血脑屏障芯片在腺相关病毒跨膜运输机制研究

中的应用

原载“大橡科技”公众号 

关键词：器官芯片（OoC）、血脑屏障（BBB）、腺相关病毒（AAV）、LY6E蛋白，病毒载体

引言

血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）选择性地控制循环血液与中枢神经系统（CNS）之间的分子交换，并维持脑内液体稳态。但其高选择性和半通透性源也极大限制了静脉给药的治疗性药物向脑组织的递送，成为中枢神经系统疾病治疗的主要障碍，研究能够穿越BBB的药物载体意义重大。

在众多候选载体中，腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）因其无毒性、低免疫原性及可在体内长期表达等特性，被视为基因治疗的理想载体。其中，AAV9、AAVrh10等血清型可穿越BBB，但缺乏脑靶向性。

过往有研究开发出AAV-PHP.B和AAV-PHP.eB血清型，穿越BBB的效率较AAV9提高约40倍。然而，这种高效穿越依赖于小鼠的受体蛋白淋巴细胞抗原-6A（LY6A），但人类基因组中尚未发现LY6A的同源物。这凸显了开发一个能够精确模拟人类BBB结构和功能的体外模型的迫切性。

过往，体外BBB模型主要依赖于在胶原蛋白包被的Transwell板两侧分别培养脑微血管内皮细胞（BMECs）、星形胶质细胞或周细胞的静态系统。然而，这种系统过于简化，无法模拟血管微环境中的动态机械力以及理化信号。

近年，器官芯片（Organ-on-a-Chip）技术的突破为更精确地模拟体内组织环境（包括BBB微环境）提供了可能。

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研究亮点

1. 器官芯片构建：提出并验证了一种可用于体外研究人类血脑屏障的器官芯片。

2. 器官芯片优势：操作简便、通量高，并可通过精密摇床精确控制摇动角度和速度，以模拟体内的流体剪切力。

3. 概念验证：研究揭示了LY6E蛋白与AAV-PHP.eB的相互作用，并初步证明其在体外模型中可能促进AAV-PHP.eB穿越血脑屏障。

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研究内容

1. BBB模型的设计与构建

图1 清晰地展示了该研究的核心平台。天然BBB（a）结构包括内皮细胞、紧密连接、星形胶质细胞、细胞外基质和周细胞。本模型包括：一个包含培养基储存层、用于接种细胞的上腔室、分隔上下层的PET膜以及用于接种细胞的下腔室的集成仿生阵列芯片。芯片包含24个独立的功能单元，每个单元由上、下两个腔室组成。图中还展示了芯片的横截面，说明星形胶质细胞在上腔室形成“神经腔”，而内皮细胞在下腔室倒置接种形成“血管腔”。最重要的是，图1d 展示了如何通过匹配的精密摇床，以30°倾角和每分钟2次的转速振荡芯片，从而模拟人体内脑微血管中的血压和血流，这是该研究芯片模型区别于传统静态Transwell模型的关键创新点。

模型构建过程：首先对芯片进行紫外线灭菌和PBS亲水处理。随后，使用0.3 mg/mL的大鼠尾胶原溶液对芯片通道进行包被，以模拟基底膜。接着，将浓度为2.5×10⁶ cells/mL的HA-1800星形胶质细胞悬液（10 μL）接种到上腔室，静置2小时使其贴壁，然后在摇床上进行为期2天的动态培养。之后，将浓度为1×10⁷ cells/mL的hCMEC/D3细胞悬液（10 μL）接种到下腔室，将芯片倒置静置2小时以使细胞贴附在膜的下表面。最后，将芯片恢复直立，加入培养基，并在摇床上（2 cycles/min, 30°倾角）进行动态培养，每天更换培养基。

