腹腔注氢气缓解小鼠代谢障碍脂肪肝【广东中医药】
腹腔注射氢气（H₂）通过抑制GSDMD和GSDME介导的焦亡，缓解蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的小鼠代谢功能障碍相关脂肪性肝病
背景
氢气（H₂）是自然界中最轻且具有扩散性的气体分子，具有强效缓解过度氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的作用。吸入氢气有助于保护肺、心脏、脑、肝、肾等多个器官免受损伤。然而，腹腔注射氢气对代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的作用尚不明确。
目的
本研究旨在探究腹腔注射氢气是否可改善MASLD；若可改善，其涉及的关键固有免疫机制是什么？
方法
通过给小鼠饲喂蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食3周，构建MASLD小鼠模型。自小鼠饲喂MCD饮食的第8天起，每日通过腹腔注射给予氢气，持续2周。
- 肝损伤评估：检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。
- 肝脂肪变性评估：采用苏木精-伊红（H&E）染色、油红O染色、肝脏脂质代谢基因的实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析，以及肝脏甘油三酯（TG）水平检测。
- 肝纤维化评估：采用Masson三色染色，并检测Ⅰ型胶原蛋白（Collagen-Ⅰ）和Ⅲ型胶原蛋白（Collagen-Ⅲ）的蛋白水平。
- 氧化还原稳态评估：通过蛋白质印迹法（免疫印迹）和免疫荧光法检测肝脏3-硝基酪氨酸（3-NT）水平，使用试剂盒检测丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平。
- 固有免疫信号与焦亡检测：采用免疫印迹法和免疫荧光法，检测Toll样受体4（TLR4）介导的固有免疫信号激活情况及焦亡相关指标。
- 体外验证：通过富氢DMEM培养基处理HepG2细胞，进一步验证氢气的肝脏保护作用及抗焦亡效应。
结果
腹腔注射氢气可通过以下方式保护MCD饮食喂养的小鼠免受肝脂肪变性和肝纤维化影响：下调肝脏内源性脂质合成及脂肪酸摄取相关基因的表达，降低肝脏Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ蛋白水平，同时上调脂质输出相关基因的表达。
机制上，氢气通过抑制3-NT和MDA水平、升高还原型GSH水平，调节肝脏氧化还原稳态。随后，氢气可抑制活性氧（ROS）相关的固有免疫信号通路，包括肝脏中TLR4的表达，以及核因子-κB（NF-κB）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的激活。这些作用进一步抑制了肝脏中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）的表达。
此外，氢气可阻断IL-1β和IL-18的成熟过程，抑制经典焦亡触发因子Gasdermin D（GSDMD）的全长表达，以及NLRP3炎症小体（包括NLRP3、ASC、胱天蛋白酶-1（Caspase-1））中Caspase-1介导的GSDMD切割。同时，氢气可降低Caspase-11、Caspase-8、Caspase-3及Gasdermin E（GSDME）的全长形式与切割形式水平，从而抑制MASLD小鼠肝脏中的非经典焦亡信号通路。
体外实验进一步证实，氢气具有抗焦亡效应：经富氢处理后，HepG2细胞中炎症细胞因子的表达降低，GSDMD和GSDME的全长及切割形式水平下降，呈现焦亡形态的细胞数量减少。
结论
氢气是一种抗焦亡气体分子，腹腔注射氢气是治疗MASLD的新型策略，值得进一步深入研究。
1 引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，前称非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））是一种进展性慢性非传染性肝病，其特征为肝脏脂肪变性，且患者存在一种或多种心脏代谢风险因素，同时排除药物诱导、酒精相关等其他导致肝脏脂肪变性的原因（Sarkar和Kushner，2025）。MASLD涵盖一系列进展性脂肪性肝脏疾病，从单纯性肝脏脂肪变性，到伴有不同程度肝纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）；其中10%~20%的患者会进一步发展为肝硬化及其并发症——肝细胞癌（HCC）和终末期肝病（Chen等，2021；Mallet等，2024；Miao等，2024）。全球MASLD患病率约为30.2%（Amini-Salehi等，2024）。
Resmetirom是一种肝脏选择性、甲状腺激素受体β（THRB，肝脏中主要的甲状腺激素受体亚型）选择性拟甲状腺素药物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个且目前唯一用于治疗MASH的药物（Sinha等，2024）。因此，寻找其他有效的MASLD治疗药物仍迫在眉睫。
氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗及细胞死亡均与MASLD的发病机制相关（Zhang等，2020c）。氢气（H₂）作为自然界中最轻的气体分子，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡作用（Tan等，2019）。吸入氢气、饮用富氢水及腹腔注射富氢盐水可缓解多种肝脏疾病，如缺血再灌注（I/R）损伤和MASLD（Sun等，2011；Zhai等，2017；Ge等，2019；Liang等，2023；Liu等，2023）。本课题组及其他研究团队已证实，腹腔注射氢气可缓解小鼠急性酒精性肝损伤和脂多糖（LPS）诱导的心脏功能障碍（Tan等，2019；Zhang等，2021a；Xu等，2024），并对心脏骤停家兔具有神经保护作用（Huang等，2013）。然而，腹腔注射氢气对MASLD的治疗效果尚不明确；若其具有肝脏保护作用，其关键作用机制又是什么？
2 材料与方法
2.1 氢气与富氢培养基
- 动物实验用氢气：每日制备方法如下：将氢气（纯度>99.999%，大连特种气体有限公司，中国大连，货号73405157）注入100 mL真空输液瓶（广东科伦药业有限公司，中国梅州）中。
- 细胞实验用富氢培养基：参照此前实验室方法制备富氢达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）。
上述制备过程详见图1A、B。
图1. 氢气使用方法及实验流程。（A）轻微开启减压阀排气，排出减压阀连接的塑料软管内空气；将注射器针头插入100 mL真空塑料输液瓶，进一步松开减压阀，向输液瓶内充入氢气，直至无死体积残留。（B）向装有10 mL DMEM的输液瓶内充入氢气至无死体积残留，制备富氢培养基；使用前于4℃储存6小时。（C）实验流程：氢气处理组小鼠自第8天起，每日17:00腹腔注射氢气1次；第22天9:00采集血液和肝脏样本。具体注射操作：注射器与针头间连接双向阀；打开双向阀，抽取所需体积的氢气后立即关闭阀门；从输液瓶中拔出针头后，立即将针头刺入小鼠腹腔，打开双向阀完成腹腔注射。
2.2 代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）小鼠模型构建及氢气处理
雄性C57BL/6小鼠购自广东医学实验动物中心（中国佛山），饲养于无特定病原体（SPF）级动物房，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，小鼠可自由进食饮水。所有动物实验操作均经广州中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，为“构建心脏代谢疾病综合防治体系（3-1）”子项目（批准号：2023053006）。
参照文献方法（Henao-Mejia等，2012；Valdecantos等，2017），通过给小鼠饲喂MCD饮食3周构建MASLD模型（图1C）。本研究采用两种剂量的氢气（Xu等，2024），将体重26~28 g的C57BL/6小鼠随机分为4组：对照组（Control）、MCD模型组（MCD）、MCD+低剂量氢气组（MCD+H₂（L））、MCD+高剂量氢气组（MCD+H₂（H））。
- 各组小鼠先饲喂混合饲料3天：对照组为50%标准饲料+50% MCD对照饲料（扬州美迪森生物科技有限公司，中国扬州，货号MD12051）；其余3组为50%标准饲料+50% MCD饲料（扬州美迪森生物科技有限公司，中国扬州，货号MD12052）。
- 随后，对照组继续饲喂MCD对照饲料，其余3组继续饲喂MCD饲料，均持续18天。
- 自实验第8天起，MCD+H₂（L）组小鼠按0.5 mL/100 g体重、MCD+H₂（H）组小鼠按1.0 mL/100 g体重，每日腹腔注射氢气1次。
- 实验第22天，将小鼠深度麻醉后，通过眼眶窦采集血液，随后采用颈椎脱臼法处死小鼠（Mackowiak等，2022）。肝脏样本一部分置于-80℃冷冻保存，另一部分放入4%多聚甲醛固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国武汉，货号G1101）中固定，以备后续分析。
2.3 油酸钠诱导HepG2细胞脂质堆积及富氢培养基处理
HepG2细胞由武汉大学基础医学院张鹏教授惠赠，培养于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5% CO₂。参照文献方法（Chen等，2020；Liu等，2020；Wang等，2022），采用油酸钠（北京索莱宝科技有限公司，中国北京，货号S6130）构建HepG2细胞脂质堆积模型。
将HepG2细胞分为4组：对照组（Control）、油酸钠处理组（OA）、油酸钠+氢气组（OA+H₂）、氢气组（H₂）。其中，OA+H₂组和H₂组加入含1% FBS的富氢DMEM，对照组和OA组加入等量含1% FBS的普通DMEM（不含氢气）。氢气预处理30分钟后，OA组和OA+H₂组加入0.25 mM油酸钠处理18小时。
2.4 血清ALT、AST及肝脏MDA、还原型GSH、TG检测
血清ALT和AST水平由中山大学附属第三医院检验科采用全自动生化分析仪检测（Xu等，2024）。肝脏MDA、还原型GSH及TG水平采用商品化试剂盒检测（南京建成生物工程研究所，中国南京，货号分别为A003-1-2、A006-2-1、A110-1-1）。
2.5 组织病理学分析
