2500 米及以上的人身上。虽然缺氧是 HACE 病理生理机制的基本特征，但新出现的证据表明，炎症是该疾病发生和发展的关键危险因素。然而人们对它们串扰的分子机制知之甚少。
中国医学科学院基础医学研究所在《Cell Communication and Signaling》期刊发布题为"Global profiling of protein lactylation in microglia in experimental high-altitude cerebral edema"的文章，通过乳酸化蛋白质组学分析揭示了小胶质细胞中蛋白质乳酸化的全面概况，并发现蛋白赖氨酸乳酸化在缺氧条件下参与炎症反应。
•缺氧以乳酸依赖方式增加LPS诱导的小胶质细胞神经炎症反应
•共鉴定到2253种蛋白质的8200个乳酸位点
•广泛的乳酸化修饰位点可能在基因表达调控中发挥重要作用
•乳酸化优先发生在这些蛋白质复合物中，NuRD复合物乳酸化参与增加缺氧条件下的炎症反应等
研究背景
高原脑水肿（HACE）是一种严重的高海拔疾病，其特征是头痛、共济失调、疲劳和精神状态改变，是由于高原地区空气稀薄，导致脑部缺氧，从而引起的脑细胞损伤，导致脑水肿，若没有及时的诊断或治疗，可能导致昏迷和死亡。HACE被认为是终末期急性高原病（AMS），越来越多的研究表明炎症在HACE发病机制中发挥着关键作用。作者先前的研究表明脂多糖（LPS）诱导的全身炎症反应在急性低压缺氧暴露后迅速加重脑水肿，并最终损害神经功能，然而，缺氧加剧LPS诱导的炎症反应的确切机制仍不清楚。
越来越多的证据表明，乳酸化在炎症反应、神经活动和癌症进展中充当新型信号分子，有报道发现组蛋白的乳酸化可以直接驱动基因转录并影响小胶质细胞活化，缺氧诱导小胶质细胞中大量的乳酸化，并在视网膜新生血管形成中起关键作用，因此作者认为在缺氧期间检查体内乳酸化模式并探索乳酸化蛋白在神经炎症反应中的作用是重要的。
在该研究中，作者首先检测了缺氧和乳酸对小胶质细胞神经炎症反应的影响，并探讨了缺氧对小胶质细胞内乳酸化修饰的诱导作用，然后进行了全蛋白质组学的乳酸化分析。此外还研究了乳酸化对蛋白质结构的影响。
技术手段
实验材料：BV-2小胶质细胞
实验方法：蛋白质组学、WB、qRT-PCR
主要结果
缺氧以乳酸依赖方式增加LPS诱导的小胶质细胞神经炎症反应
作者构建了HACE小鼠模型，并通过磁性细胞分离分离原代CD 11b+小胶质细胞，检测其体内乳酸和乳酸化水平的变化，发现低压缺氧或LPS处理增加了海马区的乳酸浓度，WB、免疫荧光染色及培养的细胞模型均表明在体内和体外缺氧可增加乳酸含量和蛋白质的乳酸化。为了探讨蛋白质乳酸化与HACE进展之间的潜在相关性，检测了皮质组织中泛乳酸化蛋白和HACE蛋白标志物的表达，发现在小鼠HACE模型中，蛋白质乳酸化与水肿进展之间存在一定的相关性。随后通过敲低催化丙酮酸产生乳酸的酶LDHA，发现LPS/低氧诱导的细胞因子表达，q-PCR及WB的结果也表明，乳酸在缺氧条件下的神经炎症反应中起着重要作用。
缺氧使乳酸浓度升高，促进乳酸化
缺氧和乳酸加重小胶质细胞介导的神经炎症
赖氨酸-乳酸化位点和蛋白质的鉴定和分析
为了全面阐明缺氧诱导的蛋白质乳酸化，作者对BV-2细胞中进行了全蛋白质组的乳酸化分析。共鉴定到2253种蛋白质的8200个乳酸位点，与对照组相比，LPS和缺氧处理组的乳酸化位点数分别增加了52和820个。与LPS组相比，LPS/缺氧组中有702个上调的乳酰化位点。LPS/缺氧组和LPS组之间以及缺氧组和对照组之间的差异性乳酸化位点的重叠显示474个赖氨酸位点被乳酸化。这些结果表明，缺氧可诱导大量的乳酸化。
