Nature Protocols：器官尺度打印生物墨水体系设计

在体外重建人体器官是生物3D打印的核心目标之一，将有望彻底解决可移植器官的短缺问题。因此，投影式生物3D打印（PBBP）凭借其极高的分辨率/制造时间（RTM）比，正被广泛用于各类人体组织的重建。由于组织/器官的功能与其物理尺度密切相关，后者决定了满足结构和生理功能所需的庞大细胞数量。例如，心脏强大的泵血功能正源于其复杂的结构及厘米级心肌组织的规律收缩。因此，要实现“器官体外再造”这一宏伟愿景，首先应需要突破从mm级到cm级器官尺度活性构件的高效制造。

器官尺度的生物打印主要面临两个关键问题：实现高细胞密度的负载和长时间的稳定打印。打印结构的成熟和后续功能的发挥与其细胞密度息息相关。天然组织需达到特定的密度后才能建立有效的细胞间连接。此外，构建这种高细胞密度的器官尺度复杂结构，必然需要长时间的打印过程。

目前绝大多数研究仍难以同时满足高细胞密度与长时间打印的要求，其制造的载细胞结构在尺寸或细胞密度方面，与天然器官相比仍存在显著差距。这种局限性主要源于缺乏生物墨水及其成形理论之间的系统分析。关于器官尺度生物3D打印（PBBP）的许多核心挑战尚未得到解决。

（1）高细胞密度负载会加剧打印过程的光散射，严重降低打印精度；此外，在器官尺度制造所需的长时间打印中，细胞持续沉降亦会降低打印精度，如何降低生物墨水的异质性？ （2）打印后期生物墨水出现固化困难，光响应特性显著改变，进而导致打印失败。如何提高打印的稳定性？ （3）长时间打印过程中，生物墨水持续蒸发致使溶质浓度升高，显著改变固化时间和流变性能，严重降低打印精度及结构复现性。如何有效避免生物墨水蒸发？ （4）打印后负载细胞的活力低下，大量细胞在长时间的打印过程中死亡，显著降低结构的发育潜力。如何在器官尺度制造中维持细胞活性？

为系统回答这些问题，并提供稳定且易于拓展的解决方案，EFL团队在《Nature Protocols》上发表了题为“Bioink design for organ-scale projection-based 3D bioprinting”的研究论文，浙江大学药学院程翼宇教授、口腔医院俞梦飞教授和机械学院贺永教授为共同通讯作者，博士生乔天鸿、何超凡为共同一作。

本文首先总结了器官尺度PBBP的基本框架并提出适用于这项技术的生物墨水系统应满足的标准：（1）精确的光响应特性；（2）高稳定性；以及（3）优异的生物相容性。在此基础之上，这项方案还聚焦现有生物墨水系统的几个核心要素，并提出相应的优化策略。具体而言，本文采用了甲基丙烯酰明胶（GelMA）-聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）多组分生物墨水体系，并结合Ficoll 400同步调控折射率和密度以细胞的相匹配，从而在保证良好生物相容性的同时实现高分辨率打印。此外，通过在生物墨水中掺入丝氨酸蛋白酶抑制剂4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟（AEBSF），可有效防止胰蛋白酶的降解；使用液体石蜡液封生物墨水以防止水分蒸发。最后，将生物墨水的pH值校准至生理水平，以保证负载细胞的高活力打印。

图1 器官尺度投影式生物3D打印的基本框架

方案由两个程序构成。程序1概述了器官尺度生物3D打印的工艺流程，包含4个部分：水凝胶前体溶液的制备；负载细胞的准备；生物打印过程；打印后处理及动态培养。

程序2则概述了生物墨水的表征方法，包含15个部分：光流变性能测试，双键转化率（DBC）测试等。

图2器官尺度投影式生物3D打印的流程示意图

器官尺度的界定

综合考量天然器官的尺寸特征、与其尺度密切相关的功能需求以及当前生物打印研究现状，我们认为：器官尺度生物打印需要实现厘米级（三个维度）结构的构建。本文正是围绕这一核心目标，建立了完整的生物墨水设计框架，并通过成功打印厘米级海绵体结构验证了这一方案的实用性。

