The biology and management of NSCLC

在过去的二十年中，围绕非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治疗多次取得突破，提升了人们对该疾病的生物学基础、肿瘤发生的机制、早期诊断和多方疗法的理解。虽说酪氨酸激酶（Tyrosine kinase，TK）小分子抑制剂和免疫疗法的联合使用空前地提升特定患者的生活质量，可对NSCLC整体的治愈和生存率还是偏低，尤其是对已发生癌转移的患者治愈效果不明显。[1]

肺癌是最为常见的、致死的一类癌症，每年约有160万人死于肺癌，约85%在组织学分型上属于NSCLC，其中主要为肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）。与小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）相比，NSCLC的范围更广，病因也更为复杂，不过诱发肺癌的主要病因还是吸烟。在不吸烟的患者人群中女性更为普遍，主要分布在东亚，这与呼吸二手烟、环境污染、遗传特性等有密切关系。杜绝烟草相关产品的使用是全球范围内对抗癌症的关键方法之一，需有统筹规划。虽说如此，依然无法赢得抗肺癌的硬仗，需要有更多、更新、更厉害的手段。

Pie chart showing incidences of non-small cell lung cancers as compared to small cell carcinoma shown at right, with fractions of smokers versus non-smokers shown for each type[2]

日前人们尝试各种疗法，希望对复杂的病情有所缓解。在过去的二十年中，人们开发了多种靶向治疗的方法、免疫疗法，挑战依然存在，在癌细胞和正常细胞之间，总是存在一段模糊的界限，无法纯粹地将癌细胞清除。加上癌细胞多变的能力，后天获得了许多耐药突变的基因型，人们需要在这场博弈中与癌细胞竞争。

肺癌是一种分子多样性的疾病，对其生物学的深入了解利于人们开发更有效的治疗，其治疗方式已经由早期由医生的经验诊断转变为精准医疗，比如通过分析病人体内的遗传多样性决定选用哪种靶向治疗，通过检测患者的PD-L1水平来决定如何使用免疫检查点的阻断剂（immune checkpoint blockers, ICBs）等。与其他恶性肿瘤一样，肺癌也由多种拥有不同分子特征的细胞亚群组成，从而形成肿瘤内的多样性。较大的一组突变亚群可能与术后LUAD复发相关，意味着在肿瘤发生早期就存在遗传的多样性，抑制一种类型却无法阻止其他类型的肿瘤细胞增殖、转移。如此便突显出癌症早期诊断的重要性，可以尽早选用较为全面的治疗策略。

肺腺癌和肺鳞癌的细胞内基因发生突变的现象比较普遍，如果人们在体细胞中检测到KRAS（Kirsen rat sarcoma）和EGFR（epidermal growth factor receptor）的突变，一般在初始癌细胞中也会存在，人们可据此选择药物干预治疗。一般而言KRAS和EGFR的突变不会同时出现，一旦二者同时发生突变，KRAS的突变或许会使得细胞获得耐受靶向EGFR药物的能力。虽说ROS1和ALK（anaplastic lymphoma kinase）基因的重排率低于突变基因发生的平均水平，但他们可降低细胞对突变发生的选择压力，从而导致更多致癌基因的突变，这种情况常见于轻度吸烟和不吸烟的人群。相比肺鳞癌而言，肺腺癌中受体酪氨酸激酶发生突变的概率较高。[3]

肿瘤蛋白p53（tumor protein, TP53基因编码）的突变在进展性肿瘤中较为普遍，也反映该突变在肿瘤发生过程中的重要角色。相比而言，KRAS的突变频率在不同的肿瘤阶段中保持稳定，也一定程度上表明该基因对肿瘤的起始、早期发生过程中的作用。（NIH的官网有详细的肺癌的分级、治疗指导https://www.cancer.gov/types/lung/patient/non-small-cell-lung-treatment-pdq）

NSCLC的TK和mTOR信号通路、氧化压力反应、细胞增殖及细胞周期等关键步骤中的关键蛋白时常伴有突变发生，比如体细胞突变、纯合子缺失（homozygous deletion）、部分扩增、显著上调或下调某种基因（如AKT3，FGFR1，PTEN等）的表达水平等。LUAD中最为常见的如KRAS和EGFR，以及抑癌基因TP53， KEAP1， STK11和NF1等。LUSC中的TP53发生突变的比例很高（~90%），另一个抑癌基因CDKN2A（编码p16INK4A和p14ARF蛋白）很多情况下因为甲基化修饰（~21%）、失活突变（18%）、外显子切除（4%）或纯合子缺失（29%）而失活。

