氢化镁减轻顺铂诱导听力损失
摘要
顺铂是一种广泛使用的化疗药物，但其剂量限制性耳毒性常导致不可逆性听力损失。其发病机制涉及氧化应激、细胞凋亡、DNA损伤及炎症反应，目前有效的预防策略仍十分有限。本研究证实，释氢化合物氢化镁（MgH₂）对顺铂诱导的听力损失具有强效保护作用。结果显示，在体内实验中，MgH₂可保护听觉功能并维持耳蜗毛细胞的完整性；在体外实验中，它能显著减轻顺铂诱导的HEI-OC1细胞（House Ear Institute-Organ of Corti 1细胞，即耳蜗 Corti 器细胞）及耳蜗组织外植体的氧化应激与细胞凋亡。值得注意的是，MgH₂可抑制NOD样受体家族含 pyrin 结构域蛋白3（NLRP3）介导的炎症级联反应，从而减少下游炎症损伤。这些发现表明，MgH₂通过整合抗氧化、抗炎和抗凋亡通路缓解顺铂诱导的听力损失，其中NLRP3是关键调控分子。综上，本研究为MgH₂作为预防顺铂诱导听力损失的潜在治疗候选药物提供了有力证据。
图7 氢化镁效应机制示意图
本文原文信息：
Hu Y, Zhang Y, Li S, Yu Y, Wang J, Lou Z, Zhang B, Xing Y, Chen Z. Therapeutic Potential of MgH2 in Mitigating Cisplatin-Induced Hearing Loss. Neurosci Bull. 2025 Aug 11.
引言
顺铂是一种铂类化疗药物，广泛用于治疗多种实体瘤，包括头颈部肿瘤、膀胱癌、卵巢癌和睾丸癌[1-4]。尽管其临床疗效已得到证实，但顺铂会引发严重不良反应，如肾毒性、神经毒性和耳毒性[5-7]。其中，耳毒性尤为值得关注——它会导致不可逆的感音神经性听力损失、耳鸣和耳痛，严重影响患者生活质量[8]。顺铂诱导耳毒性的发生率为20%~80%，儿童对此尤为敏感[9-11]。在儿童群体中，听力损失会严重损害认知、心理和社会发育，对长期健康构成重大挑战。因此，阐明顺铂诱导耳毒性的病理生理机制并开发有效的治疗策略，已成为亟待解决的关键需求。
顺铂诱导耳毒性的发病机制涉及复杂的细胞和分子过程，其中细胞凋亡、氧化应激、DNA损伤和炎症反应发挥核心作用[12-15]。顺铂优先在耳蜗结构（如Corti器、螺旋神经节神经元和血管纹）中蓄积，通过改变内淋巴的离子平衡破坏耳蜗稳态[16,17]。活性氧（ROS）的产生及后续炎症反应是介导顺铂耳毒性的关键因素[18,19]。ROS蓄积是细胞损伤的主要诱因，会引发一系列级联反应，如线粒体功能障碍和p53信号通路激活，进而导致Bcl2相关X蛋白（Bax）与B细胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）失衡。这种失衡会通过细胞色素C释放、胱天蛋白酶-9（Caspase-9）激活及后续胱天蛋白酶-3（Caspase-3）介导的蛋白切割，激活内源性凋亡通路，最终导致内耳细胞凋亡[13]。从氧化应激到细胞死亡的过程中，炎症反应起着关键作用[14]。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）是介导耳蜗内炎症损伤的核心调控因子[20-22]。NLRP3炎症小体（由NLRP3、含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白及前胱天蛋白酶-1组成）激活后，会触发Caspase-1切割，进而释放白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）等促炎细胞因子[23-25]。这些细胞因子会加剧炎症反应，导致耳蜗细胞进一步死亡[26]。大量研究表明，NLRP3信号通路在顺铂诱导耳毒性的发病机制中具有关键作用[15,27]。
尽管在阐明顺铂诱导听力损失的分子机制方面取得了进展，但有效的耳保护疗法向临床转化的过程仍缓慢且充满挑战。目前，硫代硫酸钠（STS）是唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗药物；而顺铂灭活剂、抗氧化剂、抗氧化酶保护剂、谷胱甘肽合成促进剂及抗炎化合物等其他策略[28-32]，虽在临床和临床前研究中显示出一定耳保护效果[33,34]，但其临床应用受到诸多限制——如干扰顺铂的抗肿瘤疗效、分布不佳、清除迅速，这些因素共同导致药物无法维持有效治疗浓度。因此，亟需更有效、更精准的疗法来克服这些挑战，实现更优的耳保护效果。
氢气（H₂）疗法在耳蜗保护领域具有探索价值，有望减轻顺铂对耳蜗的损伤。氢气可缓解组织和细胞的氧化应激，且不会干扰正常的代谢氧化过程或细胞信号传导[35]。氢气吸入疗法已成功应用于多种疾病的治疗，包括脑损伤[35-37]、血管疾病[38]和癌症[39]。通过减少ROS生成，氢气有望调节由噪音和耳毒性药物引起的耳蜗损伤相关炎症微环境[40-43]。然而，氢气的临床应用仍面临挑战：扩散性强、在水溶液中溶解度低、直接吸入存在安全顾虑，这些因素均限制了单一吸入给药方式的疗效。
