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科学网—氢气多功能医学效应 2024年英学位论文第一章 

第二章 设备、材料和方法 

2.1 设备和试剂

2.1.1 使用HydroVitality™水电解装置评估氧氢生成。

• HydroVitality™氧氢发生器（450 mL/min）（Water Fuel Engineering, Wakefield, UK）

• H2 Blue™（亚甲基蓝/铂纳米颗粒）（H2 Sciences Inc., Henderson, USA）

• Clarke型O2电极（Hannah Instruments Ltd., Bedfordshire, UK，目录号Opdo™ HI98198）

• Jenway™ 3510 pH计（Camlab, Cambridgeshire, UK，目录号SKU - 1140956）+校准标准品（pH 4，pH 7和pH 9.5）

2.1.2 种子处理

• HydroVitality™氧氢发生器（Water Fuel Engineering, Wakefield, UK）

• 豌豆种子（Pisum sativum seeds）（Thompson and Morgan, Suffolk, UK。目录号24298）

• 离心机（Microstar 17, Avantor™/VWR™， Leicestershire, UK。）

• 培养箱（LEEC, Nottingham, UK。精度190）

• NaCl（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号S1679）

• 琼脂糖（Agargel）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号A3301）

• 70%乙醇（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号493546）

• 手持式均质器

• 放射免疫沉淀（RIPA）裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA，目录号89900）

• 磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA，目录号18912014）

2.1.3 种子测定 - 铜离子还原抗氧化能力（CUPRAC）

• 微孔板分光光度计（Spectramax M2, Avantor™/VWR™， Leicestershire, UK。）

• 96孔微量滴定板用于微量滴定板测定。

• RIPA裂解缓冲液（见第2.1.2节）

• PBS（见第2.1.2节）

• Cuprac测定（Bioquochem, Asturias, Spain。目录号KF01005）

2.1.4 种子测定 - 铁离子还原抗氧化潜能（FRAP）

• 离心机（Microstar 17, Avantor™/VWR™， Leicestershire, UK。）

• 分光光度计Jenway™ 6300（Cole-Parmer, St. Neots, UK。目录号WZ-79000-64）

• PBS（见第2.1.2节）

• Fe2+（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号215422）

• Fe3+（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号236489）

• 2,3,5-三苯基四唑氯化物（TPTZ）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号1.08380）

• 无水乙酸钠（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号W302406）

• 乙酸（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号A6283）

• 醋酸缓冲液（无水乙酸钠/乙酸）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号S7899）

• 六水合氯化铁(III)（FeCl3·6H2O）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号F2877）

• RIPA裂解缓冲液（见第2.1.2节）

2.1.5 线虫处理

• NaCl（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号S1679）

• 线虫生长介质（NGM）：（17克Bacto琼脂粉（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号A5306），3克NaCl（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号S1679，2.5克Bacto蛋白胨（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号P5905），1毫升胆固醇（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号C3045 -（5毫克/毫升在乙醇中）），975毫升去离子水，0.5毫升CaCl2（1 M）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号C5670），1毫升MgSO4（1 M）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号83266），25毫升KPO4缓冲液（1 M）（108.3克KH2PO4（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号P3786），35.6克K2HPO4（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号P5629），蒸馏水至1升。

• PBS（见第2.1.2节）

• RIPA裂解缓冲液（见第2.1.2节）

• 液氮

• 过氧化氢（30% w/w）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号H1009）

• 培养箱（Inculine IL23, VWR™ Leicestershire, UK。）

• Microson XL超声波细胞破碎仪XL（Misonix, New York, USA。）

• 离心机（Microstar 17, Avantor™/VWR™， Leicestershire, UK。）

• UV/Vis分光光度计Jenway™ 6305（Cole-Parmer, St. Neots, UK。目录号WZ-99968-68）

• 显微镜（Brunel Microscopes, Chippenham, UK。目录号SP22）

• HydroVitality™氧氢发生器（Water Fuel Engineering, Wakefield, UK）

• 离心机（Microstar 17, Avantor™/VWR™， Leicestershire, UK。）

2.1.6 细胞培养：灭菌

• 含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的Roswell Park Medical Institute (RPMI) 1640培养基（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号R8758）