Alterations in targetable oncogenic pathways in LUAD and LUSC[1]

基因的改变不仅造成了细胞的多样性，也相应导致了特异的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。NSCLC中的突变率是比较高的，可以按每MB的碱基序列中发生的突变数目计算，尤其在吸烟的人群中的患者占了绝大多数。总的来说，恶性肿瘤中的突变率明显高于发病早期的肺损伤。一些突变会诱发新抗原的形成，而被自身的可侵袭肿瘤的毒性T细胞识别，肺腺癌中高浓度的新抗原压力常常伴有炎症的微环境，富集了许多活化的效应T细胞，表达的蛋白可参与抗原递呈、调节T细胞迁移（CXCL-10，CXCL-9）、影响效应T细胞功能等，也会编码负调节T细胞功能的蛋白，如PD-L1、PD-1和LAG3（lymphocyte activation gene 3）等。针对这种现象，人们看到了ICB的成功案例。

在过去的20年中人们不断摸索NSCLC的治疗方法，早期铂类加细胞毒疗法的方案常被用于体能状态良好的晚期NSCLC患者的治疗，该方法中大部分的上市药物均对肺癌表现一定的疗效，只是Pemetrexed对肺鳞癌的效果稍弱一些。后来人们研制出血管表皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的单克隆抗体，Bevacizumab和靶向EGFR的单抗Necitumumab，大大提高了肺鳞癌患者的存活率。在二线疗法中，标准治疗中人们渐渐采用Docetaxel和VEGFR-2单抗的联用的方式。

细胞毒性治疗方案在癌症早期的非常有效，在I期到II期，有些IIIA的NSCLC患者需要选择手术切除。尽管人们选择根治手术（curative intent），依然有许多患者的病情会复发，一般而言，IA和IIIA期患者5年内的存活率大概为83%和36%，药物辅助铂类治疗方案改善了II期和IIIA期患者完全切除的术后存活率。早期的治疗效果也随着手术手段、自动化仪器升级、可视放射性疗法设备以及立体定向和超级分馏方法的出现得到改善。 对于不可切除的晚期肿瘤，标准疗法是细胞毒联用胸部放射疗法，存活率要高于分步治疗方案。

肺癌之所有如此高的死亡率，主要由于在大部分患者体内发生恶性转移的现象，这也显示对肺癌的治疗需要从整体考虑，系统治疗。NSCLC的分子靶向疗法在上世纪九十年代初面市，人们研制的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）Gefitinib表现出治疗效果，在非选择性人群中，反应率（response rate）约为10%，主要是东亚地区不吸烟的女性。后来的Erlotinib，另一种EGFR的TKI，也一定程度上提升了存活率，但回顾性分析发现经过该方法治疗的人群中发生EGFR突变的现象，[4]接着ALK基因重排、ROS1基因融合、BRAF突变的现象接连被发现。[5]一个关键的进步是在2015年美国FDA批准了ICB的Nivolumab用于铂类治疗中或后期疾病进展的患者，开启了肺癌免疫疗法的新局面。

NSCLC治疗大事记：

1997年，EGFR抑制剂进入临床试验；

2000年，Docetaxel（多西他赛；多烯紫杉醇，launched by Sanofi）用于NSCLC二线疗法；

2004年，在肺腺癌中发现EGFR基因突变，对Gefitinib（吉非替尼，launched by AstraZeneca）和erlotinib（埃罗替尼，launched by Genentech）敏感。

2006年，Bevacizumab（贝伐单抗，人源化单抗，Anti-VEGF Signal Transduction Modulators Angiogenesis Inhibitors，launched by Genentech）与细胞毒疗法联用于NSCLC一线治疗；

2007年，发现NSCLC中ALK基因重排现象；

2008年，Pemetrexed（培美曲塞，a dihydrofolate reductase inhibitor，launched by Lilly）在肺腺癌一线疗法中有活性；

2009年，发现Gefitinib的治疗效果优于细胞毒疗法；

2010年，发现Crizotinib（克唑替尼，a dual inhibitor of hepatocyte growth factor receptor kinase and ALK， Leu1196Met Mutant， launched by Pfizer）在ALK阳性的NSCLC的一线疗法中优于细胞毒疗法；