为克服上述局限性，研究人员开发了新型镁基氢化材料，可实现氢气的可控、持续释放，以优化治疗效果。其中，氢化镁（MgH₂）不仅能大量储存氢气并实现可控释放，还可在室温下安全稳定储存[44-47]。凭借这些特性，微米级MgH₂颗粒可实现可靠、持久且充足的局部氢气释放，为听力损失治疗提供了新方向。此前基于小鼠模型的体内研究表明，MgH₂安全性良好，无显著不良反应[48]。
本研究通过体外和体内模型，全面探究了MgH₂对顺铂诱导听力损失的作用：通过听觉功能评估分析听力阈值变化，通过形态学分析深入了解耳蜗结构的保存情况，同时检测NLRP3及炎症标志物以明确耳蜗微环境中的分子变化。研究结果不仅证实了MgH₂的治疗潜力，也为未来开发顺铂诱导听力损失的预防策略开辟了新途径。
材料与方法
研究设计
实验设计如图1所示。在体内实验中，共选取124只听觉脑干反应（ABR）阈值正常的小鼠，采用随机均等分组方式分为4组：对照组、单纯顺铂组、顺铂+MgH₂组、单纯MgH₂组。每组中，分别在给药前和给药后7天，对5只小鼠进行ABR阈值和畸变产物耳声发射（DPOAE）检测。完成ABR和DPOAE检测后，处死小鼠进行形态学分析，每组选取3只小鼠用于耳蜗毛细胞（HCs）计数。为探究MgH₂保护耳蜗免受顺铂耳毒性损伤的机制，在治疗后3天和7天，每组选取2只小鼠的耳蜗样本进行RNA测序；随后通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证相关基因在耳蜗中的表达（每组2只小鼠样本）。此外，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测每组3只小鼠样本中IL-1β、IL-10和IL-18的水平，以评估耳蜗的炎症反应。初步实验证实，单纯MgH₂对耳蜗功能和形态无显著影响，因此在后续机制研究中，重点关注对照组、单纯顺铂组、顺铂+MgH₂组3组；单纯MgH₂组被认为无必要纳入，因其无法为核心作用机制研究提供额外信息。该设计简化了实验方案，减少了小鼠使用量，同时使研究更聚焦于MgH₂如何调控顺铂诱导的分子变化。
图1.实验时间线示意图。
在体外实验中，与体内研究同步进行：选取24只出生后3天的小鼠，分为4组（每组6只），获取耳蜗组织外植体。通过TUNEL染色和活化Caspase-3染色评估毛细胞凋亡水平，通过MitoSOX染色评估毛细胞的线粒体氧化应激水平。每种检测均使用4个耳蜗样本，以确保结果的一致性和可靠性。
在HEI-OC1细胞系体外实验中：细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验每组设5个重复孔，用于评估细胞活力；每组选取3个培养皿提取细胞蛋白，用于后续蛋白质印迹（WB）分析；采用 Annexin V/PI 染色流式细胞术评估细胞凋亡，每组收集3个独立培养皿的细胞样本。
实验批准
所有实验流程均经上海市第六人民医院动物伦理委员会批准，符合机构伦理准则。所有实验方法均遵循相关机构和国家的指南与规定。
实验动物
6~8周龄C57BL/6小鼠购自苏州SPF生物技术有限公司。所有小鼠饲养环境温度控制在20~24℃，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，自由摄食饮水。
药物给药
通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（按体重0.01 mL/g）麻醉小鼠。在手术立体显微镜下，使用Microfil柔性针头[49]进行双侧鼓膜注射（每耳0.02 mL）。为降低鼓膜注射风险，研究采用了精准注射技术、严格无菌操作、注射后监测及预防性使用抗生素等措施[50]。根据分组不同，注射溶液包括生理盐水（0.9% NaCl）、顺铂（P4394，Sigma公司，美国密苏里州圣路易斯市）和/或MgH₂：对照组每耳注射0.02 mL生理盐水；单纯顺铂组注射浓度为1 mg/mL的顺铂溶液；单纯MgH₂组注射浓度为1 mg/mL的MgH₂溶液；顺铂+MgH₂联合治疗组同时注射浓度均为1 mg/mL的顺铂与MgH₂混合溶液。造模阶段仅注射1次，分别在注射前和注射后7天进行听觉功能评估。末次听力检测后，处死小鼠进行形态学分析。
听觉脑干反应（ABR）检测
在隔音室内，使用RZ6 BioAMP处理器（TDT System III，美国佛罗里达州阿拉楚阿市Tucker-Davis Technologies公司）检测ABR。通过Bio-Sig RP软件（美国佛罗里达州阿拉楚阿市Tucker-Davis Technologies公司）在开放环境中评估听力阈值。小鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后，维持体温在约37℃；将皮下记录电极置于颅顶，参考电极和接地电极分别置于双侧乳突区；在小鼠头部前方10 cm处放置宽带扬声器以传递听觉刺激。检测频率为4、8、16、22.6、32和45.2 kHz：在各频率下，声压级（SPL）从90 dB开始，高SPL时以10 dB为步长递减，接近阈值时以5 dB为步长递减。听力阈值定义为能诱发出可重复I波的最低声压级；若在90 dB SPL下未记录到ABR波形，则将阈值记为95 dB。比较各组间I波振幅和潜伏期的差异。
