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以图位克隆技术克隆基因,分子标记的开发与筛选是关键步骤之一,差异明显的分子标记在数据统计上一清二楚,不容易出错,如果能够以琼脂糖胶来分辨,更是极大的节约了实验时间。现在随着高通量测序技术的发展,获得一个物种完整基因组变得越来越容易,因此分子标记的开发也不再是什么难事。结合这几年的研究工作,来说一下目前最经常用到的SSR和InDel分子标记的开发与筛选,自己的一些心得体会,以玉米为模式生物基因克隆过程中标记的开发为例。
先说个题外话,很多刚刚接触分子标记的人,常常会问到底什么是分子标记?多态又是什么?举个简单例子,你出门去某个地方,查询得知,要经过一座大桥,一个公园,一个别墅小区,一栋99层的大楼,这些大桥、公园、小区、大楼就是你到目的地前首先要找标志性建筑,在基因克隆上就是所说的分子标记。那么什么是多态呢?所谓多态其实就是差异性。月季花应该都见过,有白色的、有黄色的、有红色的,这些颜色上差异就是多态,只不过这个多态是形态学上的多态。如果说到这里还不是很明白,不用着急,当你亲手做一段时间后,自然就会明白什么是分子标记了。
SSR(Simple Sequence Repeats)简单重复序列,又称之为微卫星DNA,在拟南芥、玉米、水稻、小麦、烟草等植物中非常丰富,因此被广泛用来基因定位、亲缘分析等。其串联重复的核心序列为1—6 bp,重复单位数目不一样,高度多态性就是来源于其串联数目的不同,因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,就能够显示出差异性。
克隆一个基因首先要对其粗定位。在玉米中,如果一个基因在哪条染色体上还未知,可先进行全基因组的筛选。我要克隆的基因,前人已经粗定位于4号染色体两个分子标记之间,但这个定位并不准确,只是一个参照。所以当我接手这个基因后,首先在这两个标记上下游延伸了40M的距离,在玉米数据库MaizeGDB上重新挑选了一些SSR标记,对其区间进行了确认。
对这个基因粗定位了以后,此时数据库上前人开发的标记已不能满足定位需求。根据粗定位区间,在其内挑选了一些BAC,在这些BAC上开发SSR标记。BAC的序列可以在MaizeGDB或者NCBI上获取。
BAC序列截图:
在获得这些BAC序列后,接下来就要找到SSR的位点在哪里,有很多工具可以利用,网上有在线的SSR序列分析。我一般都是使用SSR Hunter1.3进行SSR位点的搜寻,该软件简单实用,参数设置只有两个:构成重复元件的核苷酸数最多是,重复次数最少为。可根据对标记的需求来设置。
SSR Hunter1.3界面:
将得到的BAC序列输入到SSR Hunter1.3左边方框中,设置好参数,点击“SSR位点搜索”就可以了。
搜索结果如下,点击保存。
acaaatgacaaacatggtgaacgaaatgcaaaatcagataaggcaagaatgccaggaaatgcgtcaagaccggctggagatgcgtcaagaaatgaggcaagcacggttggaaagacaacagcaccaccacccaccaccaactccaccaagATATATATATATATATATATtactatttgtaagacctaaatgttactttagttagtagttaatattttactattttaggaataataataaggtctattaaccctatgtgttgctatgcatcatgctgagatttttatttatgcatacattcggagacaacattattatac
红色字体即为SSR位点,在得到这些SSR位点后,就可以直接拿来设计引物,引物设计软件很多,我一般习惯使用NCBI的在线引物设计,因为玉米的基因组序列已存在,当其设计好引物后,会自动在数据库里搜索一翻,如果匹配到其他位点上,给出的引物报告单会自动注明,可以选择是否用该标记。
SSR引物设计时PCR产物选择多大呢?我们一般都是80-150bp,这样扩增时不但丰度很高,扩增后信号很强,避免了非特异扩增,而且在选择电泳时,我们以小板胶来跑,EB染色,比设计300-500bp,用大板胶跑,银染节约了很多的时间。
有多态的分子标记:
小板胶来跑,EB染色电泳图:
大板胶来跑,银染色电泳图:
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