2012年，在肺腺癌中发现RET和ROS基因融合的现象；Nivolumab（纳武单抗，a fully human monoclonal IgG4 antibody against PD-1，launched by Ono, BMS）对NSCLC有效；

2014年，发现Crizotinib对ROS-1阳性的NSCLC有效；

2015年，Osimertinib（奥斯替尼，Signal Transduction Modulators EGFR-T90M Inhibitors，launched by AstraZeneca）对突变体EGFR-T90M有效；免疫检查点阻断剂在NSCLC二线疗法中优于Docetaxel的治疗；

2016年，Pembrolizumab（也称Keytruda，anti-PD-1, Launched by Merck）用于治疗NSCLC；

2017年，Alecinib（艾乐替尼，ALK inhibitor, launched by  Chugai Pharmaceutical）

Timeline illustrating the development of targeted therapies and immunotherapies for the treatment of NSCLC over two decades.[1]

随着人们对病人基因组学的分析，发现了可靶向抑制的基因突变。根据肺癌突变联盟（lung cancer mutation consortium）的数据分析，致癌基因的突变患者比例高达64%，对肿瘤进行基因分型可以帮助人们实现个性化治疗，可现在提升特定人群的存活率。

EGFR

EGFR（也称ErbB-1，HER1）属于受体酪氨酸激酶家族，该家族中还有HER2/neu (ErbB-2)、HER 3 (ErbB-3) 和 HER 4 (ErbB-4)。该受体包括4个结构域：胞外区、跨膜区、酪氨酸激酶结构域和羧基尾端。配体的结合会诱导EFGR二聚化、羧基端酪氨酸的磷酸化，激活下游信号通路，影响细胞增殖、存活、侵袭和血管的发生。酪氨酸激酶ATP的结合结构域发生杂合性（heterozygous mutation）的突变会导致不依赖配体的组成型活化的EGFR通路。目前耐受EGFR药物中最为常见的是EGFR外显子19的缺失和外显子21中的无意突变（L858R）。[6]

Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathway （From Wikipedia）

第一代EGFR TKI是可逆地特异性抑制EGFR与ATP的结合，包括Gefitinib和Erlotinib，在EGFR基因突变的患者体内相比传统的细胞疗法表现出更高的客观缓解率（objective response rates, ORRs）和无进展生存期（progression-free survival, PFS）。第二代的小分子抑制剂以不可逆的方式抑制EGFR的活性，并且也可抑制HER2和HER4，包括Afatinib和Dacomitinib，二者的治疗效果相比Gefitinib而言提升了PFS。对EGFR外显子19的缺失的患者，Afatinib相比铂类细胞毒疗法明显地提升了总存活数（overall survival, OS）的平均水平，但对于L858R的患者却无明显优势。这可能与这两类基因突变对应的EGFR构象不同，从而对ATP结合位点和自身磷酸化的影响各异。[7]

经过一代疗法治疗的患者依然存在获得性耐药性，主要的突变发生在外显子20内部——T790M。该突变直接影响一代药物的疗效，有的增加对药物的位阻现象（steric hindrance），有的提高了ATP对酪氨酸激酶的亲和力，也有存在HER2基因扩增，MET、BRAF、 PIK3CA基因突变和SCLC转化的现象，这也间接显示药物治疗过程中也要检测肿瘤基因的变化，以便及时更改后续疗法的方案。第三代靶向药物，如Osimertinib（AZD9291）、Rociletinib（CO-1686）、Olmutinib（BI1482694/HM6171），不仅能抑制野生型，也能克服EGFR敏感突变和 T790M突变引起的肿瘤耐药性。

后续的跟踪检测发现肿瘤细胞出现耐受第三代药物的突变，C797S与EGFR敏感突变共同存在的情况耐受Osimertinib，却对Gefitinib和Afatinib依旧敏感。三种突变共同存在的情况下表现出对目前三代药物的普遍耐受性。目前的第四代药物EAI045可变构抑制C797S突变的EGFR，包括EGFR敏感突变L858R，in vitro 和in vivo的结果显示出较好的活性。[8]此外，Brigatinib（orally-available ALK, IGF-1R and EGFR inhibitor，launched by Ariad Pharmaceuticals in 2017）与cetuximab联用可抑制del19的突变的肿瘤。[9]