畸变产物耳声发射（DPOAE）检测
DPOAE与ABR同步检测。小鼠麻醉后，将ER10B+麦克风系统（美国伊利诺伊州埃尔克格罗夫村Etymotic公司）的耳塞插入耳道。采用一级纯音f1（频率为8、16、32 kHz）和二级纯音f2（f2/f1比值为1.2）诱发DPOAE；刺激强度从90 dB SPL降至10 dB SPL，以10 dB为步长递减；对2f1-f2频率处的反应信号进行512次平均。
免疫荧光染色
将小鼠深度麻醉后，通过颈椎脱臼法处死，取出耳蜗并浸泡于冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS）中。在耳蜗顶端和圆窗处钻孔，移除镫骨以暴露卵圆窗。随后将耳蜗置于4%多聚甲醛（PFA）中，在室温下固定2小时。于4℃条件下，用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙48小时后，骨迷路会变得柔软且半透明。在解剖显微镜下分离基底膜，并将其分为顶回、中回和底回。用1%曲拉通X-100（Triton X-100）透化膜30分钟，再用10%牛血清白蛋白封闭1小时。加入靶向特定蛋白的一抗（表1），在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤3次后，加入荧光标记二抗（表1）孵育1-2小时，随后再次洗涤3次。将基底膜用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，用于细胞核染色）的抗荧光淬灭封片剂封片。使用共聚焦激光扫描显微镜（蔡司LSM 980，德国奥伯科亨市蔡司集团）拍摄图像，并用ImageJ软件对荧光强度和细胞标志物进行定量分析。
表1 本研究中使用的抗体
细胞培养与处理
HEI-OC1细胞（House Ear Institute-Organ of Corti 1细胞，即耳蜗Corti器细胞）采用高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）培养，培养基中添加10%胎牛血清（Gibco公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市），并置于33℃、10%二氧化碳（CO₂）的环境中培养。参照已建立的实验方案[49]，加入20μmol/L顺铂处理24小时以诱导细胞损伤。联合处理组中，顺铂与氢化镁（MgH₂）共同给药并孵育24小时，以评估MgH₂的保护作用并确定最佳保护浓度。两种人神经母细胞瘤（NB）细胞系（IMR-32和SH-SY5Y）的培养参照此前文献描述的方案进行[51,52]。
细胞活力检测
采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，HY-K0301，美国新泽西州蒙茅斯章克申市MedChemExpress公司）评估细胞活力。将细胞以每孔5000个的密度接种于96孔板，孵育过夜后，分别用20μmol/L顺铂和不同浓度的MgH₂处理24小时。更换为含10% CCK-8试剂的新鲜培养基后，将细胞置于37℃下孵育1-4小时。使用酶标仪测定450nm处的吸光度值。每个实验条件设5个复孔，以空白孔作为对照。细胞活力以未处理对照组的百分比表示。
Annexin V/PI流式细胞术分析
采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences Pharmingen公司，美国加利福尼亚州圣迭戈市），通过流式细胞术评估HEI-OC1细胞的凋亡率。收集HEI-OC1细胞，用PBS洗涤2次，然后重悬于1×结合缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL。随后加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶（PI），在室温避光条件下孵育10-20分钟。孵育结束后，加入500μL结合缓冲液，立即用流式细胞仪分析凋亡细胞，并用FlowJo软件处理数据。每个实验条件至少重复3次，以确保结果的可重复性。
耳蜗组织外植体培养
耳蜗组织外植体取自出生后3天（P3）的C57BL/6J小鼠（由上海杰思捷实验动物有限公司提供），将其接种于Cell-Tek包被的圆形盖玻片上，采用DMEM/F12培养基（11320082，Gibco公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）培养，培养基中添加1% N-2添加剂（17502001，Gibco公司）、2% B-27添加剂（17504044，Gibco公司）和100μg/mL氨苄青霉素（A5354-10ML，上海生工生物工程股份有限公司），培养环境为37℃、5% CO₂，培养24小时。之后，用20μmol/L顺铂（单独或联合MgH₂）处理外植体24小时。在正常培养基中恢复培养24小时后，将外植体置于4% PFA中，在室温下固定1小时。通过肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫荧光染色评估毛细胞（HC）活力，并参照此前方法，用ImageJ软件手动计数毛细胞数量。