• 70%乙醇（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号493546）

• 高压灭菌器Priorclave/tactrol 2（Medline Scientific, Oxfordshire, UK）

2.1.7 细胞培养和处理

• H2发生器（Aukewel, Guangzhou, China。目录号ABS-XQ-O2）

• 0.5微米不锈钢扩散石（Filson Filter, Henan, China）

• TK6细胞 - 由英格兰西部大学的Dr. A. Thomas提供的细胞库培养

• 胎牛血清（FBS）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号F7524）

• T-75和T-25培养瓶

• 台盼蓝（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号302643）

• CytoSmart™细胞计数设备和软件（Axion Biosystems Inc., Atlanta, USA）

• CellDropFL荧光细胞计数器（DeNovix Inc., Wilmington, USA。目录号CellDrop FL-UNLTD）

2.1.8 流式细胞术

• 80%乙醇（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号493546）

• Accuri™ C6流式细胞仪（BD Biosciences, Berkshire, UK）

• 涡旋混合器（Cole-Parmer, St. Neots, UK。V系列Stuart，目录号WZ-04729-01）

• PBS（见第2.1.2节）

• 核糖核酸酶A（RNase A）（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号10109142001）

• 碘化丙啶（Sigma Aldrich, St. Louis, USA。目录号P4170）

2.2. 方法

2.2.1 生物信息学方法

使用Ensembl.com基本局部比对搜索工具 - 蛋白质（BLASTP）平台调查了复合体I蛋白亚单位与氢化酶之间的同源性。氨基酸序列来源于www.UniProt.com，而序列比对则使用Clustal Omega程序进行，序列同一性> 25%表明功能可能相似（Anderson和Brass, 1998）。在Expasy.org内使用Dotlet和ScanProtsite程序进行了蛋白质结构域的分析。

2.2.2 评估HydroVitality™氧氢发生器

2.2.2.1 流速

使用水置换法（图2.1）确定了HydroVitality™设备的气体输出体积。

图2.1 水置换法的图形表示。该图描绘了通过硅导管管道进入装有1升水的倒置瓶口的氧氢气体离开发生系统的情况。下方的碗中也装有水，并且获得了稳定的水压和水位。产生的气体将瓶中的水置换到碗中，一分钟后测量瓶中水的减少量，从而得出气体输出量（毫升/分钟）。

 （这简直是初中物理学实验的方法！！英国的博士，值得学习）

2.2.2.2 气体分析

HydroVitality™设备的气态输出分析外包给了SGS气体分析服务（Bristol, BS15 4PJ, UK）。由SGS气体分析服务的现场代表收集了750毫升的气体到一个密封的Tedlar®袋中，用于使用气相色谱进行测试（22/2/23）。

该公司（SGS）被要求测试多种污染物，即甲烷（CH4）、一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、硫化物（S）和氮气（N2）。

2.2.2.3 水中H2含量的测定

水溶液被注入玻璃Duran瓶中，在从容器中取出样品后替换盖子。瓶子在测量间暴露于室温（21±20°C）。使用滴定法计算溶解氢水平，其中向含有未知水平H2的6毫升水中加入H2 Blue™。H2 Blue™滴定利用亚甲蓝和胶体铂。

MB是一种常用的生物染料氧化剂，在铂催化剂存在下与溶解的分子氢反应产生还原形式（无色）的亚甲蓝：无色亚甲蓝，如反应1所示。

化学反应：MB（蓝色）+ H2 → 无色亚甲蓝（无色）

H2 Blue™与分子氢反应，在溶解的氢气存在下变清澈。随着额外的H2 Blue™滴入，溶解的H2内容被氧化直到完全耗尽。这被称为滴定终点。当达到终点时，额外的滴入不再变清澈，溶液将保持蓝色。清澈液体中的溶解H2含量可以用1滴（0.025毫升）清澈的H2 Blue™来计算，代表0.1毫克/毫升的H2浓度。为了考虑O2对H2的置换，记录结果乘以11米海拔高度下水溶液中H2的饱和点（1.6毫克/升）。

结果以毫克/升显示，相当于百万分比（ppm）。然而，学术界的许多研究使用各种浓度测量（Meng等人，2016；Dobashi、Takeuchi和Koyama，2020；Cheng等人，2021；Tanaka和Miwa，2022）。因此，这些差异可能阻碍了对H2剂量的全面理解，表2.1提供了一个转换指南。

2.2.2.4 水溶液中O2含量的测定

使用O2电极（Hannah Instruments Ltd., Bedfordshire, UK, Cat. #Opdo™ HI98198）进行O2测量。在注入后每5分钟记录一次，持续15分钟，然后在注入后30分钟进行最终记录。样品所处的实验室条件与第2.2.2.3节所述相同。