- 石蜡切片与染色：将经4%多聚甲醛固定液固定24小时以上的肝脏组织石蜡包埋，切成4 μm厚切片；参照标准流程进行Masson三色染色（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国武汉，货号G1006-100ML）和H&E染色（苏木精：珠海贝索生物技术有限公司，中国珠海，货号BA4097-500ML；伊红：珠海贝索生物技术有限公司，中国珠海，货号BA4099-500ML）。
- 肝脂肪变性评分：在H&E染色切片中，根据脂肪变性区域占肝脏总面积的百分比对肝脂肪变性程度进行评分分级：0级（<5%）、1级（5%~33%）、2级（>33%~66%）、3级（>66%）（Kleiner等，2005；Liang等，2014；Zhang等，2020c）。H&E图像由卢成钦和陈韵进行分析，采用双盲设计以减少偏倚。
- 油红O染色：HepG2细胞用4%多聚甲醛固定；肝脏组织用 Tissue-Tek® 最优切割温度（O.C.T.）包埋剂（樱花公司，日本，货号4583）制作10 μm厚冷冻切片；随后进行油红O染色（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国武汉，货号G1015-100ML）。参照文献方法（Mehlem等，2013），对油红O染色显示的肝脏脂质堆积程度进行定量分析。
2.6 实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析
- 采用EZ-press RNA纯化试剂盒（美国加利福尼亚州罗斯维尔，EZBiocience公司，货号B0004DP）从新鲜肝脏组织中提取总RNA；
- 采用彩色逆转录试剂盒（美国加利福尼亚州罗斯维尔，EZBiocience公司，货号A0010CGQ）将mRNA逆转录为cDNA；
- 采用2×彩色SYBR Green qPCR预混液（美国加利福尼亚州罗斯维尔，EZBiocience公司，货号A0012-R2），按标准流程进行qPCR实验。
- 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）为内参基因，采用2⁻△△Ct法计算目标基因的相对表达量。目标基因的引物序列详见表1。
Table 1. Sequences of primers used for real-time quantitative PCR.
2.7 蛋白质印迹法（Western blot）
采用含4%蛋白酶抑制剂混合物（货号：4693132001，罗氏公司，25倍浓缩）和10%磷酸酶抑制剂混合物（货号：4906837001，罗氏公司，10倍浓缩）的裂解液提取肝脏样本中的总蛋白（Zhang等，2020b）。参照标准流程，通过蛋白质印迹法检测肝脏样本中相应蛋白的表达水平（Zhang等，2021a）。本研究中使用的抗体详见表2。
表2. 本研究使用的抗体信息
2.8 免疫荧光染色
对肝脏样本冷冻切片进行3-硝基酪氨酸（3-NT）免疫荧光染色，步骤如下：
（1）用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗冷冻切片30分钟， Tris-缓冲盐水（TBS）冲洗10分钟，含吐温-20的Tris-缓冲盐水（TBST）冲洗20分钟；
（2）用山羊血清封闭液（货号：ZLI-9056，北京中杉金桥生物技术有限公司）在室温下封闭2小时；
（3）加入3-NT抗体（详见表1），在4℃下孵育过夜；
（4）用TBS冲洗10分钟，TBST冲洗20分钟；
（5）加入山羊抗小鼠IgG（H+L）Fluor 594标记二抗（货号：S0005，北京爱必信生物技术有限公司），在避光条件下孵育2小时；
（6）用TBS冲洗10分钟，TBST冲洗20分钟；
（7）最后，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂（货号：S2110，北京索莱宝科技有限公司）封片后，在荧光显微镜下观察3-NT的荧光强度。
2.9 统计学分析
根据数据分布特征选择相应的统计学分析方法：
- 对于经夏皮罗-威尔克检验（Shapiro-Wilk test）验证符合正态分布，且经布朗-福赛斯检验（Brown-Forsythe test）验证符合方差齐性的数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），后续通过邦费罗尼事后检验（Bonferroni’s post hoc analysis）进行多重比较；
- 对于符合正态分布但方差不齐的数据，采用布朗-福赛斯方差分析和韦尔奇方差分析（Brown-Forsythe and Welch ANOVA tests），后续通过邓尼特T3事后检验（Dunnett T3 post hoc analysis）进行多重比较；
- 对于经夏皮罗-威尔克检验验证呈偏态分布的数据，采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验（Kruskal-Wallis test），后续通过邓恩事后检验（Dunn’s post hoc analysis）进行多重比较。
所有数据以“均数±标准差（mean ± SD）”或“中位数±四分位距（median ± interquartile range）”表示，*P* < 0.05 被认为差异具有统计学意义。所有柱状图均采用GraphPad Prism 10.1.2软件（美国加利福尼亚州圣迭戈市GraphPad软件公司）绘制。
3 结果
3.1 氢气改善MCD饮食喂养小鼠的肝脂肪变性