TUNEL检测与活性氧（ROS）检测
将耳蜗组织外植体用4% PFA固定30分钟，1% Triton X-100透化10分钟，然后加入TUNEL反应液（C1089，上海碧云天生物技术有限公司）或MitoSOX Red荧光探针（S0061S，上海碧云天生物技术有限公司），在37℃下孵育1小时以标记凋亡细胞。采用DAPI染色显示细胞核，肌球蛋白VIIa抗体标记毛细胞。染色完成后，在共聚焦显微镜下观察并分析耳蜗组织中的凋亡细胞。
RNA提取与实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
采用EZ-press RNA纯化试剂盒（EZBioscience公司，美国明尼苏达州罗斯维尔市），从每个样本的2只小鼠耳蜗中提取总RNA。使用4×逆转录大师混合液（4× Reverse Transcription Master Mix）将RNA逆转录为cDNA：42℃孵育15分钟（逆转录反应），随后95℃孵育30秒（酶灭活）。采用2× SYBR Green qPCR大师混合液（2× SYBR Green qPCR Master Mix），在LightCycler 96系统（罗氏公司，德国曼海姆市）上进行qRT-PCR检测。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，对目的基因表达水平进行标准化处理。每个反应设3个复孔，所有实验至少重复3次以确保可重复性。引物序列见表2。
表2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）所用引物**
信使核糖核酸（mRNA）测序
在药物处理后3天和7天，收集各组小鼠的耳蜗组织（排除前庭区域），每个样本合并4个耳蜗，采用TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市）提取RNA。检测RNA纯度和浓度后，使用VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒构建测序文库。转录组测序和生物信息学分析由上海欧易生物医学科技有限公司（OE Biotech Co., Ltd）完成。
参照此前研究使用的方案[53]，在Illumina NovaSeq 6000平台上对RNA测序文库进行测序，每个样本产生约5000万条原始读数（raw reads）。质控后，使用HISAT软件将清洁读数（clean reads）与参考基因组比对，并以每千碱基转录本序列每百万测序读数中的片段数（FPKM）量化基因表达水平。采用DESeq2软件进行差异表达分析，以Q值<0.05且倍数变化（fold-change）>2或<0.5为阈值，筛选显著差异表达基因（DEGs）。通过超几何检验对差异表达基因进行功能富集分析，以识别在基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路、Reactome通路和WikiPathways中显著富集的条目。使用基因集富集分析（GSEA）软件进行GSEA分析，评估预定义基因集的富集情况。
蛋白质印迹（Western Blot）检测
将HEI-OC1细胞在含蛋白酶抑制剂（GRF101，Epizyme公司，美国马萨诸塞州剑桥市）的RIPA裂解缓冲液（PC101，Epizyme公司）中匀浆。将匀浆液在4℃、15000×g条件下离心20分钟，去除细胞碎片。采用二辛可宁酸（BCA）蛋白质定量试剂盒（P0012，上海碧云天生物技术有限公司）测定蛋白质浓度。取等量蛋白质（20-40μg）上样至4%-20%梯度十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶（PG113，Epizyme公司）中进行电泳分离，随后将蛋白质转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐溶液（含吐温20，TBST）封闭膜1小时后，加入一抗在4℃下孵育过夜。洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。使用Omni-ECL™ Femto超灵敏化学发光试剂盒显影蛋白质条带，并用ChemiDocXRS成像系统拍摄图像。用ImageJ软件对目的蛋白质条带进行定量分析，以β-actin作为内参蛋白校正数据。每个实验重复3次。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
