本研究来自土耳其，该国学者在氢气用于食品加工和保鲜方面进行了大量研究。这一研究是对茶叶渣渣成分提取的研究，发现氢水能显著提高茶叶内提取物的提取效率。这对于我们使用氢水有一定借鉴价值。例如我们用氢水泡茶，能泡出更多茶叶有利成分，结果可能是节省茶叶或增加茶叶的品质。曾经有人告诉我说，氢水泡茶好茶更好，劣茶口感更差。如果从这个逻辑出发，这种感觉就好理解了。另外这个研究对于中药的研究和应用也有借鉴价值。用氢水熬制中药，可能也能增加药物的效果。
全球范围内大量产生的茶叶废料引发了人们对环境的担忧。通过提取茶叶废料中的植物化学成分，可实现其价值提升。在本研究中，除了使用乙醇/水（体积比50/50）、乙醇/镁水（体积比50/50）和纯水（作为对照）外，还研究了利用两种富氢水（HRW），即鼓泡充氢法制备的富氢水和镁水反应法制备的富氢水（镁水），从红茶废料中回收酚类物质、黄酮类化合物和抗氧化剂的情况。富氢水的提取率最高，达到了30.13%。富氢水提取物中的总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）以及抗氧化剂（DPPH和ABTS）的含量均为最佳，其次是乙醇/镁水（体积比50/50）提取物。当使用富氢水和镁水作为溶剂替代纯水进行提取时，总酚含量、总黄酮含量、DPPH和ABTS的含量分别增加了193.05%、210.56%、49.21%和86.60%，以及59.70%、33.46%、28.66%和58.25%。在富氢水提取物中发现了最高含量的酚酸（对香豆酸、绿原酸、没食子酸）和黄酮类化合物（芦丁和表儿茶素）。氢气提取法可被认为是一种从农产品加工废料中提取酚类物质的可持续方法。
研究亮点
大量的茶叶生产产生了大量富含酚类物质的茶叶废料。
富氢水的提取率最高。
富氢水提取物中的酚类物质、黄酮类化合物和抗氧化剂含量最高。
富氢水使总酚含量、总黄酮含量和抗氧化剂含量提高了约两倍。
富氢水是一种从农产品加工废料中提取酚类物质的绿色方法。
引言
面对全球粮食安全危机，及时且可持续的解决方案似乎势在必行，而气候变化及其对农作物产量和粮食供应的毁灭性影响，更是加剧了这一危机。此外，由于世界人口的逐渐增加以及消费的不断增长，产生了大量的农产品加工废料，如茶叶废料（贡杜扎尔普，2016年）。
茶叶作为一种在全球广受欢迎的饮品，是食品行业农产品加工废料的重要来源。2021年全球茶叶产量达到了惊人的633万吨（联合国，2022年），导致产生了500万吨的大量废料（库马尔等人，2023年）。这些研究结果有望通过为茶叶废料的利用提供可持续的解决方案，彻底改变茶叶行业。茶叶废料已被提议用作农业肥料以及生产咖啡因、儿茶素和其他酚类物质的原材料（奥扎斯兰等人，2022年）。
茶叶中含有4000多种化学成分，是含有大量黄酮类化合物的植物之一（居比尔，2015年）。茶叶中多酚的含量因茶叶加工过程中所采用的氧化工艺不同而有所差异（奥金达·奥武尔等人，2006年）。
人们采用了不同的提取方法来提高植物化学成分（如酚类化合物）的回收率。有些方法需要昂贵的设备，而另一些方法则需要额外的制备步骤，这增加了能源、溶剂的消耗以及成本和时间成本。人们已使用了各种提取方法从茶叶和茶叶废料中回收植物化学成分，如经典提取法（玛丽亚·约翰等人，2006年）、微波辅助提取法（李和江，2010年）、超声辅助提取法（霍尔齐克等人，2012年）、高压提取法（君，2009年）和超临界流体提取法（伊琴和古鲁，2009年）。然而，使用可持续且具有成本效益的技术对于保护地球的自然资源至关重要。