值得注意的是，人体器官的尺度跨度较大，一些主要器官的尺寸远超厘米级。然而，这项方案仍可为相关实验设计提供参考。这是因为在未来，这类器官的构建或许并不依赖于直接的一步式整体打印。因为超长的打印时间可能导致细胞活力的严重下降，从而损害整个结构的发育潜力。相比之下，预先构建厘米级功能单元，再通过模块化组装重建目标器官，可能是一种更具前景的策略。

生物墨水的异质性

高细胞密度的负载会显著增加生物墨水的异质性，进而对打印过程产生两大不利影响：（1）细胞质的折射率通常高于水基的生物墨水，导致光线的散射；（2）细胞质的密度通常高于生物墨水，致使长时间打印过程中细胞发生沉降，这不仅进一步加剧了光散射，还阻碍了细胞在结构中的均匀分布。

这项方案中，通过引入 Ficoll 400（聚蔗糖）以应对这一挑战。15% (w/v) 的 Ficoll 400 能够调节生物墨水的折射率与密度，使其与细胞的相匹配。这种同步调控能力有效满足了器官尺度生物打印的特定需求。此外，Ficoll 400 成本低廉且具有良好的水溶性，用户无需特殊操作即可复现。

图3 生物墨水的光响应特性

胰蛋白酶活性的抑制 在打印前，生物墨水通过将细胞沉淀与水凝胶前体溶液混合制备。然而，将细胞悬液离心并去除上清液后，细胞沉淀表面仍会有微量液体残留。用于消化贴壁细胞的胰蛋白酶会因此随细胞沉淀混入生物墨水。并在打印过程中，持续降解生物墨水中的蛋白质基组分，导致交联效率降低、曝光时间延长，最终导致打印失败。

这项方案中，生物墨水中引入了丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF，以防止残留胰酶影响光响应特性。并选择添加 0.25 mM AEBSF——这一浓度已在以往的细胞培养研究中被广泛采用。对于细胞密度为1×10⁷ /mL的生物墨水，该浓度足以有效抑制细胞沉淀中残留胰酶的活性。

图4 生物墨水的稳定性

油封打印

生物墨水会因蒸汽压而不断蒸发，而长时间的打印会加剧这种现象。此外，为了防止生物墨水冷凝，加热的打印料槽也会加剧蒸发。这将导致溶质浓度升高，进而改变生物墨水的光响应特性和流变性能，最终致使打印失败。

在这一方案中，采用了一种独特的油封打印工艺，以防止生物墨水在器官尺度制造的长时间下蒸发。简而言之，用户应在打印基层后暂停该过程，在生物油墨周围添加液体石蜡，然后继续打印。平台下降后，液体石蜡将形成油封，防止蒸发。

图5 油封打印减少生物墨水蒸发

生物墨水pH值校准

为了确保打印过程中细胞不因pH值而大量死亡，研究人员通常使用生理pH值的缓冲液配制水凝胶前体溶液。一个常被忽视的关键点是：缓冲液往往不足以抵消高浓度水凝胶前体引起的pH值降低。这是因为，在制造远小于器官尺度的结构时，打印时间较短，生物墨水pH值对细胞存活率的影响微乎其微，因此较易实现高细胞存活率。然而，在器官尺度的生物打印中，仅使用生理pH值的缓冲液无法维持细胞的高活性。原因在于，随着打印时间显著延长，生物墨水的持续酸化不可避免地导致细胞发生代谢性酸中毒。

这项方案中，通过将生物墨水的pH值校准至生理水平，显著提升了负载细胞的存活率。此外，当使用其他水凝胶前体时，这种策略也是可行的，因为许多常见的水凝胶前体溶液由于其纯度、合成方法或酸性官能团而表现出酸性，如牛血清白蛋白（BSA）、甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖（CMCSMA）和甲基丙烯酰海藻酸钠（AlgMA）。

图6 生物墨水的 pH 值对封装细胞存活率的影响

器官尺度阴茎海绵体结构的PBBP

这项方案中，通过使用含有HUVEC、RS1和USMC细胞的生物墨水打印器官尺度阴茎海绵体结构，以展示这一体系的可行性，这些细胞代表了构成该组织的三种主要细胞类型。用户可以通过改变负载的细胞或培养条件，根据他们的实验需求构建所需的结构。

图7 器官尺度海绵体结构的生物打印

图8 低倍免疫荧光图像显示培养7天后细胞染色情况

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-025-01221-0