乳腺癌是全球最常见的癌症之一，占女性癌症的30%，乳腺癌远处转移是导致患者死亡的主要原因，乳腺癌患者转移状态的早期检测和动态评估对于治疗和治疗后癌症演变的纵向分析具有重要价值。为了实现这一目标，与传统的肿瘤组织活检相比，利用在患者血液中检测到的分子分类器（如细胞外囊泡 （EV）的液体活检具有最小的侵入性、更少的并发症和更高的纵向监测能力 。
复旦大学在《Cancer
Research》期刊发布题为"Proteomic Profiling of Serum Extracellular Vesicles
Identifies Diagnostic Signatures and Therapeutic Targets in Breast
Cancer"的文章，通过血清细胞外囊泡的蛋白质组学分析确定了诊断原发性和转移性肿瘤的特征，并发现了可靶向改善促进肿瘤进展的抑制剂。
研究背景
细胞外囊泡 （EV）大小为 30 至 200 nm，携带一组受限的核酸、脂质和蛋白质，这些核酸、脂质和蛋白质有助于正常生理和病理学中的细胞间通讯。EV 的分析是一种很有前途的无创液体活检方法，可用于乳腺癌检测、预后和治疗监测。越来越多的证据表明，EV 会主动从癌细胞中释放出来，并促进癌症的生长和转移。EV 的膜封装特性促进了其结构完整性，并且位于 EV 内的物质比其他血清学蛋白更稳定，因为它可以防止被蛋白酶和其他酶降解。考虑到它们易于检索以及它们在血清中相对普遍的存在和丰度，EV 可作为一种有前途的无创液体活检方法，为乳腺癌检测、预后和治疗监测的下游分析提供充足的材料。
技术手段
实验材料：126份乳腺癌患者（BC）和70份健康供体（HD）的人血清EV等
实验方法：DIA、WB、细胞侵袭和细胞迁移、靶向代谢等
主要结果
从 196 个血清EV样品中共鉴定了 9699 个蛋白质
使用无标记 LC-MS/MS 分析构建血清 EV 的蛋白质组学数据库，从 196 个分析样品中总共鉴定了 9,699 个蛋白质，为了映射先前报道的 EV 蛋白，作者利用其EV 蛋白数据集与公开可用的 EV 蛋白质组数据库 Vesiclepedia进行交叉引用，分析表明，其鉴定到的蛋白90%与细胞外功能相关，且Vesiclepedia 的前 100 种 EV 相关蛋白中，99% 是在这项研究中鉴定出来的，表面了数据的可靠性。
经GO的细胞组成分（CC）析以探索蛋白质的位置，发现从 EV 中鉴定的蛋白质强烈富集于以下细胞成分 （CC）：细胞质 （n = 3,012;P = 5.33E-130），质膜 （n = 2,225;P = 4.34E-4） 和细胞外外泌体 （n = 1,816;P = 0），进一步证实了EV 的 高效隔离，此外，其他研究也发现细胞质、膜和细胞外外泌体在GO的CC中显著富集，且均＞1000个蛋白质。
图 EV 的蛋白质组学特征概述
乳腺癌衍生的 EV 表现出与免疫反应、代谢和转移相关的特异性特征
作者在乳腺癌和 HD 样本中分别鉴定出 1,463 和 485 个独特的 EV 蛋白，对其数据进行分析，以确定乳腺癌衍生的 EV 的特征，确定了 1,130 种蛋白质在乳腺癌和 HD 样本之间显著差异富集（FC＞2or＜0.5，p值＜0.05），聚类分析及DAVID通路富集分析表明这些差异富集的蛋白质参与独特的生物过程和通路，在HD-EV样本中显著富集的通路有蛋白水解 、受体介导的内吞作用、吞噬作用,识别 和囊泡介导的转运；BC-EV样本中显著富集的通路有免疫反应、代谢和转移相关。这些发现表明 BC-EV 和 HD-EV 蛋白是不同的，乳腺癌细胞释放的 EVs 可能携带更多封装的物质进行信号传递，以诱导受体细胞的恶性转化，这可能反映了 EV 在乳腺癌肿瘤发生和进展过程中的功能作用和分子异质性。
