一、抗原多肽与 HLA 分子的匹配标准

   抗原多肽（peptides）与人类白细胞抗原（HLA）分子的“匹配”是T细胞识别肿瘤抗原等免疫应答的核心前提，其核心标准围绕结构兼容性与功能有效性展开，具体包括以下层面：

（一）结构与序列匹配

HLA 分子通过抗原结合槽（由氨基酸残基形成的“口袋”）结合肽段，这种结合依赖肽段序列特征与 HLA 结合槽结构特征的匹配，具体体现为：

肽段长度适配

HLA 分子类型决定了对结合肽段长度的偏好（由结合槽空间大小决定）：

I 类 HLA（如 HLA-A、B、C）：主要结合 8-11 个氨基酸（aa）的短肽（最常见 8-10mer），例如 HLA-A*0201 偏好 9mer 或 10mer 肽段；

II 类 HLA（如 HLA-DR、DQ、DP）：结合槽开放程度更高，偏好 12-20 个氨基酸的长肽（无严格上限）。

若肽段长度超出对应 HLA 分子的偏好范围，会因空间位阻无法稳定结合（如 12mer 肽段难以适配 HLA-A*0201 的结合槽）。

锚定残基匹配

HLA 结合槽内的 “口袋”（如 P1、P2、PΩ，其中 PΩ 为 C 端）需与肽段特定位置的氨基酸形成稳定相互作用，这些位置的氨基酸被称为 “锚定残基”。不同 HLA 等位基因的口袋结构不同，对锚定残基的化学性质（疏水性、电荷等）有严格偏好：

I 类 HLA：锚定残基通常位于肽段第 2 位（P2）和 C 端（PΩ），少数涉及 P3、P6 等位置。例如，HLA-A0201 的 P2 口袋偏好疏水氨基酸（如亮氨酸 L、甲硫氨酸 M），C 端（P9）偏好疏水或极性氨基酸（如缬氨酸 V、亮氨酸 L）；HLA-A2402 的 P2 口袋偏好芳香族氨基酸（如酪氨酸 Y、苯丙氨酸 F），C 端偏好碱性氨基酸（如赖氨酸 K、精氨酸 R）。

II 类 HLA：锚定残基位置更灵活（因结合槽两端开放），通常分布在肽段中间区域（如 P1、P4、P6、P9），偏好更复杂（如 HLA-DR1 偏好 P1 位为芳香族氨基酸）。

锚定残基的匹配是结构兼容的核心 —— 若关键锚定位置的氨基酸不符合 HLA 等位基因偏好，会直接导致结合失败。

（二）功能验证标准：结合强度与生物学活性

即使肽段满足结构匹配，仍需通过功能实验验证其与 HLA 的结合有效性，核心指标包括：

结合亲和力

以 IC₅₀值（半数抑制浓度）量化结合强度（数值越低，亲和力越高）：高亲和力（IC₅₀≤50 nM，能稳定结合并有效呈递，为肿瘤疫苗首选）；中等亲和力（50 nM<IC₅₀≤500 nM，需进一步验证功能）；低亲和力（IC₅₀>500 nM，无法有效结合）。检测方法包括荧光偏振法、放射性同位素标记法、MHC 四聚体竞争性结合实验等。

结合稳定性

肽-HLA 复合物需在细胞表面维持足够时间（半衰期 t₁/₂）以被 T 细胞受体（TCR）识别，标准为 t₁/₂≥1-2 小时（不同 HLA 等位基因阈值略有差异，如 HLA-A*0201 要求 t₁/₂≥1 小时）。稳定性不足会导致肽段快速解离，无法触发 T 细胞应答。

洗脱实验验证

通过质谱分析从内源 HLA 分子上自然洗脱的肽段，若目标肽段被检测到，证明其在生理条件下可被 HLA 呈递（而非仅体外结合），是生理相关性的金标准之一。

（三）功能性验证：能否触发 T 细胞应答

多肽与HLA的结构匹配和高亲和力仅说明 “能结合”，最终需验证肽-HLA 复合物能否被 T 细胞识别并激活免疫应答（这是肿瘤疫苗和抗原特异性 T 细胞治疗的核心目标）。具体验证方法包括：

T 细胞活化实验

细胞因子释放检测：用肽段刺激特异性 T 细胞，通过 ELISPOT 或流式细胞术检测 IFN-γ、TNF-α 等细胞因子分泌（阳性提示 T 细胞激活）；细胞毒性检测：通过⁵¹Cr 释放实验或 CFSE 标记法，验证 T 细胞对 “表达 HLA + 靶肽” 的靶细胞的杀伤能力。

四聚体染色

用 “肽-HLA四聚体”（4 个肽-HLA 复合物连接形成，增强与 TCR 的结合）标记T细胞，若流式细胞术检测到阳性T细胞群（比例> 0.1%），证明存在特异性识别。

（四）基于高分辨率的 HLA 分型

同一低分辨率 HLA 家族（如 HLA-A02）的不同等位基因（如 A0201 vs A0202），其结合槽 “口袋” 结构可能存在1-2个氨基酸差异，导致锚定残基偏好和亲和力标准完全不同（如 HLA-A0201 能结合的肽段可能无法与 A0202结合）。因此，所有匹配标准均需针对“高分辨率 HLA 等位基因”（如 A0201、A2402），而非低分辨率家族。