采用商品化小鼠ELISA试剂盒（Abclonal公司，中国武汉市）检测耳蜗组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）和白细胞介素-10（IL-10）的表达水平。每个样本包含2个耳蜗，将耳蜗在裂解缓冲液中匀浆，离心后收集上清液。使用酶标仪测定450nm或570nm处的吸光度值，通过将吸光度值代入标准曲线计算细胞因子浓度。
统计学分析
采用GraphPad Prism（10.2.0版本）进行统计学分析。数据以“平均值±标准差”或“平均值±标准误”表示，均来自至少3次独立生物学重复实验。两组间比较采用非配对双尾Student t检验；三组及以上比较采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后通过Tukey多重比较检验确定组间具体差异。统计学显著性定义为双侧P<0.05，更高显著性水平分别标注为**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001。免疫荧光强度、灰度值测量等专项数据分析采用ImageJ软件完成。所有实验均至少独立重复3次，以确保结果的可靠性和可重复性。
结果
氢化镁（MgH₂）在体内减轻顺铂诱导的听力损失
处理后7天，听觉脑干反应（ABR）检测显示，单纯顺铂组在所有测试频率（4、8、16、22.6、32和45.2kHz）下均出现显著的阈值偏移，与对照组相比，阈值分别升高51±1.0dB、75±0.0dB、75±1.6dB、70±2.7dB、52±2.6dB和45±3.5dB。相比之下，顺铂+MgH₂组的阈值偏移显著减小，在32kHz和45.2kHz频率下，阈值分别降低32dB和22dB。这些结果表明，单纯顺铂组在所有频率下均出现明显听力损失，而顺铂+MgH₂组的听力损伤程度显著减轻（图2A、B）。此外，阈上功能分析显示，与单纯顺铂组相比，顺铂+MgH₂组的I波振幅更高、潜伏期更短；而单纯顺铂组的ABR阈值超过90dB SPL，无法测量其I波振幅和潜伏期（图2C、D）。上述结果表明，MgH₂能有效缓解顺铂诱导的听力损失，并在多个频率下维持听觉敏感性。
图2.氢化镁（MgH₂）减轻C57BL/6J小鼠中顺铂诱导的听力损失。A. 处理前C57BL/6J小鼠的基线听觉脑干反应（ABR）阈值。B. 处理后7天各组小鼠的ABR阈值偏移，用于评估听力损失情况（n=5）。C、D. 以I波振幅和潜伏期衡量的阈上听觉功能，用于检测听觉神经反应的完整性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
氢化镁（MgH₂）缓解顺铂诱导的外毛细胞功能障碍与退化
药物处理后7天，对比单纯顺铂组与对照组发现，顺铂处理导致8、16和32kHz频率下的畸变产物耳声发射（DPOAE）振幅显著降低。但处理后7天，与单纯顺铂组相比，顺铂+MgH₂组在8kHz和16kHz频率下的DPOAE振幅下降幅度更小；在32kHz频率下，两组的DPOAE振幅均显著降低，且组间无显著差异（图3A）。这些结果表明，MgH₂能有效保护外毛细胞（OHC）功能，尤其在8kHz和16kHz频率下效果显著。
图3.氢化镁（MgH₂）缓解顺铂诱导的外毛细胞（OHC）功能障碍与丢失。A. 在8、16和32kHz频率下进行DPOAE检测，评估外毛细胞功能（n=5）。B. 通过免疫荧光染色和形态学分析，评估耳蜗顶回、中回和底回的内毛细胞（IHC）与外毛细胞存活情况。C. 耳蜗图显示整个基底膜上外毛细胞的丢失情况（n=3）。D. 各组每毫米基底膜上存活的内毛细胞数量。****P<0.0001。
药物处理后7天，单纯顺铂组出现显著的外毛细胞丢失，且细胞死亡率从耳蜗顶回（约20%）到底回（约80%）逐渐升高（图3C）。具体而言，单纯顺铂组在外毛细胞丢失率方面：顶回（距耳蜗顶端20%处）为6.1%±5.8%，中回（50%处）为54.1%±35.3%，底回（80%处）为92.3%±4.3%（图3B、C）。相比之下，联合MgH₂处理的小鼠外毛细胞丢失极少：顶回（20%处）丢失率为0.9%±1.9%，中回（50%处）为4%±4.9%，底回（80%处）为10.8%±4.8%，这些数值与对照组无显著差异。值得注意的是，所有组的内毛细胞（IHC）存活情况基本未受影响（图3D）。尽管未观察到内毛细胞显著丢失，但我们认为这并不能排除其存在功能损伤的可能性，这一点仍需进一步研究。
氢化镁（MgH₂）缓解顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡
用不同浓度的顺铂（0、5、10、20、40和80μmol/L）处理HEI-OC1细胞24小时，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。结果显示，顺铂以剂量依赖性方式降低细胞活力，半数抑制浓度（IC₅₀）为20μmol/L，此时细胞存活率为47.45%（图4A）。基于此结果，后续实验选择20μmol/L作为顺铂处理浓度。单独使用MgH₂时，浓度低于0.5mg/mL时无毒性，浓度更高则会产生毒性（图4B）。用20μmol/L顺铂分别与0.06mg/mL、0.125mg/mL MgH₂联合处理细胞，可显著减少细胞死亡，存活率分别达到95.50%和96.80%；其中0.06mg/mL被确定为发挥保护作用的最佳浓度（图4C）。