2.2.3 种子

2.2.3.1 存储

处理后，将种子在吸水纸上风干三小时，然后存放在冰箱（4°C）过夜。

2.2.3.2 种植和培养

在种植到填充有琼脂的培养皿之前，对种子进行称重和编号。这些培养皿用胶带密封，放入透明冷冻袋中，贴上标签，注明日期，并在光照强度等于1200 Lux的培养箱中培养。温度设定为23°C，湿度为85%，光周期设置为16小时光照和8小时黑暗，持续7天。

2.2.3.3 收获和清洗

使用无菌技术收获种子。然后将发芽的幼苗用ddH2O清洗，以去除多余的琼脂。种子在空气中干燥并称重，以记录其生物量数据供以后分析。

2.2.3.4 处理

在对主根进行任何切割之前，先清洁、干燥并称重种子，从中取1厘米用于分析。

2.2.3.5 确定NaCl在植物培养基中的影响

选择一种常见且相对健壮的Mangetout豌豆品种（Pisum sativum L. 'Oregon sugar pod'）进行实验分析（Neugschwandtner等人，2019年）。为了更好地理解H2对盐胁迫下发芽的幼苗的影响，需要先进行一项关于生长介质中NaCl含量的初步研究。按照制造商的指示制备Agargel™（7 g Agargel™/L水）作为对照组，同时添加50 mM或100 mM的盐（NaCl）来评估幼苗的相对生长情况。种子用溶解在蒸馏水中的氧氢预处理10分钟，空气干燥，然后放在冷藏单元（4°C）过夜后再种植。对照组种子不进行处理，但会在种植前过夜冷藏。

2.2.3.6 a 种子准备

按照Oyebanji等人（2009年）的方法，对Oregon Sugar-pod Mangetout种子进行表面灭菌。简而言之，用80%乙醇洗涤种子5分钟，然后空气干燥30分钟，再在4°C下冷藏。

使用无菌技术从储存容器中随机提取经过表面灭菌的种子，单独编号并称重后进行处理。每个培养皿上放置三颗种子，确保种子嵌入介质中，每个培养皿底部都标有编号以便于识别。

2.2.3.6 b 对照组

六个种子，每个培养皿三颗，以三角形配置放入两个含有0 mM、50 mM或100 mM NaCl的Agargel填充的培养皿中。

2.2.3.7 H2O

六颗种子分别浸泡在带有盖子的Bijou罐（7 mL）中，每个罐子含有4 mL蒸馏H2O，持续10分钟，空气干燥后，放入含有0 mM、50 mM或100 mM NaCl的Agargel填充的培养皿中。

2.2.3.7 HRW

使用HydroVitality™设备制备HRW。简而言之，将300 mL的ddH2O放入玻璃容器中，使用0.5微米扩散石浸泡30分钟。将4 mL的HRW分装到Bijou罐（7 mL）中，然后将种子放入处理10分钟，空气干燥后，再放入含有0 mM、50 mM或100 mM NaCl的Agargel填充的培养皿中。

2.2.3.8 抗氧化剂测定准备

从每颗种子中取出0.05 g（±0.02 g）的根部材料，放入含有2 mL RIPA裂解缓冲液的15 mL Falcon管中。使每个管中的内容物均匀化。溶液在600 x g下离心6分钟，将1 mL的细胞裂解物分装到1.5 mL离心管中。然后将每个管子快速冷冻在液氮中，之后存放在-20°C的冰箱中。对于抗氧化剂测定，立即收集裂解物进行分析。FRAP测定分析了七次实验数据重复，而由于试剂可用性，CUPRAC测定只评估了三次重复。

2.2.3.9 a 抗氧化剂测定 - CUPRAC测定法

这些实验数据是由在我的监督下（Grace Russell）进行的硕士研究生Bipana Dewan产生的。首先，制备了一个具有已知CUPRAC浓度的校准曲线（补充图1）。按照制造商的指示使用试剂（第2章，第2.1.3节）。抗氧化活性以µM Trolox标准表示。µM Trolox当量 = ((OD 450 nm-截距)/斜率) * 稀释因子。将96孔板在室温下孵育30分钟。使用微板分光光度计在450 nm处测量反应的吸光度（第2.1.3节）。