综上，肽段与HLA的“匹配”是“结构兼容（长度+锚定残基）→结合能力（亲和力+稳定性）→功能有效（T细胞激活）” 的递进过程，核心是确保肽段能被特定 HLA 等位基因稳定呈递并触发特异性免疫应答，这对肿瘤疫苗设计等场景至关重要。

二、验证多肽被抗原呈递细胞（APC）呈递的实验方法

验证多肽能否被 APC 呈递的实验方法，围绕 “多肽与APC表面MHC分子结合”及“呈递后激活特异性T细胞” 两大核心过程设计，具体包括以下三类：

（一）直接检测多肽与 MHC 分子的结合（呈递的前提）

免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱 / ELISA 检测

原理：用抗 MHC 分子的特异性抗体从 APC 裂解液中沉淀 MHC 分子及其结合的多肽，通过质谱鉴定结合的多肽序列，或利用针对目标多肽的特异性抗体通过 ELISA 检测复合物中是否存在目标多肽。优势：可直接捕获并鉴定天然状态下与 MHC 结合的多肽，适合未知多肽筛选。

表面等离子体共振（SPR）技术

原理：将 MHC 分子固定在 SPR 芯片表面，流经目标多肽溶液，通过检测折射率变化实时监测多肽与 MHC 的结合动力学（亲和力、结合速率）。需提前获取可溶性 MHC 分子，直接量化多肽与 MHC 的结合能力，适合验证多肽与特定 MHC 分子的结合特异性。优势：无需标记，实时定量，灵敏度高，可计算结合常数（KD 值）。

肽-MHC复合物流式细胞术

原理：用荧光标记的目标多肽（或荧光标记的肽 - MHC 四聚体）孵育 APC，通过流式细胞术检测 APC 表面是否形成 “荧光标记的肽 - MHC 复合物”；若多肽未标记，可采用针对 “特定肽 - MHC 复合物” 的单克隆抗体（如抗 HLA-A2 - 肽复合物抗体）检测。优势：可在单细胞水平定量 APC 表面肽 - MHC 复合物的表达量，适合分析不同 APC 亚群的呈递效率。

竞争性结合实验

原理：已知某多肽（阳性对照）可特异性结合某类 MHC 分子，将其与目标多肽共同孵育 APC，通过检测阳性对照多肽与 MHC 的结合是否被抑制，判断目标多肽是否与该 MHC 结合。例如，用荧光标记的阳性对照多肽孵育 APC，同时加入不同浓度的目标多肽，流式细胞术检测 APC 表面荧光强度（阳性对照结合量），若荧光强度随目标多肽浓度升高而降低，证明目标多肽可竞争性结合 MHC。

（二）通过 T 细胞功能验证呈递效果（功能性呈递）

多肽被 APC 呈递的最终功能是激活特异性T细胞（CD8⁺T细胞识别 MHC-I呈递的肽，CD4⁺T细胞识别MHC-II呈递的肽），因此可通过检测 T 细胞的活化反应间接验证呈递：

特异性 T 细胞增殖实验

原理：若 APC 呈递了目标多肽，会激活特异性 T 细胞（需提前制备针对该多肽的 T 细胞克隆或 TCR 转基因 T 细胞）并使其增殖。用目标多肽孵育 APC 后与特异性 T 细胞共培养，通过 ³H - 胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）掺入法或 CFSE 荧光稀释法检测 T 细胞增殖水平（增殖率越高，呈递越有效）。

细胞因子释放检测（ELISA/ELISPOT）

原理：激活的 T 细胞会分泌特征性细胞因子（如 CD8⁺T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α；CD4⁺T 细胞分泌 IL-2、IFN-γ 等），通过检测细胞因子水平反映呈递效果。

T 细胞杂交瘤报告基因实验

原理：T 细胞杂交瘤细胞（融合了特异性 T 细胞与骨髓瘤细胞）在识别肽 - MHC 复合物后，会激活 NFAT 等转录因子，驱动报告基因（如 β- 半乳糖苷酶、荧光素酶）表达，通过检测报告基因活性判断呈递。优势：灵敏度高，可量化激活强度，适合高通量筛选多肽。

MHC 四聚体染色结合流式细胞术

原理：将负载目标多肽的 MHC 分子（I 类或 II 类）组装成四聚体（可结合 T 细胞表面 TCR），若 APC 呈递了该多肽，会诱导特异性 T 细胞活化并表达活化标志物（如 CD69），且可被四聚体染色。

（三）可视化肽 - MHC 复合物的细胞内定位（验证处理与转运）

原理：通过荧光标记（目标多肽用荧光探针标记，MHC 分子用荧光抗体标记），利用共聚焦显微镜观察两者在 APC 内（如溶酶体）或细胞表面的共定位，证明多肽被处理后与 MHC 分子结合并转运至表面。该方法适合追踪多肽在 APC 内的加工路径（如 MHC-II 类分子需与内体中的多肽结合，MHC-I 类分子需与胞质加工的多肽结合）。若多肽为胞外蛋白衍生，还需验证 APC 是否能摄取并加工（如通过胞内递送与胞外孵育的对比实验）。