垂体功能减退症动物模型【实验外包】
【造模机制】采用手术去除腺垂体或神经垂体的方法导致相应垂体激素断绝,引起类似人类垂体功能减退症的表现。
【造模方法】采用咽旁手术法切除垂体造模选用 Wistar 大鼠,雌性,180～200g。手术前 30 分钟腹腔注射阿托品 4mg/kg,地西泮(安定)2.5mg/kg,10%水合氯醛 400mg/kg腹腔麻醉。将大鼠仰卧固定于动物立体定向架上,颈部正中作 4cm 切口。显微镜下沿中线分离淋巴结,涎腺,暴露出胸骨舌骨肌,肩胛舌骨肌,中线分离胸骨舌骨肌后可见其下的甲状腺和气管。在甲状腺尾侧 1cm 两气管环间横向切开一小口,气管头侧以小棉片填塞,以防咽部分泌物进入气管。用外径 0.2cm 的 Teflon 套管插入气管尾侧。在气管左侧胸骨舌骨肌分离。抬起舌骨可见椎前肌止于基蝶骨和比骨交界的软骨连合处。以镜下蓝色的基蝶窦肌,二腹肌肌腱内侧间分离,电囊一分支到食管和咽部的小动脉后,仔细将食管后擔与椎前为前界,其探方为下丘脑;向后至软骨连合后方 1～2mm;向两侧分离至颞骨蛟泡的前内侧即尖部。直径 1mm 的显徹磨钻首先磨除两鼓泡前內侧,钻孔时注意保留最内面一薄层骨片。按此方法充分磨除所暴露术野的骨质。自制 90°弯钩和精细显微锻配合取出薄层骨片,此时可见蔽底硬脑膜及膜下略带红色的脑垂体。用小钩、显微镊“十”形切开硬脑膜,由于脑压的作用垂体向术野突出。暴露充分时可见两侧的海绵篓,腺垂体和神经垂体之间稍加分离即可完整摘除腺垂体。术区用明胶海绵压追止血、填塞后,拔除气管插管,取出气管内填塞棉片,吸除分泌物,再将气管插管向气瞥头端插入从口引出,近心端插入气管切口3mm 左右,缝合。颈部皮肤及皮下组织分层缝合,关闭切口。术后 3 天内常规腹腔注射地塞米松 1mg,庆大霉素 4×10'U,氢化可的松加到 10％葡萄糖盐水中(浓度 10mg/L),作为饮水给大鼠喝。饲以高蛋白精饲料。
观察指标:定期测量体重、所切除的组织、靶腺如甲状腺、性腺、肾上腺等分别以4%多聚甲醛、2.5％戊二醛固定,作光镜切片和透射电镜切片。术前及术后处死时采血,制备血滑,测定血清腺垂体激素及靶腺激素如卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、PRL、促甲状腺激素(TSH)、生长激素(GH)、甲状腺素(Ti)等。
【模型特点】
1.大鼠术后出现少动、食欲下降,消瘦,精神委靡、易感染、体毛易脱落等症状。而正常大鼠术后 1 周可恢复正常。
2.模型大鼠成活率约为 70%左右。由于呼吸道梗阻、感染、急性垂体功能不全、恶病质等原因可导致部分动物在术后 2 周内发生死亡。因此,应加强术后护理。
3.切除组织的光镜和电镜检查可验证手术是否成功。其他靶腺病理学检查可见:术后2 周即见靶腺退化,1个月时更明显。光镜观察:甲状腺滤泡上皮细胞由立方形变成扁平形，滤泡腔扩大。曲细精管壁上皮细胞层次减少。各级精母细胞、精子细胞和精子少见。卵泡发育受阻,各级卵泡少见。电镜观察:甲状腺滤泡上皮细胞粗面内质网扩大,数量减少、线粒体肿胀、腔面微绒毛减少。精原细胞线粒体肿胀,精母细胞及间质细胞内脂滴堆积。闭锁卵泡增多,卵细胞消失,有透明带消失和颗粒细胞坏死现象。
4.血清腺垂体激素,靶腺激素明显下降,与术前比较有显著性差别。
5.术后 3 天,模型大鼠体重下降,2 周后体重常恢复正常。常以术后 14 天体重净增减值作为模型成功与否的筛选指标。一般选择 2 周后体重无增加且此后体重增加小于每日1g 的为成功去垂体鼠。
【应用范围】本模型除可用于垂体功能减退症研究外,还可用于下丘脑功能、垂体激素功能、神经内分泌、垂体移植、外源性垂体激素活性观察等研究。
【注意事项】
1.术中应充分暴露垂体鞍底,利于游离腺垂体,分块切除,否则可导致残留部分腺垂体。
2.啮齿类动物的激索检测所用试剂少且价格昂贵,因此,无论全切除整个垂体,或者仅切除腺垂体,最常用、最简便的评价指标是体重。术后 14 天体重净增减值作为模型评价指标应结合考虑前 1 周和后 1 周体重增减情况。体重增长过快者疑为有残留部分垂体组织。而体重呈负增长的大鼠体质较差,应考虑是否适合实验利用。
【模型评估】本模型的建立有手术方法简单、易于掌握、垂体切除可靠、对动物创伤小等优点。去垂体的方法有手术和化学法。化学法去垂体是通过特定药物造成垂体某一方面功能的抑制状态,因而受到其可靠性的影响而应用范围较小。去垂体手术分为经颞侧途径、耳道途径和咽旁途径等几种,最常用的是咽旁途径。经耳立体定向去除垂体有动物成活率高的优点,但成功率较咽旁途径低。大鼠腺垂体和神经垂体间无中间叶的存在,腺垂体、神经垂体界限明显,较易分离,神经垂体位于腺垂体中间部分的后上方,呈腺垂体包绕神经垂体之势,腺垂体的前后方薄,以两侧为主,两侧方大致呈三棱锥形,尖端向前。术中鞍底暴露充分时,由于脑压的作用腺垂体常自动突出术野,因此,能做到大鼠腺垂体的全切。
本模型可选择性切除腺垂体或神经垂体及全部垂体。神经垂体的保留可使动物免除出现尿崩、内环境紊乱等后遗症,从而提高了动物模型的生存率,也排除了对腺垂体功能减退研究的干扰。
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