导语：失明元凶——糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等缺血性眼病，核心在于失控的“病理性血管新生”。传统抗VEGF疗法遭遇瓶颈，耐药性、疗效不足问题凸显。中山大学团队在《PNAS》发表重磅研究，首次揭示内皮细胞（EC）内一场由乳酸堆积引发的“表观遗传风暴”，及其核心引擎——Semaphorin 6A (SEMA6A) 蛋白的“液液相分离”(LLPS)，如何共同推动血管疯狂生长。这为开发全新疗法照亮了道路！

1️⃣ 缺氧之后，乳酸与组蛋白乳酸化的“罪恶同盟”

背景痛点：缺血性视网膜病变中，缺氧虽短暂，但病理性血管新生（NV）却在缺氧缓解后持续爆发（如氧诱导视网膜病变OIR模型P14-P17期），传统VEGF/HIF-1α轴无法完全解释。

核心发现：

• 乳酸堆积： 在OIR小鼠病理性NV高峰期（P17），视网膜内皮细胞(EC)内乳酸水平显著升高。糖酵解酶（如PFKFB3, LDHA）表达在EC中同步上调。

• 组蛋白乳酸化修饰爆发： 乳酸不仅是代谢废物，更是信号分子！研究首次在体内证实，OIR模型EC中，组蛋白H3第9位 (H3K9la) 和第18位赖氨酸 (H3K18la) 的乳酸化修饰在病理NV起始阶段（P14, P15）特异性显著升高。免疫荧光显示其富集于病理性血管簇（Tufts）。体外实验证实，外源乳酸可剂量依赖性诱导人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）H3K9la/H3K18la。

关键数据：OIR EC中乳酸↑；H3K9la/H3K18la在P14/P15特异性↑（非H4位点）；乳酸处理HRMEC直接诱导H3K9la/H3K18la↑。

方法亮点：磁珠分选（MACS）纯化视网膜EC；OIR小鼠模型（P7-P12高氧诱导中央血管闭塞，P12后常氧诱导病理性NV）；Western Blot检测位点特异性组蛋白修饰；免疫组化/免疫荧光空间定位。

内皮细胞角色：EC是病理性NV的执行者，其代谢重编程（糖酵解↑→乳酸↑）和表观遗传修饰（H3K9la/H3K18la↑）是驱动NV持续的核心细胞事件。

图 1. 在氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，内皮细胞（ECs）的乳酸生成以及 H3K9 和 H3K18 的组蛋白乳酸化水平升高

2️⃣ H3K9la/H3K18la“点亮”关键基因PRMT5，启动恶性循环

科学问题：H3K9la/H3K18la在EC中究竟调控了哪些基因？如何影响病理进程？

核心发现：

• CUT&Tag联合scRNA-seq锁定靶标： 对纯化的视网膜EC进行全基因组H3K9la/H3K18la结合位点分析（CUT&Tag）和单细胞转录组测序（scRNA-seq）联合分析。

• PRMT5脱颖而出： H3K9la/H3K18la结合峰在OIR EC基因启动子区显著富集。功能富集分析指向“蛋白甲基化”通路。交叉分析锁定 PRMT5 (Protein Arginine Methyltransferase 5) 为关键靶基因：其启动子区有强H3K9la/H3K18la信号，且在OIR EC中（P14）mRNA和蛋白水平特异性显著上调。ChIP-qPCR证实乳酸处理促进H3K9la/H3K18la在PRMT5启动子区富集。

关键数据：CUT&Tag揭示 >23,000个差异H3K9la峰；GO分析核心通路为“蛋白甲基化”；PRMT5是核心靶基因（启动子区富集，表达在P14 EC特异性↑）。

方法亮点：创新性联合应用CUT&Tag（高灵敏度组蛋白修饰定位） 和 scRNA-seq（细胞类型特异性基因表达） 技术；生物信息学分析（GO, GSEA）；ChIP-qPCR验证特定启动子结合。