2.2.3.9 b 种子：抗氧化剂测定 - FRAP测定法

这些数据是由在我监督下由硕士研究生Bipana Dewan收集。首先，制备了一个具有已知FRAP浓度的标准曲线（补充图2）。种子的制备与上述CUPRAC协议相同。为了分析，将细胞裂解物在冰上解冻以防止过度酶活化。对于测定，将50 µl提取液与950 µl FRAP试剂混合。将混合物在室温下孵育30分钟。使用可见光谱分光光度计在593 nm处测量反应混合物的吸光度（Benzie和Strain，1996）（第2.1.4节）。

2.2.4确定氧氢气体给药对盐胁迫线虫的影响。

2.2.4.1 秀丽隐杆线虫：库存培养

为了分析不同NaCl浓度对秀丽隐杆线虫生长和繁殖能力的影响，使用无菌技术，将1平方厘米的库存Bristol N2株线虫（第2章，第2.1.5节）放置在含有标准（50 mM NaCl）NGM琼脂的中心圆形培养皿中，这一过程被称为“播种”（Brenner，1974）。然后，将培养物在22°C下孵育最少五天，最多十天。制备了四种NGM琼脂浓度（NaCl 25 mM/50 mM/100 mM/200 mM），代表亚优（25 mM）（Derycke等人，2007）、最优（50 mM）（Brenner，1974）和超优（100 mM/200 mM）（Xie等人，2012）盐度，并将新培养的线虫分转到每种浓度的五个平板上。这些培养皿再次放置在22°C的培养箱中至少五天。

2.2.4.2 用氧氢气体处理线虫。

为了评估气态氧氢给药对处于压力下的多细胞生物的效果，将线虫播种在含有25 mM/50 mM/100 mM/200 mM NaCl的相应琼脂平板上。然后将开放的培养皿放入一个密封的、有盖的容器（15 x 7 x 5 cm/650 mL）中，该容器连接到HydroVitality™生成装置30分钟（图2.2）。此后，将线虫返回到培养箱（22°C）中48小时，然后评估线虫的形态和繁殖能力。

图2.2：氧氢处理设备的示意图，描述了用于将氧氢引入活跃复制线虫大气中的装置。线虫暴露于氧氢（450 mL/min）30分钟，然后在显微镜下以40倍放大进行视觉评估之前，再培养48小时。

2.2.4.3 蛋白质提取

蛋白质提取方法使用了3 mL的PBS缓冲液来从琼脂表面清洗线虫。然后将1 mL的液体分装到1.5 mL离心管中，并以400 x g离心3分钟，形成一线虫沉淀物。移除上清液并丢弃。然后用1 mL的PBS洗涤线虫，以400 x g离心3分钟并移除上清液。用1 mL的HRW或1 mL的ddH2O处理线虫1小时。再次以400 x g离心含有线虫的管子3分钟。移除上清液并丢弃。向离心管中加入0.5 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，倒置管子5次并在冰上孵育5分钟。然后，在液氮中快速冷冻离心管，并在每次管子暴露于手持式细胞破碎器内的管子中进行三轮10秒的声波处理前部分解冻（第2.1.5节）。然后彻底解冻管子，并以600 x g离心10分钟。

2.2.4.4 过氧化氢酶测定

过氧化氢酶测定是一种高度敏感、简单且直接的测定法，用于测量各种生物样本（如细胞和组织裂解物或生物流体）中的过氧化氢酶活性。样品中存在的过氧化氢酶与过氧化氢（H2O2）反应生成水和氧气。未转化的H2O2与过氧化氢酶反应，降低溶液的光密度，这通过紫外光谱的240 nm处用分光光度计测量（Hadwan, 2018）。活性计算为每分钟每毫克细胞悬浮液蛋白质的摩尔浓度。摩尔浓度由光密度读数表示，这些值随后除以时间（分钟）。计算出的值再次除以H2O2在240nm处的消光系数，即43.6 M-1 cm-1（Zhang等人，2022）。

使用UV/Vis分光光度计，用装有PBS的石英比色皿（UV波长所需）校准仪器。向该比色皿中加入H2O2，直到吸光度达到0.55 - 0.52。从这个混合物中提取0.1 mL并丢弃。然后向PBS/H2O2溶液中加入0.1 mL线虫裂解物，并每隔10秒进行一次分光光度读数，持续180秒。