为评估MgH₂是否会干扰顺铂的抗肿瘤活性，研究使用了两种已广泛研究的神经母细胞瘤（NB）细胞系——IMR-32和SH-SY5Y[54]。体外联合处理实验表明，MgH₂在这两种细胞系中均未降低顺铂的细胞毒性（图S1）。
图4.氢化镁（MgH₂）缓解顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡。A- C. 通过CCK-8检测，评估不同浓度顺铂和MgH₂处理24小时后HEI-OC1细胞的活力。D、E. 通过流式细胞术，检测顺铂单独处理与顺铂+MgH₂联合处理后HEI-OC1细胞的凋亡率。F、G. 通过蛋白质印迹（WB）检测并分析顺铂单独处理与顺铂+MgH₂联合处理后，HEI-OC1细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平（n=3）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
流式细胞术进一步验证显示，单纯顺铂组的细胞死亡率为16.71%，而联合MgH₂处理组的细胞死亡率降至10.26%，这一结果支持“MgH₂可有效减轻顺铂诱导的细胞死亡”这一结论（图4D、E）。此外，蛋白质印迹分析显示，与单纯顺铂处理组相比，联合处理组HEI-OC1细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著上调约3.2倍，而促凋亡蛋白Bax的表达降低3.4倍（图4F、G）。
氢化镁（MgH₂）通过减少耳蜗外植体的氧化应激，缓解顺铂诱导的凋亡
将出生后3天（P3）野生型C57BL/6J小鼠的耳蜗外植体进行体外培养，用20μmol/L顺铂联合0.125mg/mL MgH₂处理24小时，随后在培养基中恢复培养24小时。通过肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）和αII血影蛋白（spectrin αII）抗体进行免疫荧光染色，量化耳蜗顶回、中回和底回中存活的外毛细胞数量。结果显示，单纯顺铂处理的外植体中，外毛细胞显著丢失，每个耳蜗回的外毛细胞数量仅为150个/毫米；相比之下，顺铂+MgH₂联合处理的耳蜗外植体中，外毛细胞存活率显著更高，每个回的外毛细胞数量为400个/毫米，与对照组相当（图5A）。
免疫染色结果显示，单纯顺铂组中，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性毛细胞和活化胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）阳性毛细胞数量显著增加；而顺铂+MgH₂组的凋亡细胞数量显著减少（图5B-E）。考虑到氧化应激在顺铂诱导的耳蜗损伤中起核心作用，研究进一步检测了MgH₂是否能减少活性氧（ROS）的产生。通过MitoSOX Red染色评估线粒体氧化应激水平，结果显示，与对照组相比，单纯顺铂组中MitoSOX阳性毛细胞数量显著增加，线粒体ROS水平升高（图5F、G）。综上，这些结果表明，MgH₂至少可通过减轻氧化应激，缓解顺铂诱导的凋亡。
图5.氢化镁（MgH₂）缓解耳蜗外植体中顺铂诱导的凋亡与氧化应激。A. 通过肌球蛋白VIIa和αII血影蛋白抗体免疫荧光染色，量化顺铂单独处理与顺铂+MgH₂联合处理后，耳蜗外植体中毛细胞的存活情况。B-E. 通过TUNEL染色（n=3）和活化胱天蛋白酶-3染色，检测耳蜗外植体中的凋亡细胞，评估MgH₂对顺铂诱导毛细胞凋亡的保护作用。F、G. MitoSOX Red染色显示，MgH₂处理可降低顺铂处理后小鼠耳蜗外植体中的线粒体活性氧（ROS）水平。（比例尺：30微米）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
氢化镁（MgH₂）通过调控NLRP3介导的炎症反应，保护耳蜗免受顺铂诱导的损伤
RNA测序结果显示，对比顺铂+MgH₂组与单纯顺铂组，共筛选出显著差异表达基因（DEG）648个，其中389个基因下调，259个基因上调（图6A）。研究展示了“单纯顺铂组vs顺铂+MgH₂组”中，通过基因本体（GO）分析筛选出的前30个上调生物学过程，以及通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析筛选出的20个最显著富集的信号通路（图6B、C）。这些通路主要与急性炎症反应、核因子-κB（NF-κB）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、趋化因子信号通路和NOD样受体信号通路相关，提示炎症在此过程中起核心作用。