图1 人血脑屏障（BBB）的结构及体外芯片血脑屏障模型的建立。(a)BBB的结构和组成示意图，包括内皮细胞、微血管内皮细胞间的紧密连接、星形胶质细胞、细胞外基质和周细胞。(b)芯片设计的示意图，包括培养基存储层、用于细胞接种的上室、分离上下层的PET膜以及用于细胞接种的下室。(c)BBB芯片的横截面图。星形胶质细胞接种在上室以建立神经室，脑微血管内皮细胞倒置接种在下室以形成血管室。(d)示意图说明血管室中流体剪切力的模拟。芯片中接种的细胞在匹配的精密摇床上培养，摇床以30°倾斜角和2转/分钟的速度振荡，模拟脑微血管生理条件下的血压和血流。

2. 屏障完整性和功能的表征与比较

通过将该芯片培养结果与传统Transwell模型的对比，该研究全面验证了该芯片模型的优越性。如图2所示的结果表明，与传统的Transwell模型相比，新构建的动态BBB芯片模型具有更高的TEER值（图2a），更低的小分子通透性（图2c），并且免疫荧光染色结果显示共培养的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞在动态模型中紧密连接蛋白ZO-1（图2b）和星形胶质细胞标志物GFAP（图2d）的表达更高。这些发现表明动态BBB芯片模型在模拟体内BBB的结构和功能方面具有显著优势。数据显示，该研究构建的BBB芯片模型，能够提供比传统静态模型更严格、更生理相关的屏障功能。

图2 血脑屏障模型的表征与比较。(a)监测7天连续时间内血脑屏障模型的细胞跨膜电阻（TEER）。(b)免疫荧光染色检测ZO-1紧密连接蛋白表达；A–C：含hCMEC/D3细胞的Transwell，D–F：共培养Transwell，G–I：含hCMEC/D3单层的芯片，J–L：含星形胶质细胞-hCMEC/D3双层的芯片。蓝色，DAPI染色的细胞核；绿色，FITC染色的ZO-1蛋白；比例尺：50μm。(c)小分子通透性实验，将荧光素钠（FLU）溶液或分子量分别为40kDa或70kDa的FITC-葡聚糖溶液加入各血脑屏障模型的血管室。孵育2小时后，通过荧光分光光度法检测各模型神经室中采样液体的荧光信号。结果为3次独立实验的平均值±标准差。显著性由双因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey多重比较检验的平均值比较确定。*表示P < 0.05，***表示P < 0.005，****表示P < 0.0001。(d)共培养芯片模型中星形胶质细胞中GFAP蛋白的免疫荧光染色。蓝色为DAPI染色的细胞核，绿色为FITC染色的GFAP蛋白；比例尺：50 μm。

3. AAV-PHP.eB在体外穿越人类BBB的效率

这部分是该研究的核心发现之一，研究者首次在体外人类BBB模型中系统比较了不同AAV血清型的穿越能力。图3的结果表明：AAV-PHP.eB和AAV9均能穿过人类血脑屏障（BBB），且AAV-PHP.eB的效率是AAV9的两倍（图3 a、b）；在AAV2、AAV9和AAV-PHP.eB穿过BBB的过程中，均未对BBB的完整性（通过TEER测量）产生显著影响（图3 c）。结果表明AAV-PHP.eB可作为穿越人类BBB进行基因递送的有力候选载体。

图3 BBB芯片和Transwell模型中AAV血清型跨血脑屏障效率的比较。每种AAV血清型的悬液分别加入血管室。在48小时内，从每个模型的神经室中采集培养基样本，并通过qPCR测定AAV滴度。(a)Transwell双层模型中神经室中的AAV2、AAV9和AAV-PHP.eB滴度。(b)BBB芯片双层模型中神经室中的AAV2、AAV9和AAV-PHP.eB滴度。(c)加入AAV后TEER值的变化。芯片在第一天接种。结果显示3次独立实验的平均值±SD。显著性由双因素方差分析后进行Tukey多重比较检验。*表示P < 0.05，**表示P < 0.001，***表示P < 0.005，****表示P < 0.0001。

4. AAV-PHP.eB与LY6E蛋白的直接结合

设计ELISA实验直接检测AAV衣壳蛋白与重组LY6E蛋白的结合能力。如图4结果所示，重组LY6E蛋白能够与AAV-PHP.eB高亲和力结合，而与AAV2或AAV9的结合则明显较弱。这一结果强烈提示，AAV-PHP.eB衣壳能与LY6E蛋白在体外发生特异性相互作用，支持LY6E可能作为其受体或共受体的假说。