内皮细胞角色：EC内H3K9la/H3K18la修饰直接“编程”了PRMT5基因的转录激活，为后续恶性循环埋下伏笔。

图 2. Prmt5 是 H3K9 和 H3K18 乳酸化的靶标

3️⃣ 内皮PRMT5缺失——打破“乳酸-乳酸化”死亡循环，抑制血管新生！

核心发现：

• PRMT5是EC病理NV的推手： 内皮细胞特异性诱导性敲除 Prmt5 (*Prmt5-EC-iKO*)。在OIR模型中，敲除显著抑制了病理性血管簇（Tufts）形成（减少56.9%）和无血管区（VO）面积（减少31.6%）。

• PRMT5维持“乳酸-乳酸化”正反馈： PRMT5缺失导致EC糖酵解酶（如PFKFB3）表达↓，乳酸产量↓。更重要的是，H3K9la/H3K18la水平也显著降低。这表明：乳酸↑ → H3K9la/H3K18la↑ → PRMT5↑ → 糖酵解↑/乳酸↑ → H3K9la/H3K18la↑ 形成了一个自我强化的正反馈循环。PRMT5是循环的关键节点。

关键数据：*Prmt5-EC-iKO* 使病理性NV减少~57%；EC内乳酸↓；H3K9la/H3K18la↓。

方法亮点：条件性基因敲除小鼠模型 (*Prmt5 flox/flox; Cdh5-CreERT2*)；他莫昔芬诱导（P12-P14）；视网膜铺片量化NV/VO；EC乳酸检测；WB/IF检测糖酵解酶和乳酸化水平。

内皮细胞角色：EC特异性PRMT5是病理性NV的核心驱动因子。靶向EC-PRMT5可有效打破其内部的“乳酸-乳酸化”恶性循环，抑制血管过度增生。

图 3. 内皮细胞中的 Prmt5 通过乳酸与组蛋白乳酸化的正反馈调节病理性新生血管形成（NV）

4️⃣ SEMA6A相分离“液滴工厂”——招募“工人”，激活乳酸化引擎P300

科学问题：上游是什么机制感应乳酸堆积并启动H3K9/K18乳酸化？

核心发现：

• P300磷酸化是关键：乳酸处理诱导EC中组蛋白乳酸化“书写器” P300 的磷酸化水平升高。敲低P300显著抑制H3K9la/H3K18la、PRMT5表达及乳酸产生。

• RHOA/ROCK2通路参与：乳酸也诱导小G蛋白 RHOA 及其效应激酶 ROCK2 表达↑。Co-IP证实乳酸增强RHOA与P300的相互作用。

• SEMA6A是核心组织者： 乳酸特异性诱导跨膜蛋白 SEMA6A 表达。Co-IP揭示SEMA6A直接结合RHOA和P300，且乳酸增强此互作（Fig 4H-I）。内皮特异性敲除 Sema6A (*Sema6A-EC-KO*) 显著降低P300磷酸化及H3K9la/H3K18la。

• SEMA6A C端“变身”液滴 (LLPS)：预测发现SEMA6A C端含 固有无序区 (IDR)。在细胞（293T, HRMEC）和高乳酸环境中，全长SEMA6A (SEMA6A-FL) 或其IDR片段 (SEMA6A-IDR) 能形成动态的球形“液滴”（凝聚物），而缺失IDR的突变体 (SEMA6A-ΔIDR) 则不能。FRAP（荧光漂白恢复）实验 证实这些液滴具有液体般的快速融合和恢复特性。

• “液滴工厂”招募“工人”：Co-IP和共定位证实SEMA6A（尤其其IDR）在液滴内招募RHOA和P300。P300对SEMA6A相分离至关重要。体外纯化实验进一步验证：SEMA6A-IDR蛋白可在含PEG（模拟拥挤环境）或乳酸的缓冲液中形成液滴，且P300蛋白促进其形成。

• IDR驱动血管新生：在 *Sema6A-EC-KO* 小鼠的主动脉环体外血管新生模型中，回补SEMA6A-FL或SEMA6A-IDR（而非ΔIDR）能挽救血管出芽能力。这证明SEMA6A-IDR的相分离是其促血管生成功能所必需的。

关键数据：乳酸诱导P300磷酸化↑、RHOA/ROCK2↑；SEMA6A结合RHOA/P300；*Sema6A-EC-KO* 抑制P300磷酸化及乳酸化；SEMA6A-IDR形成直径~5μm动态液滴；FRAP显示液滴快速恢复（半恢复时间秒级）；IDR回补挽救血管新生。