2.2.5 细胞培养和处理协议

2.2.5.1 细胞培养方法（库存培养）

从低温存储中取出1 mL TK6淋巴母细胞等分试样，并在室温下解冻约5分钟。使用无菌技术，向45 mL的RPMI培养基中加入4.5 mL的FBS。将这种“完整”培养基置于设定为37°C（5% CO2）的珠浴中。加热后，转移5 mL至无菌的50 mL Falcon管中。将1mL的细胞等分试样转移到50 mL Falcon管中并轻轻混合。然后，将此溶液转移到T-25细胞培养瓶中，并缓慢加入另外10 mL完整培养基。然后将瓶子放回同一孵育器中，在37°C（5% CO2）下培养48小时。

4.8小时后，从培养中取出培养物，并使用无菌技术向瓶中加入另外10 mL完整培养基。然后将瓶子替换回孵育器中再培养72小时。此后，使用无菌技术向培养瓶中加入额外的26 mL温热的完整培养基。将培养瓶放回孵育器中再培养72小时直至实验开始。

2.2.5.1 a 实验对照

在3 x T-25烧瓶中，每个烧瓶含有20 mL完整培养基，接种1.5 x 105个细胞/mL。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育。

2.2.5.1 b 急性（单次）处理

将60 mL非完全RPMI（无血清）培养基用氧氢（300 mL/min的H2+ 150 mL/min的O2）气体浸润30分钟。浸润后加入6 mL FBS，并向3 x T-25烧瓶中（每个烧瓶20 mL完整培养基）加入1.5 x 105个细胞/mL。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育，并在24、48和72小时时间点每天评估一次。所有实验均重复三次。

2.2.5.1 c 慢性（每日）处理

对于对照组和治疗组，每天向培养烧瓶中加入20 mL新鲜各自的培养基，即完整培养基/氧氢浸润的或未改变的完整培养基。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育，并在24（一次浸润）、48（两次浸润）和72小时（三次浸润）时间点进行评估。

2.2.5.2 灭菌

将铝箔包裹的硅胶管在120°C下高压灭菌15分钟，然后放在干燥架上超过1小时。在生物安全柜内，确保扩散石完全浸没在100 mL 70%乙醇中（图2.3 A-C），HydroVitality™氧氢发生器循环2分钟。用干净的手套，从管中取出扩散石，用塑料薄膜包裹，并在安全柜内与管道一起存放在密封容器中。所有进一步的过程都在无菌环境中使用无菌技术完成。

图2.3：消毒和注入方法的照片。从左到右：（A）显示了消毒和注入所需的设备（100mL乙醇；60mL罗斯威尔帕克纪念研究所1640（RPMI）细胞培养基；HydroVitality™氧氢发生器；6mm硅胶管（包在箔中）和0.5微米扩散石）。（B）展示了设备的消毒方式。（C）细胞培养基的注入。

2.2.5.3 氧氢注入

所有设备在使用前都用70%乙醇彻底消毒。为了评估将氧氢注入细胞培养基是否会对TK6细胞的存活和增殖有任何影响，使用HydroVitality™氧氢发生器（450 mL/min的氧氢）将60 mL的RPMI培养基在玻璃制的150 mL Duran瓶中注入30分钟。为了增加压力并改善氧氢到培养基中的注入，HydroVitality™设备通过6 mm硅胶管连接到一个0.5微米的不锈钢扩散石（图2.3 (C)）。注入后加入10%胎牛血清（FBS）。由于抗生素可能会影响基因表达和调控（Ryu等人，2017年），因此没有添加任何抗生素物质。

2.2.5.4 H2气体注入

在我的监督下，由硕士生Georgia Mannings进行的实验和生成的数据（Grace Russell）。注入需要通过无菌管道将H2气体鼓泡30分钟进入细胞培养基。

2.2.5.5 细胞计数：急性和慢性处理

在轻轻手动搅动细胞之前，从烧瓶中取出1 mL加入到无菌离心管中。然后将管子以400 x g离心5分钟，在管底部形成细胞沉淀。取出20 µL的沉淀细胞转移到96孔板中。向孔中加入20 µL的台盼蓝并使用移液管的动作混合均匀。取10 µL这种混合物滴到玻璃血球计数板上，并使用自动化设备和软件进行细胞计数和存活率评估（第2.1.7节）。