图4 AAV-PHP.eB可与LY6E蛋白结合。（a）hCMEC/D3细胞中LY6E的免疫荧光染色代表性图像。蓝色表示DAPI染色的细胞核；绿色表示FITC染色的LY6E蛋白，比例尺为50 μm。（b）ELISA检测AAV2、AAV9或AAVPHP.eB与人LY6E蛋白的结合情况。结果显示3次独立实验的平均值±SD。显著性通过双因素方差分析确定，然后使用Tukey多重比较检验进行均值比较。****表示P < 0.0001。

5. LY6E介导AAV-PHP.eB穿越人类BBB的功能验证

图5展示了LY6E对AAV-PHP.eB穿越BBB的影响。在hCMEC/D3细胞中，通过siRNA沉默LY6E后，与AAV-PHP.eB结合的病毒颗粒数量显著减少（a），表明LY6E可能作为受体或辅助受体与AAV-PHP.eB结合。在双层模型的BBB芯片中，沉默LY6E对细胞跨膜电阻没有显著影响（b），说明siRNA对屏障功能无影响。然而，与未沉默的对照组相比，沉默LY6E的组中穿越BBB的AAV-PHP.eB粒子数量减少了约50%（c），表明LY6E促进了AAV-PHP.eB穿越人类BBB。

分子对接模拟进一步显示，AAV-PHP.eB与人类LY6E蛋白之间的结合能（d），与小鼠LY6A与AAV-PHP.eB之间的结合能（e）相当，从理论上支持了LY6E是人类中的LY6A同源物。

图5 AAV-PHP.eB穿越血脑屏障受LY6E水平影响。(a)AAV-PHP.eB与hCMEC/D3细胞结合，或经siRNA沉默LY6E后结合。(b)在血脑屏障芯片的双层模型中，监测经或未经siRNA干扰LY6E的跨膜电阻（TEER）的连续变化。(c)比较神经室中AAV-PHP.eB滴度，表明血脑屏障的穿越情况，或双层模型血脑屏障芯片中经或未经LY6E沉默。(d)AAV-PHP.eB（蓝色）与人类LY6E蛋白（灰色）的分子对接模拟。(e)AAV-PHP.eB（蓝色）与小鼠LY6A蛋白（灰色）的分子对接模拟。结果为3次独立实验的平均值±标准差。显著性由单因素方差分析后，采用Tukey多重比较检验进行均值比较。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。

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结论与展望

该研究成功开发了一种新型的体外人类血脑屏障模型。该模型通过在高通量微孔板中对人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞进行共培养，并利用摇床产生流体压力来驱动双向液体流动，从而模拟毛细血管中的血流。流速可通过调整倾斜角度和摇动速度来精确控制。与需要泵或复杂管道系统的其他模型相比，该研究的芯片设计避免了这些复杂性，同时提高了通量和用户友好性。

实验中BBB芯片模型、重力精密摇床可以提供持续的周期流体剪切力，精密跨膜电阻仪均由北京大橡科技有限公司。

在应用层面也表明该研究中使用的器官芯片模型比小鼠模型更准确地模拟了人体血脑屏障功能。

总而言之，这项工作不仅提供了一个更简单、高通量的人类BBB仿生芯片模型，可用于大规模筛选和发现高效的AAV载体，而且首次揭示了LY6E作为介导AAV穿越人类BBB的关键分子，为未来开发针对中枢神经系统疾病的基因疗法或药物递送策略开辟了新的道路。

参考文献：

[1]     Liu D, Zhu M, Lin Y, et al. LY6E protein facilitates adeno-associated virus crossing in a biomimetic chip model of the human blood–brain barrier[J]. Lab on a Chip, 2022, 22(21): 4180-4190. https://doi.org/10.1039/D2LC00698G.

[2]     Zheng, H., Zhang, L., Bai, X. et al. GCN5-targeted dual-modal probe across the blood-brain barrier for borders display in invasive glioblastoma. Nat Commun 16, 2345 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-57598-9.