关键发现：研究团队首先在临床湿性AMD患者的RPE-脉络膜复合体单细胞测序数据中发现，ALKBH3（一种RNA m1A去甲基化酶）的表达显著高于健康对照。其表达水平甚至随着疾病进展（伪时间轨迹）而升高。

关键数据：单细胞UMAP分析显示，在湿性AMD患者的RPE细胞中，ALKBH3表达显著上调（p = 0.014）。这种上调现象在体外（低氧1% O₂、CoCl₂处理的fRPE细胞）和体内（激光诱导CNV模型小鼠、老年小鼠）的AMD模型中均得到一致验证。

意义：ALKBH3作为潜在致病因子，首次在AMD中被系统性锁定。

图 1. ALKBH3 在 AMD 临床样本和模型中表达上调

关键发现：ALKBH3过表达直接导致RPE细胞结构和功能严重受损。

关键数据与实验：

• 极化破坏：ALKBH3过表达导致RPE细胞顶-基底极性标志物MerTK和Na⁺/K⁺ ATPase表达下降并从顶膜移位（免疫荧光、免疫印迹证实），这是RPE维持屏障和营养转运功能的基础。

• 吞噬障碍：细胞吞噬乳胶珠能力显著下降（吞噬实验），意味着RPE无法有效清除脱落的光感受器外节，积累废物。

• 连接解体：紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白β-catenin表达降低（免疫荧光、免疫印迹），破坏RPE屏障完整性。

• 形态异常：细胞出现异常增大和不规则形状。

意义： ALKBH3过表达是导致早期AMD特征性RPE功能障碍的直接原因。

图 2. ALKBH3 过表达异常激活视网膜色素上皮（RPE）细胞中的糖酵解过程

关键发现：ALKBH3过表达将RPE细胞的能量代谢推向异常活跃的糖酵解途径，同时抑制了更高效的氧化磷酸化，导致细胞“能量饥荒”。

关键数据与实验：

• 转录组证据：RNA测序 (RNA-Seq) 结合基因集富集分析 (GSEA) 和基因本体论 (GO) 分析显示，糖酵解通路在ALKBH3过表达细胞中显著富集。

• 能量失衡：糖酵解来源ATP (glycoATP) 产量上升，但线粒体ATP (mitoATP) 产量和总ATP产量显著下降（ATP生成速率测定）。细胞内ATP水平也降低。

• 糖酵解爆发：糖酵解质子外排率 (glycoPER) 测定显示基础和代偿性糖酵解均增强。葡萄糖摄取率显著升高。

• 酶促失调：关键限速糖酵解酶HK2、PFKM、PKM2以及乳酸脱氢酶LDHA的mRNA和蛋白水平均升高（qPCR, 免疫印迹）。

• 乳酸堆积：细胞内和分泌的乳酸水平均显著升高。

• 线粒体受抑：海马能量代谢分析显示ATP相关耗氧率、最大呼吸能力、备用呼吸能力均下降。丙酮酸脱氢酶PDH磷酸化（失活）增加，乙酰辅酶A水平降低。

意义： ALKBH3通过重塑RPE代谢，将其推向低效、产乳酸的糖酵解路径，为后续的病理级联埋下伏笔。

关键发现： ALKBH3过表达的RPE细胞分泌大量促血管生成因子VEGFA，显著促进血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力——这是CNV形成的核心步骤！

关键数据与实验：

• 信号通路：RNA-Seq GSEA分析显示VEGF信号通路在ALKBH3过表达RPE中富集。ELISA检测证实VEGFA分泌增加。

• 共培养实验 (核心)：将过表达ALKBH3的RPE细胞与血管内皮细胞系EA.hy926共培养：

• 内皮细胞增殖加速：EdU阳性细胞比例增加，S期和G2期细胞比例升高（EdU, 细胞周期分析）。

• 内皮细胞迁移增强：Transwell迁移实验和划痕实验均显示内皮细胞迁移速度加快。

• 内皮细胞成管能力增强：内皮细胞形成管状结构的长度和节点数显著增加（管形成实验）。

意义：此部分研究直接揭示了RPE细胞如何通过ALKBH3-VEGFA轴“遥控”血管内皮细胞，驱动病理性脉络膜新生血管（CNV）的形成，解释了干性AMD向湿性AMD转化的关键环节。血管内皮细胞是执行CNV形成的“最终效应器”。

关键发现：通过视网膜下注射携带小鼠Alkbh3基因的重组腺相关病毒 (rAAV2-Alkbh3)，成功在小鼠RPE特异性过表达Alkbh3，模拟出AMD的核心病理特征：视力下降、RPE异常、CNV形成。

关键数据：

• 视力损伤：视动反应（OMR）减弱。

• RPE异常：眼底可见黄色点状沉积（对应自发荧光FAF高信号）；Rpe65表达下降；ZO-1/β-catenin表达降低及连接破坏；RPE细胞形态不规则、多核化；吞噬功能受损（视紫红质潴留）；ATP降低，乳酸升高。

• CNV爆发：荧光素眼底血管造影（FFA）显示渗漏高信号区域增大；IB4/FITC染色显示CNV体积显著增大；光学相干断层扫描（OCT）和H&E染色显示CNV高度增加；脉络膜毛细血管出芽面积增大。