ALK

ALK基因编码一个跨膜的受体酪氨酸激酶，在脑部发育过程中发挥关键作用，其他功能或机理却不十分明确。在ALK基因重排的过程中，常常与EML4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4）基因发生融合（EML4-ALK）。Crizotinib是口服的与ATP竞争结合ALK蛋白的小分子抑制剂，在治疗或未治疗的患者中的疗效均明显高于细胞毒疗法。经过Crizotinib治疗的大部分患者对二代药物均有反应，如Ceritinib, Alectinib和 Brigatinib。

细胞产生对ALK抑制剂的耐药性主要原因是ALK基因发生改变，比如发生突变、扩增，也可能细胞利用其他通路绕道而行，比如EGFR、MAPK等。对二代药物产生耐药性的细胞中多数存在新的突变，G1202R，体外实验的数据显示对目前所有的二代ALK抑制剂都有一定的耐受，不过目前第三代药物Lorlatinib对多数ALK的突变均有效果。[10]

ROS1

ROS1编码的受体酪氨酸激酶与一些基因（如CD74）融合的时候也会变成组成型活化，鉴于ROS1和ALK有高度同源的活性中心，通常用于治疗ALK阳性的肿瘤时靶向ALK的药物对ROS1阳性的肿瘤也有活性，如Crizotinib, Ceritinib和Lorlatinib等。针对此靶点耐受现象主要与突变G2032R、野生型EGFR通路活化、KRAS和KIT突变有关。[11]

Other alterations

在绝大多数BRAF突变的NSCLC患者中，外显子15内常发生V600E的突变，Vemurafenib（维莫非尼，launched by Genentech and Plexxikon）和Dabrafenib（达拉菲尼，launched by Novartis）对携带这类突变的患者有效。还有一些潜在的靶点，如HER2的突变、原癌基因RET、NTRK-1、-2、-3等。虽说靶向TRK的抑制效果比较显著，在治疗期间多数会产生耐药性，需要继续开发下一代的药物，路漫漫，仍需不断坚持、创新。

Immunotherapy

利用宿主自身免疫反应治疗癌症已不是新概念，靶向CTLA-4和PD1或PD-L1的单抗开启了治疗肺癌的新篇章。首个被FDA批准的ICB是Ipilimumab（launched by BMS），是阻断CTLA4的人源免疫球蛋白G1单克隆抗体，用于治疗转移性黑色素瘤。[12]肿瘤发生的过程中会表达PD-L1，与PD1结合后会“伴成自我”阻止T细胞对肿瘤抗原的识别，以确保自身的增殖和转移。阻断该情况下的PD1和PD-L1的结合回复T细胞介导的抗肿瘤免疫能力。目前已获批或在研的ICBs主要有抗PD-1的抗体Nivolumab（人源IgG4）和Pembrolizumab（人源化的IgG4），抗PD-L1的抗体Atezolizumab（人源IgG1，Fc段经改造后降低抗体介导的细胞毒性）、Durvalumab（人源IgG1）和Avelumab（人源IgG1，临床前期结果显示抗体介导的细胞毒性）等。晚期NSCLC的患者经一线细胞毒疗法后依然进展的患者可用ICBs作为标准疗法，Nivolumab可明显延长平均生存期，后续也发现Pembrolizumab和Atezolizumab也可改善生存期。

如今在一线疗法中，Pembrolizumab可被用于晚期或转移的NSCLC，患者肿瘤内的PD-L1表达的水平需要达到或高于 50%，该治疗方案相比铂类细胞毒疗法而言可明显提高ORRs，PFS和OS。不过在较低水平PD-L1（~5%）患者体内Nivolumab的效果不明显。细胞毒疗法可协同ICBs杀伤肿瘤细胞，提升T细胞/肿瘤细胞比率，恢复代谢限制，提升T细胞在肿瘤中的活性。细胞毒疗法也可降低肿瘤细胞释放的免疫抑制因子，或提高可递呈抗原的浓度，扩大抗肿瘤的T细胞效应等。相比单一的细胞毒疗法，Pembrolizumab、Carboplatin和Pemetrexed三联用可大幅度提高ORRs和PFS，该方法试用于在肺鳞癌中耐受一线疗法的患者。

Current and investigative treatment options for advanced or metastatic NSCLC.