氢气（H₂）是一种无毒、惰性且具有还原性的气体。氢气具有超过36种物理、化学和生物学特性，其中抗氧化特性在食品加工中最为重要（阿尔瓦泽尔，2024a）。由于其分子小且扩散性高，氢气能够穿透许多膜、组织和塑料材料。氢气的这些特殊性质为研究人员打开了评估其在各个领域潜在应用的大门，这些领域包括健康领域（阿尔瓦泽尔，2024b；谢和宋，2024）、食品和农作物领域（阿尔瓦泽尔和恩金，2022；拉塞尔等人，2024）、农业领域（祖尔菲卡尔等人，2021；阿尔瓦泽尔和齐格德姆，2022）、生态和环境领域（科克蒂尔克等人，2022a，b），当然还有能源领域。最近，有研究报道了氢气能够提高从不同植物材料中提取酚类、黄酮类、花青素和抗氧化剂的效率（阿尔瓦泽尔和埃尔纳萨内尔卡希姆，2023；阿尔瓦泽尔等人，2023a，b，c；d；塞兰等人，2023；阿尔瓦泽尔，2023）。由于全球范围内产生了大量的茶叶废料，本研究旨在通过评估富氢水提取法作为一种从红茶废料中回收酚类物质的可持续方法的效率，来实现茶叶废料的价值提升。这些结果有助于开发基于生物的循环碳经济模式和生物-经济-环境-就业（Bio-E3）概念，创造促进经济、环境和就业的技术（萧和胡，2024）。
材料与方法
1. 化学试剂：本研究中的化学试剂（DPPH、ABTS、Trolox、抗坏血酸、槲皮素、3,4,5-三羟基苯甲酸、过硫酸钾、福林-酚试剂）均购自德国达姆施塔特的默克公司和美国密苏里州的西格玛公司。
2. 红茶废料的制备：红茶废料在实验室中制备，具体步骤如下。从当地市场购得干红茶。将25克干红茶茶叶放入一升水中煮沸5分钟，制备红茶浸液。然后将茶叶（废料）分离出来，并在35°C下干燥。将干燥后的茶叶废料研磨成粉末，并储存在-80°C的环境中。
3. 酚类物质的提取：提取过程按照阿尔瓦泽尔及其同事描述的方法进行（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。简要来说，将1克茶叶废料粉末与20毫升溶剂[（由美国密理博Milli-Q® Direct 8水纯化系统制备的纯水）、富氢水（HRW）、镁水（Mg水）、乙醇/镁水（体积比50/50）和乙醇/纯水（体积比50/50）]混合，然后在35°C下孵育24小时。随后进行溶剂蒸发。
4. 总酚含量的测定：按照阿尔瓦泽尔及其同事描述的方法测定茶叶废料提取物中的总酚含量（TPC）（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
5. 总黄酮含量的测定：按照阿尔瓦泽尔及其同事描述的方法测定茶叶废料样品中的总黄酮含量（TFC）（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
6. DPPH自由基清除能力的测定：按照阿尔瓦泽尔及其同事的方法测定茶叶废料样品的DPPH自由基清除能力（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
7. ABTS自由基清除能力的测定：按照阿尔瓦泽尔及其同事描述的方法测定茶叶废料样品的ABTS自由基清除能力（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