反证：在Alkbh3基因敲除小鼠中，RPE糖酵解被抑制，Vegfa表达下降，激光诱导的CNV体积和高度均显著减小，脉络膜出芽减弱。

意义：体内实验强力证实了ALKBH3在驱动AMD核心病理表型（RPE退化、CNV）中的核心作用。

6️⃣分子手术刀：ALKBH3如何精准操控HK2与VEGFA？

关键发现：ALKBH3通过其去甲基化酶活性，直接靶向降低糖酵解限速酶HK2和促血管生成因子VEGFA mRNA上的m1A修饰水平，依赖阅读蛋白YTHDF2增强其mRNA稳定性，从而上调其表达。

关键数据与实验：

• 活性依赖：催化失活突变体ALKBH3-D193A无法引起m1A水平下降、RPE功能异常、代谢紊乱及HK2/VEGFA上调。

• 直接靶点：m1A-RIP-Seq和m1A-RIP-qPCR证实ALKBH3敲低增加，而过表达降低HK2和VEGFA转录本上特定m1A位点（Chr2:74834176-74834177 for HK2; Chr6:43738738-43738739 for VEGFA）的m1A修饰水平。ALKBH3-RIP-qPCR证明ALKBH3直接结合这些位点。

• 稳定性调控：转录抑制剂放线菌素D处理显示，野生型ALKBH3（非突变体）能显著延长HK2和VEGFA mRNA的半衰期。

• 阅读器YTHDF2：RIP-qPCR证实YTHDF2结合HK2/VEGFA mRNA，此结合被ALKBH3过表达破坏。敲低YTHDF2可上调HK2/VEGFA表达及稳定性，并能挽救Alkbh3敲除导致的HK2/Vegfa下降。

• 靶向编辑验证：使用工程化的dm1A CRISPR系统特异性去除HK2或VEGFA转录本上的m1A位点，成功模拟了ALKBH3过表达的效果（增加表达、稳定性，促进糖酵解）。

意义： 精确阐明了ALKBH3通过m1A-YTHDF2轴调控关键致病因子HK2（代谢）和VEGFA（血管新生）表达的分子机制。

关键发现：ALKBH3驱动的糖酵解产生过量乳酸，乳酸诱导组蛋白H3K18位点发生乳酸化修饰（H3K18la）；H3K18la结合在ALKBH3基因启动子区，显著促进ALKBH3转录，形成一个自我强化的正反馈回路，加速AMD恶化。

关键数据与实验：

• 乳酸升高：低氧或ALKBH3过表达导致RPE细胞内乳酸水平显著上升。

• 乳酸化增强：低氧或外源乳酸钠处理增加全蛋白赖氨酸乳酸化（pan-Kla）及特定位点H3K18la水平（免疫印迹）。

• 直接调控：ChIP-Seq和ChIP-qPCR证实H3K18la在ALKBH3基因转录起始位点附近（两个峰）富集。

• 功能验证：使用p300抑制剂C646（抑制H3K18la写入）可阻断低氧诱导的ALKBH3/HK2/VEGFA上调；而组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸VPA（提高H3K18la水平）则促进其表达。

意义：揭示了AMD中一个关键的自我放大机制——“ALKBH3↑→糖酵解↑→乳酸↑→H3K18la↑→ALKBH3↑↑”。打破此回路是治疗关键。

关键发现：ALKBH3特异性抑制剂HUHS015能有效逆转低氧诱导的RPE细胞病理改变和异常糖酵解。更令人惊喜的是，在激光诱导的CNV小鼠模型中，玻璃体内注射HUHS015能显著抑制CNV，且与现有抗VEGF药物Aflibercept（阿柏西普）联用效果更佳！

关键数据与实验：

• 体外救援： HUHS015处理可恢复低氧RPE细胞中降低的m1A水平；逆转HK2/VEGFA的上调及分泌；修复极化标志物和连接蛋白表达；恢复吞噬功能；抑制异常糖酵解（降低glycoPER、葡萄糖摄取、乳酸水平，部分恢复ATP）。

• 体内抗CNV：

• 单药有效： HUHS015或Aflibercept单药玻璃体注射均能显著减小CNV体积（IB4/FITC染色）、降低CNV高度（OCT, H&E）。

• 协同增效： HUHS015与Aflibercept联用对CNV的抑制作用显著强于任一单药！ 在抑制脉络膜毛细血管出芽方面也观察到协同效应。

意义： HUHS015通过抑制ALKBH3去甲基化酶活性，有效打断“糖酵解-乳酸化”恶性循环，保护RPE功能并强力抑制CNV。其与抗VEGF药物的协同作用，为湿性AMD提供了极具前景的双靶点（代谢+血管）联合治疗新策略。

总结与展望：

这项PNAS研究系统性揭示了AMD从RPE退化到CNV进展的核心机制：ALKBH3-m1A去甲基化酶驱动的“HK2糖酵解激活 / VEGFA分泌增加 → 乳酸堆积 → H3K18组蛋白乳酸化 → ALKBH3转录再激活”正反馈回路。其中，ALKBH3通过VEGFA调控血管内皮细胞的行为是导致破坏性新生血管（CNV）的关键环节。研究不仅深化了对AMD分子机制的理解，更重要的是指明了新的治疗方向：靶向ALKBH3及其介导的代谢-表观遗传反馈回路。抑制剂HUHS015在临床前研究中展现出的显著疗效，尤其是与现有抗VEGF药物的协同作用，为开发更有效的AMD疗法（特别是针对当前缺乏有效治疗的RPE退化和抗VEGF疗效不佳/耐药的患者）带来了突破性希望。期待未来临床试验能尽快验证这一策略在患者身上的安全性和有效性，为全球数百万AMD患者点亮守护视力的新曙光！

论文出处：PNAS 2025 Vol. 122 No. 24 e2416046122. https://doi.org/10.1073/pnas.2416046122