在高水平的PD-L1或非同义肿瘤突变压力（tumor mutation burden，TMB）下，ICB的单一疗法比较有效，可是若T细胞数较少或较低的TMB，或许应该选择另一种方案诱导免疫原型的肿瘤细胞死亡，如细胞毒疗法、表观遗传修饰或溶瘤病毒法目前在临床前模型或Phase I临床试验早期的结果有些希望。另一个策略包括与抗血管生成的药物联用，因为VEGF可通过募集免疫抑制细胞（如髓源性抑制细胞myeloid-derived suppressor cells、调节T细胞）导致免疫耐受的肿瘤微环境，并且血管生成抑制剂也可以上调免疫细胞的渗入能力。

若肿瘤拥有较低的TMB、较少的T细胞、较低的PD-L1表达水平，这种肿瘤也被称作“冷肿瘤”（cold tumor），选用免疫疗法时就不仅仅是将T细胞引入TME，也需要递呈肿瘤的抗原给T细胞。针对此种情况目前比较火热的细胞疗法很有潜力，昨晚无意中看到的一部2017年的电影，药物治疗、化疗对小孩子的急性白血病（acute lymphocyte leukemia, ALL）都没有作用，最终却是将血液中的免疫细胞改造后再注入体内循环治愈了这个ALL。

看似比较强大的ICB，不过肿瘤细胞依然产生了一定的耐药性，主要是因为IFN-γ通路的缺陷、MHC复合体递呈有问题、也有很多数据显示IDO1（indoleamine-2,3-dioxygenase 1）活性上调，降低了T细胞外的色氨酸含量，从而抑制了T细胞功能。还有更多和免疫相关的靶点，都是为了打造精良的武器（免疫系统），来清理潜在的敌人（肿瘤细胞）。

后记

上学的时候觉得病毒和宿主的博弈已让人费尽脑筋，虽说病毒是外源物，可是一旦进到宿主细胞中会充分的利用细胞里的成分武装自身，更别提直接攻击免疫细胞的病毒了；肿瘤感觉更是复杂，起初都是“良民”，即使病变也和“百姓”水乳交融，难以分割，不好识别，更别提清理。值得一提的是最近短短的几年时间，人们在癌症免疫疗法上数次取得突破性进展，不得不赞叹如今科技变革的速度。在一次次提升PFS的同时，肿瘤也在不断进化，人们设计药物的能力和手段也在提升。看似永无止境，终究会是“魔高一尺，道高一丈”。

TJ

2018年5月13日 星期日

Reference

1.            Herbst, R.S., D. Morgensztern, and C. Boshoff, The biology and management of non-small cell lung cancer. Nature, 2018. 553(7689): p. 446-454.

2.            Stacey A. Kenfield, S., Esther K. Wei, ScD, Meir J. Stampfer, MD, DrPH, Bernard A. Rosner, PhD, and Graham A. Colditz, MD, DrPH, Comparison of Aspects of Smoking Among Four Histologic Types of Lung Cancer. Tob Control, 2008. 17(3): p. 198–204.

3.           Reck, M. and K.F. Rabe, Precision Diagnosis and Treatment for Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 2017. 377(9): p. 849-861.

4.            Lynch, T.J., et al., Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med, 2004. 350(21): p. 2129-39.

5.            Rikova, K., et al., Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell, 2007. 131(6): p. 1190-203.

6.            Sharma, S.V., et al., Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer, 2007. 7(3): p. 169-81.

7.            Okabe, T., et al., Differential constitutive activation of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cells bearing EGFR gene mutation and amplification. Cancer Res, 2007. 67(5): p. 2046-53.

8.           Wang, S., Y. Song, and D. Liu, EAI045: The fourth-generation EGFR inhibitor overcoming T790M and C797S resistance. Cancer Lett, 2017. 385: p. 51-54.

9.            Uchibori, K., et al., Brigatinib combined with anti-EGFR antibody overcomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. Nat Commun, 2017. 8: p. 14768.

10.          Shaw, A.T., et al., Lorlatinib in non-small-cell lung cancer with ALK or ROS1 rearrangement: an international, multicentre, open-label, single-arm first-in-man phase 1 trial. Lancet Oncol, 2017. 18(12): p. 1590-1599.

11.          Gerlinger, M., L. Norton, and C. Swanton, Acquired resistance to crizotinib from a mutation in CD74-ROS1. N Engl J Med, 2013. 369(12): p. 1172-3.

12.          Hodi, F.S., et al., Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med, 2010. 363(8): p. 711-23.