8. 高效液相色谱（HPLC）分析：酚类物质的分析采用阿尔瓦泽尔及其同事描述的HPLC方法（恩金等人，2025）。在酚类物质分析中，使用了HPLC-DAD仪器（美国安捷伦科技公司的1260 Infinity）和反相C18柱（ACE Generix，粒径250×4.6毫米，粒径5微米）。将20微升过滤后的茶叶提取物溶液（0.45微米膜滤器过滤）以0.8毫升/分钟的流速注入。采用梯度洗脱系统，流动相由两种溶剂组成，A（1%体积的磷酸水溶液）和B（乙腈），总运行时间为40分钟。梯度程序开始时A相占83%，然后在30分钟和35分钟时分别变为60%和83%。酚类化合物在350/200纳米波长下检测。
9. 统计分析：使用GraphPad Prism 9软件进行单因素方差分析。随后使用IBM SPSS Statistics 26软件包进行土耳其事后检验和邓肯多重比较检验。当差异水平低于0.05时，认为具有统计学显著性。整个实验重复进行，测量值重复三次（n = 3）。
结果与讨论
1. 提取率：提取率因溶剂类型而异。富氢水提取的红茶废料提取物的提取率最高，为30.13%，其次是乙醇/镁水（体积比50/50），提取率为21.86%，而纯水的提取率最低，为16.23%（P < 0.05）（表1）。在橄榄叶的提取中也有类似的结果，富氢水的提取率最高，增加率为34.42%，其次是乙醇/镁水（体积比50/50），增加率为29.33%，而纯水的提取率最低，增加率为19.27%（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
氢气由于其高扩散速率，能够轻松穿过植物细胞的细胞质膜，到达植物细胞的所有隔间和细胞器，并通过不同的可能机制增加酚类物质从植物材料中的分离（阿尔瓦泽尔，2023）。使用镁离子含量较高的镁水提取的茶叶废料的提取率低于富氢水提取物。茶叶中的酚类物质可通过与钙离子（Ca²⁺）和镁离子（Mg²⁺）等离子结合而部分保留（丹荣等人，2009）。
2. 总酚含量（TPC）：使用不同溶剂制备的茶叶废料样品的总酚含量值见表2。富氢水提取的茶叶废料提取物的总酚含量值最高，其次是乙醇/镁水（体积比50/50）样品，分别为163.70毫克没食子酸当量/克和134.06毫克没食子酸当量/克（P < 0.05）。此外，与纯水相比，使用乙醇水溶液作为溶剂增加了酚类物质的提取量。
结果表明，通过鼓泡法将氢气注入水中制备富氢水，比镁水反应法能提供更好的总酚含量水平。与纯水样品相比，富氢水样品的总酚含量值增加了193.05%。然而，用镁水代替纯水制备乙醇水溶液有效地提高了酚类物质的提取率（图1；表2）。这仅使总酚含量水平提高了77.56%（P < 0.05）（表3）。结果表明，单独使用富氢水或与乙醇一起使用，都能有效地提高酚类化合物的回收率。
溶解在富氢水中的分子氢具有多种特殊的物理、化学和生理特性，如抗氧化和氧化还原稳态调节特性（阿尔瓦泽尔，2024a）。由于酚类物质的氧化可被氢气等还原剂抑制，因此富氢水提取物中的酚类物质比纯水中的酚类物质得到了更好的保护和提取。柳和他的同事（2019年）也得到了类似的结果，他们发现与包括氮气、氧气、二氧化碳和空气在内的其他气体相比，使用氢气从新鲜绿茶茶叶中回收酚类物质的效果更强（柳等人，2019年）。作者在提取结束时检查了茶叶的形态结构，报告称富氢水处理过的茶叶发生了表面改性，表现出明显的柔韧性和平滑性，而其他气体处理的茶叶则没有这些特征。