图 BC和 HD 衍生的 EV 的蛋白质组学特征
发现可区分乳腺癌与其他癌症的关键蛋白
为进一步评估 EV 蛋白质组学信息是否可以用作区分癌症和非癌症的液体诊断的数据，作者利用 XGBoost 分类器以区分BC和HD血清EV蛋白的不同亚群，通过比较BC和HD来源的EV蛋白质组，作者发现7种特征蛋白（IGHV3-23、MMP9、AHNAK、PAICS、VWF、ANGPTL6和 PSME1），经进一步训练及测试验证表明，这七个蛋白对乳腺癌具有特异性，且不是诊断其他癌症的广谱分类器（如肺癌、肝癌、食管癌、胃癌）。
图 源自乳腺癌四种临床亚型的 EV 的蛋白质组学特征
为了区分乳腺癌不同临床亚型（管腔A、管腔B、HER2富集和 TNB）间的蛋白质组学景观，作者分析了队列中的管腔 A （n = 20）、管腔 B （n = 50）、Her2 富集 （n = 21） 和 TNBC （n = 23） 的 EV 样本，主成分分析表明不同分子亚型之间存在明显差异，这进一步突出了乳腺癌样本临床亚型之间的独特蛋白质组学模式。作者发现12种蛋白（TTYH3、KPNB1、RANBP2、PEPD、NCL、PARP1、ACTA2、ACTG2、TBCA、MATR3、KRT16 和 CCT6A）在区分 BC-LN+ 和BC-LN−具有很好的灵敏度和特异性。
图 乳腺癌远处转移的潜在 EV 生存生物标志物
发现乳腺癌远处转移的潜在生存标志物：TALDO1
作者还将乳腺癌患者的血清 EV 蛋白质组谱与乳腺癌组织蛋白质组谱进行了比较，并推断出理想的生物标志物应在相应的肿瘤组织中过表达并释放到血液中，通过分析发现乳腺癌队列中的 24 种 EV 蛋白，发现 10 种 EV 蛋白（FLNA、VTN、PKM、PDHB、G6PD、TALDO1、LDHB、ACACA、C7 和 F2）在乳腺癌组织中高表达，并与不良预后相关，其中，四种 EV 蛋白 （TALDO1 、 FLNA 、 VTN 和 C7） 是乳腺癌远处转移的潜在特异性生物标志物，且与 HD、DCIS、BC-LN− 和 BC-LN+ 相比，TALDO1 在远处转移乳腺癌患者血清 EV 中显著上调。为进一步验证 TALDO1 是否与乳腺癌远处转移相关，作者比较了 TALDO1 在正常 （n = 36）、原发组织 （n = 36） 和远处转移组织中 （n = 16） 的表达，结果表明与远处转移组织相比， TALDO1在正常组织和原发组织表现出的不显著强度或低强度，这表明TALDO1 可能是乳腺癌远处转移的新型生物标志物。为了验证EV-TALDO1可作为乳腺癌远处转移的特异性标志物，作者又于其它54种癌症类型的队列中进行验证，结果显示，转移性食管癌和非转移性食管癌、转移性肝癌和非转移性肝癌、转移性肺癌和非转移性癌症以及转移性胃癌和非转移性胃癌之间 EV-TALDO1 的表达水平无显著差异。这些结果表明，EV-TALDO1 是乳腺癌远处转移的潜在生存标志物。