肝脂肪变性是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的基本特征（Rinella等，2023；Hagström等，2024）。因此，本研究首先探究腹腔注射氢气是否对MCD饮食喂养小鼠的肝脏脂质沉积具有保护作用。
苏木精-伊红（H&E）染色显示，MCD模型组小鼠肝脏出现明显的大泡性脂肪变性（图2A）；油红O染色显示，该组小鼠肝脏存在大量脂滴（图2B）。与对照组相比，MCD模型组小鼠的脂肪变性分级评分（图2C）和肝脏甘油三酯（TG）水平（图2D）均显著升高；同时，该组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）（图2E）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）（图2F）水平升高，提示肝细胞存在损伤。高剂量氢气处理可显著改善上述所有反映肝脂肪变性和肝损伤的指标。
肝脂肪变性的发生是肝脏脂质获取超过脂质清除的结果，例如脂肪酸摄取和内源性脂质合成增加，而脂质输出和脂肪酸氧化减少（Ipsen等，2018）。本研究发现，MCD饮食喂养3周后，小鼠肝脏内源性脂质合成相关基因（如乙酰辅酶A羧化酶基因*Acaca*、脂肪酸合成酶基因*Fasn*）及脂肪酸摄取相关基因*CD36*的mRNA表达水平显著升高（图2G-I）；相反，脂肪酸氧化相关基因（如肉碱棕榈酰转移酶1α基因*Cpt1α*、脂肪酸结合蛋白1基因*Fabp1*、过氧化物酶体脂肪酸β-氧化限速酶——酰基辅酶A氧化酶基因*Acox*、过氧化物酶体增殖物激活受体α基因*PPAR-α*）（图2J-M），以及脂质输出相关基因（如微粒体甘油三酯转移蛋白基因*Mttp*、载脂蛋白B基因*Apob*）的mRNA表达水平显著降低（图2N-O）。
在上述基因中，高剂量氢气处理可显著降低*Acaca*、*Fasn*和*CD36*的表达（图2G-I），同时显著升高*Mttp*和*Apob*的表达（图2N-O）。这些数据表明，氢气可能通过抑制内源性脂质合成和脂肪酸摄取、促进脂质输出，从而改善MCD饮食喂养小鼠的肝脂肪变性。
图2. 氢气对MCD饮食喂养小鼠肝脂肪变性的改善作用
图2 氢气治疗改善MCD饮食喂养小鼠的肝脂肪变性
（A）肝脏苏木精-伊红（H&E）染色和（B）油红O染色结果显示，低剂量和高剂量氢气均能减轻MCD饮食诱导的肝脂肪变性；（C）脂肪变性分级评分，每组8只小鼠；（D）肝组织甘油三酯（TG）水平、（E）血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平、（F）血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，每组8只小鼠；（G）乙酰辅酶A羧化酶基因（*Acaca*）、（H）脂肪酸合成酶基因（*Fasn*）、（I）CD36分子基因（*CD36*）、（J）肉碱棕榈酰转移酶1α基因（*Cpt1α*）、（K）脂肪酸结合蛋白1基因（*Fabp1*）、（L）酰基辅酶A氧化酶基因（*Acox*）、（M）过氧化物酶体增殖物激活受体α基因（*Ppar-α*）、（N）微粒体甘油三酯转移蛋白基因（*Mttp*）、（O）载脂蛋白B基因（*Apob*）的相对mRNA水平（以*Gapdh*基因为内参的比值），每组3只小鼠。脂肪变性分级评分数据以“中位数±四分位距”表示，其余结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001，p < 0.0001。
3.2 氢气改善MCD饮食喂养小鼠的肝纤维化
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）患者存在进展为肝纤维化的潜在风险（Chalasani等，2017；Younossi等，2023）。Masson三色染色结果显示，MCD饮食喂养可诱导小鼠发生肝纤维化；同时，MCD饮食喂养小鼠肝脏中纤维化标志物——Ⅰ型胶原蛋白（Collagen-Ⅰ）和Ⅲ型胶原蛋白（Collagen-Ⅲ）的蛋白水平显著升高；而氢气治疗可改善上述所有病理状态（图3）。因此，这些数据表明，氢气还具有改善MCD饮食喂养小鼠肝纤维化的潜力。
图3 氢气对MCD饮食喂养小鼠肝纤维化的影响
（A）Masson三色染色结果显示，氢气可减轻MCD饮食诱导的轻度肝纤维化；（B）肝脏中Collagen-Ⅰ与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的蛋白质印迹图像，及Collagen-Ⅰ/GAPDH比值的定量分析；（C）肝脏中Collagen-Ⅲ与GAPDH的蛋白质印迹图像，及Collagen-Ⅲ/GAPDH比值的定量分析；每组3只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.3 氢气缓解MCD饮食喂养小鼠肝脏的氧化应激
肝脏氧化应激是MASLD的关键特征及发病驱动因素之一（Li等，2024）。为探究腹腔注射氢气对MCD饮食喂养小鼠肝脏氧化损伤的影响，本研究通过免疫荧光法和蛋白质印迹法（Western blot）检测了肝脏中氧化应激指标——3-硝基酪氨酸（3-NT）的水平。结果显示，与对照组相比，MCD模型组小鼠肝脏中3-NT水平显著升高，而氢气治疗可降低3-NT水平（图4A~D）。
丙二醛（MDA）是脂质过氧化过程中产生的次级产物，而谷胱甘肽（GSH）是细胞内主要的抗氧化缓冲物质（Ayala等，2014；Wrotek等，2020）。本研究进一步检测了肝脏中MDA和GSH的水平：与对照组相比，MCD模型组小鼠肝脏中MDA水平升高，而还原型GSH水平降低；相反，氢气治疗可逆转这种氧化还原失衡状态（图4E~F）。因此，氢气治疗可缓解MCD饮食喂养小鼠肝脏的氧化应激。