人们提出了许多可能的机制来解释富氢溶剂对植物化学成分（如酚类物质）回收率的改善作用。这些机制包括：1）保护酚类物质免受氧化反应的影响；2）由于氢气的还原性，还原醌类和半醌类物质；3）清除最具反应性的自由基，即羟基自由基（•OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）；4）由于氢气的选择性抗氧化特性，清除多酚氧化酶反应产物；5）去除溶解氧；6）调节植物细胞细胞质的氧化还原稳态；7）改变水的物理结构；8）激活多糖单加氧酶，释放被包裹的酚酸；9）改变植物材料的表面结构（阿尔瓦泽尔，2023）。在亚铁离子存在下通过芬顿反应形成的羟基自由基是强氧化剂，几乎可以立即且无选择性地氧化介质中的所有抗氧化剂和酚类物质（沃特豪斯和劳里，2006）。已证明氢气能选择性地清除羟基自由基（大泽等人，2007）。
与纯水相比，使用像富氢水一样含有溶解氢的镁水，也能增加酚类物质的提取量，但比富氢水少，分别增加了59.70%和193.05%（P < 0.05）（表3）。这意味着介质中镁离子的存在对酚类物质的提取有负面影响，可能是由于酚类-镁络合物沉淀（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。先前的一项研究详细描述了其他可能解释镁对从橄榄叶中回收酚类物质产生负面影响的机制（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
3. 总黄酮含量（TFC）：使用不同溶剂制备的茶叶废料提取物的总黄酮含量值见表2。溶剂类型对总黄酮含量值有显著影响（P < 0.05）（表3）。与总酚含量值类似，富氢水提取物的总黄酮含量水平最佳（59.13毫克槲皮素当量/克提取物），其次是镁水提取物（25.41毫克槲皮素当量/克提取物）（P < 0.05）。此外，使用乙醇水溶液代替纯水作为溶剂有效地提高了黄酮类化合物的回收率。而且，乙醇/镁水（体积比50/50）（40.66毫克槲皮素当量/克提取物）的总黄酮含量值优于乙醇/水（体积比50/50）（22.29毫克槲皮素当量/克提取物）（图1；表2）。
图2由各种溶剂 [（纯水）、富氢水 （HRW）、镁水（Mg 水）、乙醇/水（50/50，% vol）和乙醇/Mg 水（50/50，% vol）] 制备的红茶废料提取物的植物化学物质.
结果表明，使用通过将氢气注入水中制备的富氢水是从茶叶废料中提取黄酮类化合物的最佳方法，与纯水提取物相比，其总黄酮含量增加了210.56%（P < 0.05）。通过镁水反应法制备富氢水的方法在提取黄酮类化合物方面也有效，但不如第一种方法，因为它仅使总黄酮含量增加了33.46%。然而，在制备乙醇水溶液（体积比50/50）时，使用含有溶解氢的镁水代替纯水，与乙醇/水（体积比50/50）相比，黄酮类化合物的提取率提高了82.41%（P < 0.05）（表3）。上述结果表明，最有效的方法是使用通过注入氢气制备的富氢水从茶叶废料中提取黄酮类化合物。氢气对黄酮类化合物提取产生积极影响的可能机制，与上述对酚类物质的讨论类似，因为黄酮类化合物是酚类化合物的一个亚组。
4. DPPH自由基清除能力：茶叶废料提取物的DPPH自由基清除能力见表2。结果表明，溶剂类型对茶叶提取物的DPPH自由基清除能力有显著影响（P < 0.05）。使用富氢水制备的茶叶废料提取物表现出最高的DPPH自由基清除能力（22.65毫克抗坏血酸当量/克提取物）（P < 0.05）。使用乙醇水溶液代替纯水作为溶剂有效地提高了茶叶废料提取物的DPPH自由基清除能力。此外，使用通过镁水反应制备的富氢水（镁水）的DPPH自由基清除能力也高于纯水（分别为19.53毫克抗坏血酸当量/克提取物和15.18毫克抗坏血酸当量/克提取物）（表2）。