为了测试TALDO1确实具有促进乳腺癌转移的作用，作者使用TALDO1表达水平差异的人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231进行功能分析，MCF7稳定表达TALDO1，MDA-MB-231敲低TALDO1的表达，免疫印迹分析显示，敲低TALDO1可显著提高 MDA-MB-231 细胞中 E-钙粘蛋白的表达，降低 N-钙粘蛋白和 Snail1 的表达。相反，过表达 TALDO1 显著降低 MCF7 细胞中 E-钙粘蛋白的表达，增加 N-钙粘蛋白和 Snail1 的表达。因而，高TALDO1表达可以促进乳腺癌细胞上皮-间充质转化。细胞迁移和侵袭测定实验及细胞划痕实验显示，TALDO1的敲低显著降低了TALDO1高表达MDA-MB-231细胞的侵袭能力，TALDO1的过表达显著增加了 MCF7 细胞的侵袭能力和迁移能力等。这些western blotting检测TALDO1在ev中的表达，发现MDA-MB-231细胞的EV中TALDO1的表达高于MCF7和正常细胞MCF10A，细胞迁移实验显示，补充富含TALDO1的EV显著提高了TALDO1缺失细胞和野生型MDA-MB231细胞的迁移能力，这些数据表明TALDO1在乳腺癌的侵袭和迁移中起着关键作用。作者还将将稳定转染TALDO1 shRNA或对照载体的PY8119细胞和4T1细胞皮下注射到裸鼠和BALB/c小鼠体内，结果表明敲低TALDO1可有效抑制乳腺癌的生长和进展。作者开发了乳腺癌异种移植模型也进一步表明了 EV-TALDO1 在乳腺癌进展中起关键作用。
图 TALDO1 是乳腺癌远处转移的生物标志物
发现一种用于治疗乳腺癌的有效 TALDO1 抑制剂
AO-022基于
TALDO1 在乳腺癌中的转移促进作用，作者想知道靶向 TALDO1 是否在治疗上有益。为此，作者应用了高通量分子对接技术和由 271,380
个小分子组成的文库（Specs 文库）来鉴定可能在功能上抑制 TALDO1 的小分子化合物，根据对接结果，作者选择了前 10
个化合物进行进一步表征，已知小分子与蛋白质的结合会增加其热稳定性，这反映在蛋白质熔解温度的可检测升高（或“偏移”）上，因此作者使用重组
TALDO1 在热位移测定中评估了 TALDO1 和化合物的相互作用。在这 10 种化合物中，AO-022将 TALDO1 的熔解温度从
42°C 提高到 47°C，表明 AO-022 在体外结合并稳定 TADLO1。使用细胞热转移测定进一步评估 AO-022 和 TALDO1
的直接结合也证实了 TALDO1 和 AO-022 在体外的相互作用。分子对接结果证明，AO-022 和 TALDO1 在 Glu77 和
Asp108 处产生了两个氢键。WB、细胞迁移及侵袭能力试验结果也表明 AO-022
有效抑制乳腺癌进展和迁移。经分析及靶向代谢组学检测发现TALDO1 可能主要通过正调节氧化还原代谢 （NADPH 产生） 和能量代谢
（核苷酸产生） 来促进乳腺癌转移。为了进一步验证这一发现，作者构建了三个转移性乳腺癌 PDO，培养 5 天后，作者用 AO-022 （40
μmol/L） 处理 PDOs，观察到转移性乳腺癌 PDOs 的生长受到 AO-022 （40 μmol/L），这些结果进一步表明 AO-022
有效抑制乳腺癌的生长。
图 发现一种具有细胞活性的 TALDO1 抑制剂
研究结论
总而言之，在该项研究中，作者发现乳腺癌衍生的
EV 携带的蛋白质可以用作一种新型的微创液体活检工具用于乳腺癌的早期检测，TALDO1是一种用于转移性乳腺癌的新型血清 EV
生物标志物，TALDO1的抑制剂AO-022可有效抑制乳腺癌的生长，证明 TALDO1 的药物灭活是转移性乳腺癌的潜在治疗方法。这些发现将可促进临床常规血清EV筛查的实施。
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