方法亮点：Co-IP验证蛋白互作；相分离研究全套技术（活细胞成像、FRAP、体外重组蛋白液滴形成、浊度测定、1,6-己二醇破坏实验）；IDR缺失/回补功能验证；主动脉环体外血管新生模型。

内皮细胞角色：EC膜受体SEMA6A是感知乳酸并启动相分离的核心分子。 其IDR形成的“液滴工厂”物理性地将RHOA和P300招募到一起，促进P300磷酸化激活，从而高效催化H3K9/K18乳酸化修饰，是恶性循环的“放大器”。

图 4. 在氧诱导视网膜病变（OIR）的视网膜血管中，P300 的磷酸化通过与 RHOA 和 SEMA6A 相互作用调节 H3K9 和 H3K18 的乳酸化水平

5️⃣ SEMA6A-PRMT5轴——相分离驱动乳酸化循环的完整拼图

核心发现：

• SEMA6A调控PRMT5表达： *Sema6A-EC-KO* 显著降低视网膜EC中PRMT5的mRNA和蛋白水平。ChIP-qPCR显示敲低SEMA6A降低H3K9la/H3K18la在PRMT5启动子区的富集。

• PRMT5是SEMA6A功能的下游执行者： 在主动脉环模型中，SEMA6A-FL或IDR过表达对 *Prmt5-EC-iKO* 小鼠的血管出芽无促进作用。这表明SEMA6A的促血管生成作用完全依赖于内皮PRMT5的存在。SEMA6A-IDR过表达也上调PRMT5及糖酵解酶，而 Sema6A 缺失则抑制EC糖酵解和乳酸产生。

关键结论：SEMA6A-IDR相分离 → 招募RHOA/P300 → P300磷酸化激活 → H3K9la/H3K18la ↑ → PRMT5转录↑ → 糖酵解↑/乳酸↑ → 进一步促进SEMA6A相分离与P300激活。由此，一个由相分离驱动的、自我维持的组蛋白乳酸化-PRMT5-乳酸正反馈循环在病理性血管EC中建立。

内皮细胞角色：EC内SEMA6A相分离与PRMT5驱动的代谢/表观遗传循环紧密偶联，共同构成了维持病理性血管新生可持续性的核心机制。

图 5. Sema6A-IDR 通过 Prmt5 介导的乳酸生成与组蛋白乳酸化之间的正反馈调节血管生成

总结与展望：开辟抗血管新生治疗新疆界

本研究首次阐明：

1. 内皮细胞特异性组蛋白乳酸化修饰 (H3K9la/H3K18la) 在病理性血管新生中的核心作用。

2. PRMT5是乳酸化修饰的关键下游靶基因和循环放大器。

3. SEMA6A蛋白通过其IDR发生液液相分离 (LLPS)，形成“分子液滴工厂”，高效招募并激活乳酸化酶P300，是启动和维持整个恶性循环的上游引擎。

4. 揭示了“乳酸积累→相分离→表观遗传重编程→代谢重编程→更多乳酸”这一全新的、不依赖于HIF/VEGF的EC内在致病循环。

转化意义：

• 全新靶点： PRMT5抑制剂（已在癌症临床试验中）和靶向SEMA6A-IDR相分离（如开发相分离破坏剂）是极具潜力的抗病理性血管新生治疗新策略。

• 克服耐药： 靶向该独立于VEGF的通路，有望克服当前抗VEGF疗法的耐药性问题。

• 精准干预： 针对内皮细胞特异性机制，可能减少全身副作用。

这项研究不仅解开了缺血性视网膜病变中血管疯狂生长的深层密码（乳酸风暴、表观遗传编程、蛋白液滴工厂），更重要的是，它点亮了征服“血管幽灵”（病理性新生血管）、守护光明的全新希望。内皮细胞，这个血管的“守门人”，其内部精妙而危险的“分子舞蹈”，终于被我们窥见一隅，为未来精准打击病根奠定了基础。

论文出处：PNAS 2025 Vol. 122 No. 16 e2423677122