与酚类和黄酮类化合物的结果类似，通过注入氢气制备的富氢水在从茶叶废料中提取抗氧化剂方面比通过镁水反应法制备的富氢水更有效。使用富氢水代替纯水使茶叶废料的DPPH自由基清除能力提高了49.21%（P < 0.0001），而使用镁水代替纯水仅使其提高了15.68%（P < 0.0001）（表3）。此外，使用镁水代替纯水制备乙醇水溶液对提高茶叶废料提取物的DPPH自由基清除能力有积极作用。
同样，茶叶废料的DPPH自由基清除能力的这些结果，可以用氢气由于其还原性对植物细胞中不同抗氧化剂稳定性的积极影响来解释。与富氢水样品相比，镁水样品中茶叶废料提取物的DPPH自由基清除能力较低，这可以用镁离子对许多抗氧化剂（如酚类物质）稳定性的负面影响来解释（阿尔瓦泽尔等人，2023d）。
ABTS自由基清除能力
使用不同溶剂制备的茶叶废料提取物的ABTS自由基清除能力见表2。结果显示，用富氢水制备的茶叶废料提取物具有最高的ABTS自由基清除能力（26.56毫克Trolox当量/克提取物），其次是镁水制备的提取物（22.55毫克Trolox当量/克提取物）（P < 0.05）。此外，用乙醇水溶液代替纯水作为溶剂能有效地提高茶叶废料提取物的ABTS自由基清除能力。而且，在制备乙醇水溶液时，用镁水代替纯水极大地提高了样品的ABTS自由基清除能力（表2）。镁水使茶叶废料样品的ABTS自由基清除能力提高了58.25%，而当用富氢水代替纯水时，这一数值提高了86.60%。然而，用镁水代替纯水来制备乙醇水溶液，仅使ABTS自由基清除能力提高了12.29%（P < 0.05）。结果表明，在提取抗氧化剂方面，用在纯水中注入氢气制备的富氢水，优于通过镁水反应制备的富氢水。这可能是由于镁离子对某些抗氧化剂（如酚类物质）的稳定性有负面影响，正如上文所解释的那样。
高效液相色谱（HPLC）分析
茶叶废料中的酚类物质概况见表4。结果表明，当使用富氢水作为提取溶剂时，一些酚类化合物，如反式阿魏酸、对香豆酸和芦丁的含量有所增加（图2）。
表4 不同溶剂制备的红茶废料提取物中的酚类化合物
图2 茶叶废料样品中酚类物质的高效液相色谱图
另一方面，其他酚类物质，如儿茶素，仅在富氢水提取物中出现。此外，虽然在纯水提取的茶叶废料中未检测到绿原酸，但它在富氢水和镁水样品中分别以904.32微克/克提取物和550.47微克/克提取物的含量出现。另外，当使用镁水作为溶剂时，没食子酸的含量增加了360.71微克/克，而当用镁水代替纯水来制备乙醇水溶液时，没食子酸的含量增加了22.72%。
结论
茶叶废料是酚类物质的丰富来源。结果表明，使用富氢水作为溶剂可以有效地提高从茶叶废料中对植物化学成分的回收率，这些成分包括酚类物质、黄酮类化合物和抗氧化剂。用乙醇水溶液代替纯水能有效地提高从茶叶废料样品中对所有植物化学成分的回收率。此外，尽管使用乙醇水溶液（体积比50/50）可以提高植物化学成分的提取率，但用镁水代替纯水来制备乙醇水溶液的效果更佳。当使用富氢水时，提取率也提高了约两倍。高效液相色谱分析证实了分光光度法的结果，表明富氢水提取物中的酚类物质含量显著增加，并且一些酚类物质只在这种溶剂的提取物中出现。使用富氢水从茶叶废料等农产品加工废料中提取植物化学成分，可被认为是一种环保且可持续的方法。氢气提取法的局限性之一是，当氢气与空气（氧气）以特定比例接触时，存在潜在的爆炸风险。不过，这种风险可以通过适当的安全措施来控制。这种新方法的另一个挑战是，它对各种生物化学成分缺乏选择性，这就需要对提取物进行后处理，以去除不需要的物质。需要进一步的研究来应对这些挑战，并开发针对原材料和目标物质的特定方法。
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