值得注意的是，基因集富集分析（GSEA）显示，与单纯顺铂组相比，顺铂+MgH₂处理组中白细胞介素-1β（IL-1β）产生的调控水平降低（图6D）。对与IL-1β产生相关的差异表达基因进行热图分析，进一步显示MgH₂处理可抑制炎症相关关键基因的表达，包括髓系分化因子88（Myd88）、 Toll样受体4（Tlr4）、NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（Nlrp3）、Gasdermin D（Gsdmd）、胱天蛋白酶-1（Casp1）和凋亡相关斑点样蛋白（Pycard）（图6D）。与体外研究结果一致，耳蜗组织的转录组分析进一步显示，单纯顺铂组中凋亡和氧化应激通路显著上调，而MgH₂联合处理可显著抑制这两条通路的激活（图S2）。
图6.通过调控NLRP3炎症小体激活与炎症反应，探究氢化镁（MgH₂）对顺铂诱导耳蜗损伤的保护作用。A. 采用RNA测序技术，评估单纯顺铂处理与顺铂+MgH₂联合处理小鼠耳蜗的转录组变化，筛选出显著上调和下调的基因。B、C. 通过基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，确定与处理条件相关的关键生物学过程及显著富集的信号通路。D. 白细胞介素-1β（IL-1β）产生相关基因的热图，展示基因表达聚类模式：红色表示表达水平相对较高，蓝色表示表达水平相对较低；采用基因集富集分析（GSEA）评估单纯顺铂组与顺铂+MgH₂组间IL-1β产生的变化（标准化富集分数NES=2.39，P<0.001）。E. 通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR），检测处理后小鼠耳蜗组织中炎症相关基因（包括Nlrp3、Pycard、Gsdmd、Casp1、Il-1β和Il-18）的表达水平。F. 采用酶联免疫吸附试验（ELISA），定量检测处理后1天和3天耳蜗样本中促炎细胞因子IL-1β、IL-18及抗炎细胞因子IL-10的水平。G. 通过qRT-PCR，检测处理后小鼠耳蜗组织中凋亡相关基因（包括Bcl-2和Bax）的表达水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，**P<0.0001。
为进一步验证上述发现，我们通过qRT-PCR检测了炎症损伤相关基因（包括Nlrp3、Pycard、Gsdmd、Casp1、Il-1β和Il-18）的表达水平（图6E）。结果显示，单纯顺铂组中这些基因的表达显著上调；而与单纯顺铂组相比，顺铂+MgH₂联合处理组中这些基因的表达显著降低。这表明MgH₂可抑制NLRP3的激活，而NLRP3在耳蜗炎症反应中发挥关键作用。
为进一步量化炎症反应，我们采用ELISA检测了处理后1天和3天耳蜗组织中的炎症细胞因子水平（图6F）。结果显示，与单纯顺铂组相比，MgH₂处理显著降低了IL-18的水平，同时提高了抗炎细胞因子IL-10的表达。综上，这些结果证实，MgH₂可通过抑制NLRP3激活，有效减轻顺铂诱导的耳蜗炎症反应。
此外，我们还探究了MgH₂在体内对顺铂诱导细胞凋亡的保护作用。qRT-PCR分析显示，顺铂处理显著下调了抗凋亡基因Bcl-2的表达；而与单纯顺铂组相比，顺铂+MgH₂联合处理可有效恢复Bcl-2的表达水平（图6G）。这些发现与我们此前在细胞层面和耳蜗外植体层面的实验结果一致，为“MgH₂可保护耳蜗免受顺铂诱导的凋亡通路损伤”提供了有力证据。
讨论
本研究提供了充分证据，证实MgH₂能有效缓解顺铂诱导的听力损失，并显著维持耳蜗功能。具体而言，MgH₂对听觉系统的关键组成部分——毛细胞（HC）具有保护作用，其作用机制具有多效性，主要包括：减轻顺铂引发的线粒体氧化应激、抑制驱动促炎细胞因子释放的NLRP3激活，以及阻断耳蜗微环境中的凋亡信号通路。这些发现凸显了MgH₂作为预防听力损失潜在干预手段的治疗价值，其中NLRP3被确定为其保护作用的潜在调控分子。
在缓解顺铂诱导的听力损失方面，MgH₂相比目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗药物硫代硫酸钠（STS）具有多项优势。STS通过清除活性氧（ROS）并与顺铂形成无生物活性的复合物发挥耳保护作用，但这种复合物的形成会削弱顺铂的抗癌疗效，从而降低其临床治疗潜力[33]。相比之下，MgH₂不会干扰顺铂的抗癌特性，是一种更具潜力的替代方案。
此外，STS的临床应用还受限于其狭窄的治疗窗口（需在顺铂处理后6小时内给药），且关于其在成人人群中的疗效数据尚不充分。与之不同，MgH₂颗粒尺寸极小，能够有效穿透血-迷路屏障（BLB），在耳蜗外淋巴中蓄积，并到达细胞核和线粒体等发挥治疗作用的靶点部位[55-57]。这些特性表明，MgH₂在保护耳蜗免受顺铂损伤的同时，还能维持顺铂的抗癌活性，有望成为一种更高效、更安全的替代方案。