图4 氢气缓解MCD饮食喂养小鼠肝脏的氧化应激
（A）3-NT的免疫荧光染色结果；（B）3-NT的平均荧光强度；（C）肝脏中3-NT与GAPDH的蛋白质印迹图像；（D）3-NT/GAPDH比值的定量分析；每组3只小鼠；（E）肝脏MDA水平、（F）肝脏还原型GSH水平；每组8只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.4 氢气抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏的焦亡
在人类和小鼠的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）模型中，肝细胞死亡（如凋亡、焦亡）增加是引发炎症反应和纤维化的关键机制（Hatting等，2013；Xu等，2018；Gaul等，2021）。经典焦亡是一种溶解性细胞死亡形式：配体与形成炎症小体的模式识别受体（PRR，如NLRP3）结合后，激活胱天蛋白酶-1（Caspase-1）（Shi等，2015）；激活的Caspase-1进一步切割焦亡效应蛋白Gasdermin D（GSDMD），从而引发焦亡（Shi等，2017）。GSDMD的Gasdermin-N结构域可与膜脂质（磷酸肌醇、心磷脂）结合，在哺乳动物细胞中发挥破坏膜结构的细胞毒性作用，进而触发焦亡（Ding等，2016）。
为探究氢气对MCD饮食喂养小鼠肝脏中NLRP3炎症小体激活及后续焦亡过程的影响，本研究检测了肝脏中NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD的蛋白水平。结果显示，MCD饮食喂养可升高小鼠肝脏中NLRP3、ASC的蛋白水平，以及Caspase-1、GSDMD的前体形式与切割形式（成熟形式）水平；而氢气治疗可降低这些蛋白的上调幅度（图5）。
除Caspase-1-GSDMD通路外，非经典通路也可诱导焦亡，例如胱天蛋白酶-11/8（Caspase-11/8）切割GSDMD，以及胱天蛋白酶-3（Caspase-3）特异性切割Gasdermin E（GSDME）（Kayagaki等，2015；Wang等，2017；Sarhan等，2018）。本研究发现，与对照组相比，MCD模型组小鼠肝脏中Caspase-11、Caspase-8、Caspase-3及GSDME的前体形式与切割形式水平均显著升高；而氢气可下调这些焦亡信号相关蛋白的表达及成熟过程（图6）。因此，氢气可抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏的焦亡。
图5 氢气治疗抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中NLRP3炎症小体的激活
（A）肝脏中NLRP3与GAPDH的蛋白质印迹图像，及NLRP3/GAPDH比值的定量分析；（B）肝脏中ASC与GAPDH的蛋白质印迹图像，及ASC/GAPDH比值的定量分析；（C）肝脏中前体胱天蛋白酶-1（pro-Caspase-1）、切割型胱天蛋白酶-1（cleaved-Caspase-1）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-Caspase-1/GAPDH、cleaved-Caspase-1/GAPDH比值的定量分析；（D）肝脏中前体Gasdermin D（pro-GSDMD）、切割型Gasdermin D（cleaved-GSDMD）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-GSDMD/GAPDH、cleaved-GSDMD/GAPDH比值的定量分析；每组3只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
图6 氢气治疗抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中的非经典焦亡信号通路
（A）肝脏中前体胱天蛋白酶-11（pro-Caspase-11）、切割型胱天蛋白酶-11（cleaved-Caspase-11）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-Caspase-11/GAPDH、cleaved-Caspase-11/GAPDH比值的定量分析；（B）肝脏中前体胱天蛋白酶-8（pro-Caspase-8）、切割型胱天蛋白酶-8（cleaved-Caspase-8）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-Caspase-8/GAPDH、cleaved-Caspase-8/GAPDH比值的定量分析；（C）肝脏中前体胱天蛋白酶-3（pro-Caspase-3）、切割型胱天蛋白酶-3（cleaved-Caspase-3）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-Caspase-3/GAPDH、cleaved-Caspase-3/GAPDH比值的定量分析；（D）肝脏中前体Gasdermin E（pro-GSDME）、切割型Gasdermin E（cleaved-GSDME）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-GSDME/GAPDH、cleaved-GSDME/GAPDH比值的定量分析；每组3只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.5 氢气治疗降低MCD饮食喂养小鼠肝脏中炎症细胞因子的表达