2.2.5.6 促有丝分裂剂的确定

在将TK6细胞暴露于促有丝分裂剂之前，进行了促有丝分裂活性的比较。为了测试氧氢的抑制效应是否会在促有丝分裂剂刺激下持续存在，测试了原发性B细胞（Pokeweed (PWM)）、T细胞（刀豆蛋白A (ConA)、植物血凝素 (PHA)）和非特异性促有丝分裂剂脂多糖（LPS）在促进TK6细胞增殖方面的效能（第6章，第6.5.3节）。

2.2.5.6 a 刀豆蛋白A

ConA是一种标准的淋巴细胞促有丝分裂剂，用于体外增强淋巴细胞的增殖（Paetkau等人，1976年）。细胞以与对照组相同的数量和条件种植。根据Yang等人（2020a）的改良方法，将1 mg的ConA溶解在1 mL的RPMI培养基中。将0.33 mL的等分试样加入到烧瓶中的20 mL培养基中，使每个烧瓶的最终浓度为0.016 mg/mL（16 µg/mL）。细胞以相同的数量（1.5 x 105 /mL）种植，并在相同的条件下（37°C/5% CO2）孵育24小时。进行了2次重复实验。

2.2.5.6 b 脂多糖

LPS是一种细菌毒素，存在于革兰氏阴性细菌的外膜中，作为一种普遍的非特异性促有丝分裂剂（Ziegler-Heitbrock, 1995）。根据Alzahrani等人（2022年）的方法改良，将5 mg的LPS溶解在1 mL的培养基中。将0.33 mL的等分试样加入到20 mL的细胞培养基中，使每个烧瓶的最终浓度为80 µg/mL。细胞以相同的数量（1.5 x 105 /mL）种植，并在相同的条件下（37°C/5% CO2）孵育24小时。进行了2次重复实验。

2.2.5.6 c 植物血凝素

PHA是一种从红肾豆（Phaseolus vulgaris）中提取的有毒的、结合糖的凝集素，是T细胞刺激活性的强效促有丝分裂剂（Nowell, 1960）。根据Maotoana、Burt和Goedhals（2023年）的方法改良，将1 mg的PHA溶解在1 mL的培养基中。将0.33 mL的等分试样加入到20 mL的细胞培养基中，使每个烧瓶的最终浓度为16 µg/mL。细胞以相同的数量种植，并在相同的条件下孵育24小时。进行了2次重复实验。

2.2.5.6 d 美洲商陆促有丝分裂剂

PWM是一种B细胞特异性的促有丝分裂剂（Mellstedt, 1975）。根据Portugal（2022年）进行的实验改编，将1 mg的PWM溶解在1 mL的培养基中。将0.33 mL的等分试样加入到20 mL的细胞培养基中，使每个烧瓶的最终浓度为16 µg/mL。细胞以相同的数量种植，并在相同的条件下孵育24小时。进行了2次重复实验。

2.2.5.7 流式细胞术

流式细胞术按照Riccardi和Nicoletti（2006年）设计的协议进行。简要地说，从每个培养烧瓶中取出1 mL的细胞悬液转移到1.5 mL离心管中。细胞在400 x g下离心5分钟。计数约200,000个细胞，并将相应体积的每个培养物随后转移到离心管中，在4°C下以400 x g离心5分钟。去除上清液，向每个管子中加入200 µL冰冷的PBS。将每个细胞悬液转移到冷冻管中。在涡旋的同时缓慢向每个冷冻管中加入1 mL冰冷的80%乙醇。样品在冰上放置10分钟以固定，并储存在-20°C下24小时。

在分析当天，将样品升温至室温（20°C ± 2°C），并向细胞中加入1 mL PBS。然后细胞在600 x g下离心5分钟，并去除上清液。每个样品用478.5 µl PBS和1.5 µl RNase A重悬。这在室温下孵育一小时。孵育后，向每个样品中加入20 µL碘化丙啶染料（50 µg / 1 mL (PBS)），并用箔纸覆盖离心管以防止光线进入。使用BD Accuri™ C6 Plus流式细胞仪进行流式细胞术。

2.2.6 统计分析

除非另有说明，所有数据均报告为均值（n = 3）和标准误差（均值±SEM）。使用Microsoft Excel™（2023）软件进行统计分析。进行了假设等方差的配对双样本t检验或方差分析（ANOVA），以确定组间的统计学显著差异。进一步分析采用Tukey-Kramer协议完成。统计学显著的数据定义为p <0.05。