BV-2细胞中乳酸化蛋白的蛋白质组学分析
乳酸化位点分析
由于缺氧可增加LPS刺激诱导的神经炎症反应，因此对LPS/缺氧组和LPS组之间不同的乳酸化位点进行全面分析。在乳酰化蛋白质中，71%含有单个乳酰位点，14%含有两个乳酰位点，并且百分比随着每个蛋白质的乳酰位点数目的增加而降低。为了了解乳酰化位点的分布模式，评估了-10至+10乳酰化赖氨酸位点侧翼氨基酸的存在。热图结果显示，Kla周围的某些氨基酸残基强烈富集。赖氨酸残基在− 10至-2、+1、+3和+5至+10位置富集。乳酰化蛋白大部分分布在细胞核内，这与上述免疫荧光染色结果一致，GO功能富集的细胞组分分析显示，最富集的乳酸化蛋白质富集在NuRD复合物中；结构域分析显示乳酸化赖氨酸位点主要位于锌指结构域，这是转录调节因子的一个显著特征，与之一致，KEGG途径富集分析显示，与基础转录因子相关的乳酸化蛋白首先富集。这些数据表明，乳酸化蛋白可能在基因转录中起重要作用。
乳酸化肽和蛋白质的生信分析
蛋白质复合物的乳酸化
为了更好地理解由乳酸化调节的细胞过程，使用Cytoscape软件组装鉴定的乳酸化蛋白质的PPI网络，发现一些蛋白质复合物，如NuRD复合物，核糖体生物合成复合物，剪接体复合物和DNA复制复合物，经历了乳酸化，表明乳酸化优先发生在这些蛋白质复合物中。在乳酰化蛋白质复合物中，NuRD复合物是一种众所周知的转录调节复合物。进一步的修饰位点分析显示，在NuRD复合物的核心成员中，HDAC 1、MTA 1、MTA 3、MTA 2、MBD 2、MBD 3、Chd 4、Gatad 2 α、Ncor1、Ncor2和Sin3A均发生了乳酰化，共嵌入了62个乳酰化位点。这些结果表明，这种广泛的乳酸化修饰位点可能在基因表达调控中发挥重要作用。
蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络分析
为了测试乳酰化是否影响蛋白质结构，作者对HDAC 1的乳酰化修饰前后的3-D构象建模。结果表明，低氧诱导的乳酸化可以影响蛋白质的结构，并参与蛋白质功能的调节。为了测试蛋白质乳酸化是否影响HDAC 1功能，作者用20 mM乳酸盐处理细胞不同的时间段，发现尽管组蛋白H3的全乳酸化保持不变，但特定位点修饰，如Lys 9/Lys 14增加，表明HDAC 1活性被外源性乳酸盐处理抑制。为了测试HDAC 1脱乳酸酶活性是否有助于细胞因子表达，使用HDAC 1选择性抑制剂TSA，结果HDAC 1的抑制增加了细胞因子的表达。利用RNA干扰技术，作者进一步证实了NuRD复合物成员对神经炎症反应的贡献，HDAC 1、MTA或Gata 2b的敲低增加了TNF-α和IL-1β的表达，表明这些蛋白质在神经炎症反应中起重要作用，因此NuRD复合物乳酸化参与增加缺氧条件下的炎症反应。
乳酸化对NuRD复合物的影响
主要结果
总而言之，作者基于小鼠HACE模型，发现缺氧处理增加了纯化的小胶质细胞中的乳酸含量和蛋白质乳酸化。小胶质细胞的蛋白质乳酰化的整体分析发现，大量赖氨酸-乳酸化蛋白是由缺氧诱导的，并优先出现在蛋白质复合物中，如 NuRD 复合物、核糖体生物合成复合物、剪接体复合物和 DNA 复制复合物等。进一步的分析发现敲低或选择性抑制的实验进一步分析表明，NuRD 复合物参与缺氧介导的炎症加重，这些发现将提供新的见解缺氧诱导的神经炎症加重的分子机制。
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