激活的胱天蛋白酶-1（Caspase-1）可介导GSDMD和白细胞介素-1β（IL-1β）的切割；其中，GSDMD的切割是焦亡发生及成熟IL-1β释放的必要条件（He等，2015；Shi等，2015）。已知炎症细胞因子水平升高是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）发病机制中的关键环节。因此，本研究检测了肝脏中炎症细胞因子的蛋白水平，以探究腹腔注射氢气对MASLD小鼠炎症反应的影响。结果显示，与对照组相比，MCD模型组小鼠肝脏中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，以及IL-1β、IL-18的前体形式与切割形式（成熟形式）水平均显著升高；而高剂量氢气治疗可逆转肝脏中这些炎症细胞因子的上调趋势（图7）。综上，氢气治疗可抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中炎症细胞因子的表达。
图7 氢气抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中促炎细胞因子的表达
（A）肝脏中TNF-α与GAPDH的蛋白质印迹图像，及TNF-α/GAPDH比值的定量分析；（B）肝脏中前体IL-1β（pro-IL-1β）、切割型IL-1β（cleaved-IL-1β）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-IL-1β/GAPDH、cleaved-IL-1β/GAPDH比值的定量分析；（C）肝脏中前体IL-18（pro-IL-18）、切割型IL-18（cleaved-IL-18）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-IL-18/GAPDH、cleaved-IL-18/GAPDH比值的定量分析；每组3只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.6 氢气抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中TLR4固有免疫信号通路的过度激活
在MASLD进展过程中，病原体相关分子模式（PAMPs，如脂多糖LPS）或损伤相关分子模式（DAMPs）水平升高，被模式识别受体（PRRs，如Toll样受体4 TLR4）识别后，可诱导肝脏中炎症细胞因子的表达（Carpino等，2020）。本研究发现，MCD饮食喂养小鼠肝脏中TLR4的表达，及其下游信号蛋白（包括核因子-κB（NF-κB）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK））的磷酸化水平均显著升高（图8）；相反，腹腔注射高剂量氢气可抑制这种过度激活的TLR4固有免疫信号通路（图8）。
图8 氢气抑制MCD饮食喂养小鼠肝脏中TLR4-NFκB及MAPK固有免疫信号通路
（A）肝脏中TLR4与GAPDH的蛋白质印迹图像，及TLR4/GAPDH比值的定量分析；（B）肝脏中磷酸化p65（p-p65）、总p65（total p65）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及p-p65/total p65比值的定量分析；（C）肝脏中磷酸化ERK（p-ERK）、总ERK（total ERK）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及p-ERK/total ERK比值的定量分析；（D）肝脏中磷酸化p38（p-p38）、总p38（total p38）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及p-p38/total p38比值的定量分析；（E）肝脏中磷酸化JNK（p-JNK）、总JNK（total JNK）与GAPDH的蛋白质印迹图像，及p-JNK/total JNK比值的定量分析；每组3只小鼠。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
3.7 富氢培养基通过抑制炎症细胞因子表达及焦亡，改善油酸钠诱导的HepG2细胞脂肪变性
通过油酸钠（OA）诱导的HepG2细胞脂肪变性模型（油红O染色结果见图9A），进一步验证了氢气对肝脏脂肪变性的保护作用。油酸钠可显著升高HepG2细胞中3-硝基酪氨酸（3-NT，图9B）、TNF-α（图9C）、IL-1β（图9D）和IL-18（图9E）的表达水平，而富氢培养基可抑制这些指标的升高。此外，油酸钠处理使HepG2细胞中呈现焦亡形态（细胞肿胀并伴有大泡，图9F）的细胞数量增加，同时使GSDMD（图9G）和GSDME（图9H）的前体形式与切割形式水平升高，提示油酸钠可诱导HepG2细胞发生焦亡；而富氢培养基处理可抑制上述所有焦亡相关表型。综上，富氢培养基可通过抑制炎症细胞因子表达，并靶向作用于GSDMD和GSDME，从而缓解油酸钠诱导的HepG2细胞脂肪变性。