MgH₂的创新材料设计实现了氢气（H₂）的可控局部释放，相比传统H₂补充方式有显著进步。传统H₂递送方式（如吸入H₂气体、静脉输注富氢盐水）存在诸多局限性：尽管有研究表明，与单纯顺铂组相比，吸入2% H₂气体可使豚鼠在30kHz频率下的电生理阈值偏移降低24dB[42]，但这种方式存在全身清除快、个体间差异大的问题，均会影响治疗的一致性和整体效果；静脉输注富氢盐水虽能实现更可控的释放，但由于药物在体内广泛分布，仍难以在耳蜗中维持稳定的H₂浓度。
相比之下，MgH₂通过单次鼓膜注射即可实现H₂的靶向局部递送，有效克服了上述挑战。其在圆窗膜处形成的“储库效应”可确保H₂的长期滞留，从而实现更稳定、持续的治疗效果。这种局部递送系统能保证耳蜗部位H₂浓度的一致性，减少个体间差异，提升治疗的可靠性。
MgH₂通过调控关键凋亡调控因子，有效减轻顺铂诱导的细胞凋亡：它可降低促凋亡蛋白Bax的表达，同时提高抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，从而恢复Bax/Bcl-2平衡。从机制上看，我们的研究表明，这种保护作用至少部分是通过减轻氧化应激介导的。
此外，本研究还揭示了顺铂诱导的氧化应激与NLRP3激活之间存在复杂的相互作用，尽管二者相互作用的精确分子机制尚未完全明确。以往研究提出，ROS可能通过氧化硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）激活NLRP3，进而促进炎症小体组装[58,59]；ROS也可能通过线粒体DNA释放或钾离子（K⁺）外流间接触发NLRP3激活，而这两种途径都是已证实的炎症小体形成的启动因素[60,61]。值得注意的是，MgH₂似乎能减少ROS蓄积，这可能会阻断ROS介导的TXNIP氧化，或减轻线粒体功能障碍——这两个过程都是NLRP3激活的关键步骤。未来可通过使用ROS清除剂或线粒体靶向抗氧化剂开展研究，进一步明确在该模型中氧化应激是否是NLRP3激活和细胞凋亡的主要驱动因素。
此外，ROS可同时触发凋亡通路和NLRP3炎症小体通路，其中胱天蛋白酶-1（Caspase-1）在介导这两条通路的交叉对话中发挥关键作用，可能将焦亡与凋亡联系起来[62,63]。需注意的是，当前的平行通路模型是一种简化表述，这些通路之间可能存在动态相互作用，这一点仍需进一步研究。
此外，我们的RNA测序分析还发现了多种炎症介质（包括Tlr2/6/8、Nod1/2、Myd88、Gbp5和Ccr5），它们超出了经典的NLRP3通路范畴。这些炎症反应主要由TLR/NOD-MyD88-NF-κB信号轴驱动：受应激的毛细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs），模式识别受体识别这些分子后，激活该信号轴。值得注意的是，研究显示MgH₂可广泛抑制这些炎症通路，表明其具有广谱抗炎作用。未来可通过单细胞RNA测序进一步剖析细胞类型特异性转录反应，明确MgH₂的细胞靶点。
同时，镁（Mg）本身在这些保护作用中的角色也不容忽视。已知镁具有抗炎特性[64-66]，Mg很可能与H₂协同作用，共同介导MgH₂的治疗效果。尽管Mg与H₂相互作用的具体机制仍在研究中，但有研究表明，H₂的直接作用靶点可能是血红素（尤其是血红素铁原卟啉形式）[67]：在缺氧条件下，H₂可与血红素的催化功能相互作用，产生一氧化碳（CO）。已有研究证实，CO对顺铂诱导的耳毒性具有保护作用[68]，这可能也是MgH₂治疗潜力的一部分。
在临床实践中，鼓膜穿刺注射（经鼓膜注射）被广泛认为是内耳局部药物递送的首选方式。直径不超过1微米的分子可通过细胞间或跨细胞途径穿过圆窗膜，直接进入内耳[69]。鼓膜穿刺注射糖皮质激素已被用于治疗多种听觉疾病，包括突发性感音神经性听力损失、耳鸣、自身免疫性内耳病和梅尼埃病。实验研究也证实，局部给药的糖皮质激素具有耳保护作用，尤其在减轻顺铂诱导的耳毒性方面效果显著。与全身给药相比，这种靶向递送方式可使内耳中的药物浓度显著升高，同时最大限度地减少全身副作用，并维持顺铂的抗癌疗效，是一种极具潜力的耳保护策略。
尽管本研究证实MgH₂能有效保护耳蜗毛细胞，但它在促进毛细胞再生、确保听力功能长期维持方面的潜力仍不明确。此外，耳蜗高频区域存在功能损伤的现象表明，MgH₂可能无法对所有频率下顺铂诱导的损伤提供完全保护。未来需要进一步研究：探索全身给药或无创给药等替代递送方式，以提高其临床适用性；将MgH₂与针对其他机制的治疗药物联合使用，构建更全面的顺铂耳毒性预防策略；阐明MgH₂调控NLRP3激活和炎症微环境的精确分子机制；深入探索MgH₂的药代动力学特征，包括长期效应、潜在副作用和临床安全性；开展临床试验，在大样本队列中评估MgH₂的疗效，确定其用于人体的最佳剂量和长期安全性。
综上，本研究表明MgH₂是缓解顺铂诱导耳毒性的潜在治疗候选药物。通过保护耳蜗毛细胞，MgH₂解决了外周听觉系统的关键脆弱点；其保护作用源于减轻线粒体氧化应激、调控耳蜗微环境中NLRP3介导的炎症细胞因子，以及抑制细胞凋亡（图7）。
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