图9 富氢培养基通过抑制炎症细胞因子表达及焦亡，改善油酸钠（OA）诱导的HepG2细胞脂肪变性
（A）HepG2细胞的油红O染色结果；（B）HepG2细胞中3-NT与GAPDH的蛋白质印迹图像，及3-NT/GAPDH比值的定量分析；（C）HepG2细胞中TNF-α与GAPDH的蛋白质印迹图像，及TNF-α/GAPDH比值的定量分析；（D）HepG2细胞中IL-1β与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-IL-1β/GAPDH、cleaved-IL-1β/GAPDH比值的定量分析；（E）HepG2细胞中IL-18与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-IL-18/GAPDH、cleaved-IL-18/GAPDH比值的定量分析；（F）明场显微镜下观察到的HepG2细胞焦亡形态图像；（G）肝脏中pro-GSDMD、cleaved-GSDMD与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-GSDMD/GAPDH、cleaved-GSDMD/GAPDH比值的定量分析；（H）HepG2细胞中pro-GSDME、cleaved-GSDME与GAPDH的蛋白质印迹图像，及pro-GSDME/GAPDH、cleaved-GSDME/GAPDH比值的定量分析。结果以“均数±标准差（mean ± SD）”表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
4 讨论
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球范围内最主要的慢性肝病。其疾病谱涵盖从单纯性脂肪变性，到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、肝纤维化，最终进展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）的全过程。截至2024年3月，美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准Resmetirom这一款（也是唯一一款）特征性药物用于治疗MASH相关肝纤维化（Keam，2024）。因此，寻找其他有效的MASH治疗方法仍迫在眉睫。
氢气（H₂）是一种具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用的气体分子。自大泽郁朗（Ikuroh Ohsawa）首次发现吸入2%氢气可改善大鼠脑缺血再灌注（I/R）损伤以来，氢气的治疗作用受到了广泛关注（Ohsawa等，2007）。迄今为止，已有研究报道氢气对多种肝脏疾病（如酒精性肝损伤）具有治疗效果（Zhang等，2021a；Xu等，2024）。本研究首次报道，腹腔注射氢气作为一种外源性氢气补充的新型策略，可治疗MCD饮食诱导的小鼠MASLD。未来研究应增设以Resmetirom为阳性对照的实验组，以进一步评估氢气的治疗效果。
蛋氨酸或胆碱可促进磷脂酰胆碱（极低密度脂蛋白VLDL颗粒外膜的主要磷脂成分）的合成，而磷脂酰胆碱是VLDL分泌所必需的物质；蛋氨酸或胆碱缺乏会导致肝脏脂质堆积（Rizki等，2006）。本研究数据显示，H&E染色和油红O染色结果均提示MCD饮食喂养可诱导小鼠出现明显的肝脂肪变性，且肝脏甘油三酯（TG）水平升高。MCD饮食通过多种机制促进肝脏脂质堆积（Rinella等，2008）。内源性脂质合成、脂肪酸摄取、脂质输出和脂肪酸氧化这四个关键过程，均参与MCD饮食诱导动物MASLD的发病机制；但MASLD的严重程度与饮食喂养天数、MCD饮食成分差异及动物品系相关（Kirsch等，2003；Rizki等，2006；Gyamfi等，2008；Rinella等，2008；Pickens等，2009；Wu等，2010；Machado等，2015；Pierce等，2015；Xu等，2018；Yu等，2019）。
本研究发现，雄性C57BL/6小鼠饲喂MCD饮食3周后，肝脏中脂肪酸摄取相关基因（CD36）和内源性脂质合成相关基因（Acaca、Fasn）表达升高，而脂质输出相关基因（Mttp、Apob）和脂肪酸氧化相关基因（Cpt1α、Fabp1、Acox、PPAR-α）表达降低。氢气治疗可降低内源性脂质合成及脂肪酸摄取相关基因的mRNA水平，同时升高脂质输出相关基因的mRNA水平。为明确氢气对肝脏脂质代谢的具体作用，需进一步检测这些基因对应的蛋白水平、蛋白活性及相关代谢物水平。此外，氢气还可改善MCD饮食诱导的肝纤维化，并降低肝脏中Ⅰ型胶原蛋白（Collagen-Ⅰ）和Ⅲ型胶原蛋白（Collagen-Ⅲ）的蛋白水平。综上，氢气对MCD饮食诱导的小鼠MASLD具有治疗效果。
MASLD的病理生理机制复杂且尚未完全明确。1998年，Day和James提出“二次打击假说”：第一次打击为脂肪变性，第二次打击为氧化应激（Day和James，1998）。2010年，Tilg和Moschen进一步提出“多重平行打击假说”：多种平行打击因素（如脂毒性、胰岛素抵抗、氧化应激，以及固有免疫与适应性免疫的过度激活）共同推动MASLD或MASH的发生发展（Tilg和Moschen，2010；Targher等，2024）。其中，氧化应激是驱动MASLD发生的核心机制，其源于活性氧（ROS）产生与清除之间的失衡（Hu等，2025）。本研究发现，MCD饮食喂养小鼠肝脏中氧化应激指标（3-NT、MDA）升高，而抗氧化物质（还原型谷胱甘肽GSH）降低，提示MCD饮食破坏了肝脏氧化还原稳态；而氢气治疗可改善这种稳态失衡。已知氢气可选择性清除ROS中细胞毒性最强的羟基自由基（•OH），从而有效保护细胞（Ohsawa等，2007）；此外，氢气还可降低NADPH氧化酶亚基p67（phox）的表达（Zhang等，2016）。但氢气改善MASLD中氧化还原稳态的具体机制仍需进一步探索。
焦亡是MASLD发病的关键机制之一（Xu等，2018；Gaul等，2021）。焦亡由成孔蛋白GSDMD介导，其激活/切割主要依赖以下几种胱天蛋白酶（Caspase）：Caspase-1、小鼠Caspase-11（人同源蛋白为Caspase-4和Caspase-5）及Caspase-8（Shi等，2017；Orning等，2018；Sarhan等，2018；Rathinam等，2019）。配体激活经典炎症小体（如NLRP3炎症小体）后可激活Caspase-1；Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可直接识别细菌LPS；上述两种途径均通过切割GSDMD触发焦亡（Shi等，2015）。NLRP3炎症小体包含三个核心组分：NLRP3、Caspase-1，以及作为连接NLRP3与Caspase-1桥梁的ASC（含胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白）（Fu和Wu，2023）。MCD饮食喂养可升高小鼠肝脏中NLRP3、ASC、Caspase-1（前体形式与切割形式）及GSDMD（前体形式与切割形式）的蛋白水平，而腹腔注射氢气可降低这些蛋白的上调幅度。这提示氢气可抑制MASLD小鼠肝脏中NLRP3炎症小体介导的经典焦亡信号通路。已有研究显示，在心肌梗死大鼠模型和心肌缺血再灌注损伤大鼠模型中，吸入氢气也可抑制该经典焦亡信号通路（Nie等，2021a；Nie等，2021b）。
MCD饮食喂养还可升高小鼠肝脏中非经典焦亡信号通路相关分子的水平，包括介导GSDMD切割的Caspase-11和Caspase-8，以及介导GSDME切割的Caspase-3（Kayagaki等，2015；Wang等，2017；Sarhan等，2018）；而氢气治疗可抑制这些非经典焦亡信号通路的激活。本课题组近期研究也发现，腹腔注射氢气可通过抑制肝脏中“Caspase-11/Caspase-8切割GSDMD”及“Caspase-3切割GSDME”的非经典焦亡信号通路，部分缓解急性乙醇诱导的小鼠肝损伤（Xu等，2024）。上述结果表明，氢气是一种抗焦亡气体分子，这也是氢气治疗小鼠MASLD的关键机制之一（图10）。
图10 氢气（H₂）：降“魔”除“障”的“灵能”
氢气如同中国神话故事中太上老君宝葫芦里的“仙气”，可降妖除魔。腹腔注射作为一种新型氢气递送方式，可通过抑制肝脏氧化应激、TLR4介导的固有免疫信号通路，以及GSDMD和GSDME介导的焦亡，缓解MCD饮食诱导的小鼠MASLD。因此，氢气治疗或可作为一种新型动物MASLD治疗策略，值得进一步深入研究。
除切割GSDMD以触发焦亡外，被激活切割的胱天蛋白酶-1（Caspase-1）还可诱导白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）的切割；且GSDMD不仅是焦亡的效应分子，还是IL-1β分泌所必需的关键物质（He等，2015；Shi等，2015）。如前所述，炎症同样是MASLD的关键发病机制之一。MCD饮食喂养会使小鼠肝脏中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，以及IL-1β、IL-18的前体形式与切割形式（成熟形式）水平升高，而氢气可抑制这些指标的上调。此外，已有研究显示，氢气在心脏、脑、肾脏及生殖器官中同样具有抗炎作用（Zhang等，2018；Zhang等，2020a；Zhang等，2021b）。
基于此，本研究进一步探究了氢气下调炎症细胞因子的作用机制。已有研究报道，在MASLD小鼠模型及患者体内，可被TLR4等模式识别受体（PRR）识别的脂多糖（LPS）水平会升高（Carpino等，2020）。TLR4可通过诱导IκB激酶（IKK）磷酸化，激活核因子-κB（NF-κB）介导的炎症细胞因子表达；也可通过诱导丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，包括ERK1/2、p38 MAPK、JNK）磷酸化，激活激活蛋白-1（AP-1）介导的炎症细胞因子表达（Zhang等，2017a；Zhang和Li，2017；Zhang等，2017b）。本研究发现，MCD饮食喂养小鼠肝脏中TLR4的表达，以及NF-κB、ERK1/2、p38 MAPK、JNK的磷酸化水平均显著升高；而氢气可逆转肝脏中TLR4介导的固有免疫信号通路的过度激活（图10）。
我们此前的研究也表明，在酒精性肝病和脓毒症心肌病动物模型中，氢气可抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活。然而，目前尚不清楚氢气是通过直接抑制这些分子的磷酸化、抑制其上游分子活性，还是通过间接激活固有免疫的负调控分子，从而发挥上述抑制作用，这一机制仍需进一步探索。
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