众多研究已证实氢气对多种疾病具有治疗和预防作用。羟基自由基是电离辐射间接效应的罪魁祸首，而氢气对羟基自由基具有选择性抗氧化特性，这使其有望成为一种新型辐射防护剂，值得关注。我们近期通过使用超细气泡，研发出了稳定性更高、抗氧化活性更强的新型富氢水。在本研究中，给予雌性C57BL/6J小鼠自由饮用超细气泡富氢水（UBHW），随后用X射线对其进行全身照射（WBI），并评估UBHW的辐射防护效果。接受6.0 Gy（亚致死剂量）全身照射后，饮用UBHW的小鼠30天存活率达到100%，而对照组小鼠仅为37%。若以6.5 Gy（致死剂量）进行全身照射，对照组小鼠约3周内全部死亡，而饮用UBHW的小鼠因羟基自由基清除活性较高，30天存活率提升至40%。通过蛋白质组学分析，在饮用UBHW的小鼠体内显著识别出26种与炎症和免疫反应相关的血清蛋白，UBHW可能增强并调节这些功能，从而减轻接受全身照射小鼠所受的损伤。我们得出结论，UBHW在辐射防护方面具有良好潜力，相关证据表明该领域值得进一步深入研究。
引言
电离辐射的主要生物学效应大致可分为直接效应和间接效应。直接效应不仅会导致DNA链断裂，还会改变DNA碱基以及糖 - 磷酸骨架；间接效应则涉及生物体内水分子被电离和激发后产生的活性氧（ROS）和自由基，如羟基自由基（$·OH$）、超氧阴离子（$O_2^-$）和过氧化氢（$H_2O_2$） 。约70%的辐射诱导DNA损伤由间接效应造成。在ROS和自由基的各种分子种类中，羟基自由基反应活性最强，会非特异性地氧化和修饰核酸、蛋白质及脂质，进而产生毒性。
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实验设计
超细气泡水的制备
体内X射线全身照射
体外X射线照射与电子自旋共振（ESR）光谱分析
血清采集
8 - 羟基脱氧鸟苷（8 - OHdG）的定量分析
液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析
差异表达蛋白的鉴定与富集分析
使用带有Statcel 3插件（日本埼玉县OMS公司）的Excel 2016软件程序（美国华盛顿州雷德蒙德市微软公司）计算显著性水平。通过单因素方差分析以及Tukey - Kramer或Bonferroni / Dunn多重比较检验，P值 < 0.05被认为具有统计学显著性。采用Kaplan - Meier分析，随后进行Mantel - Cox（对数秩）检验来分析小鼠存活率。
。饮用UBOW的组30天存活率为60%，但与饮用TW的组相比无显著差异（P = 0.3159）。各组之间或在每个测量日，小鼠体重均未观察到差异（图1B）。在接受6.5 Gy全身照射的情况下，饮用TW的组在约3周内全部死亡，而饮用UBHW或UBOW的组30天存活率分别提高到40%和20%，
（A）接受6 Gy或6.5 Gy X射线照射的C57Bl/6JJcl雌性小鼠，分别用UBHW（n = 10）、UBOW（n = 10）或弘前市自来水（TW，n = 8）处理后的生存Kaplan - Meier图；此外，未接受全身照射且仅饮用TW的小鼠作为对照组（n = 8）。通过对数秩检验确定差异的统计学显著性（P值 < 0.05（*））。每个点和垂直条表示平均值 ± 标准差。
（C）展示血细胞比容值（%）和血清8 - OHdG水平（ng/ml）。箱线图显示25%、50%和75%分位数。通过单因素方差分析和多重比较检验评估统计学显著差异；P值 < 0.05（*）或0.01（**）。
通过电子自旋共振（ESR）和自旋捕获技术测量UBHW对羟基自由基的清除能力
图2. UBHW对羟基自由基清除能力的测量**
（B）ESR光谱相对信号强度的时间进程，当DW中的$H_s/H_{Mn^{2 + }}$标准化为1.0时，绘制TW和UBHW中获得的$H_s/H_{Mn^{2 + }}$的相对值。每个水样都储存在阴凉、黑暗的地方，并在每个分析日暴露于X射线后进行分析。进行了三次独立实验。每个点和垂直条表示平均值 ± 标准差。对DW数据使用学生t检验进行统计处理，P < 0.05时用 * 表示，P < 0.01时用 ** 表示。
使用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）检测在接受亚致死剂量X射线全身照射（WBI）后第30天，分别持续饮用UBHW或TW的小鼠的血清蛋白表达情况，因为饮用TW的小鼠接受致死剂量的WBI会导致所有小鼠死亡。为了阐明UBHW减轻辐射损伤的机制，对所有小鼠血清样本的完整数据集进行主成分分析（PCA）以获得数据概述。如图3A所示，第一和第二主成分得分分别为34.0%和25.4%（椭圆表示基于Hotelling's T²的得分的95%容差区域）。对样品应用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS - DA）以可视化类别分离。OPLS - DA模型将所有判别信息集中到第一主成分中。图3B中OPLS - DA模型的得分散点图表明，使用一个预测成分和一个正交成分，持续饮用UBHW或TW的小鼠之间实现了令人满意的分离，它们沿着第一个预测成分完全分开。这些结果表明，血清蛋白质组学图谱可用于区分接受UBHW处理和TW处理的WBI小鼠。
（A）所有16只小鼠血清样本的PCA概述（每组n = 8）。未表征的样本绘制在中心，具有特征的样本绘制在离中心一定距离处。相似特征的样本绘制在相近位置。
（A）在火山图中，垂直线对应表达水平1.0倍的增加或减少，而水平线代表P值为0.05。图中的灰色点表示无统计学差异的蛋白质，红色/蓝色点分别代表显著上调/下调的蛋白质。
使用因自由摄入UBHW而上调（A）或下调（B）的可变血清蛋白进行KEGG功能富集分析。显示基于P值的KEGG通路气泡图。
讨论
意外暴露于高剂量辐射，如核灾难和辐射事故，可能因骨髓抑制和肠道紊乱导致死于急性辐射综合征（ARS） 。辐射暴露后必须立即进行适当的医疗治疗，但在放射紧急情况下治疗受害者的紧急医疗响应人员同样面临辐射暴露的风险 。随着核技术的发展和应用，电离辐射的内、外照射风险不断增加，因此从安全角度关注辐射预防和医疗对策的研究已多次被讨论。辐射防护药物是辐射诱导损伤临床管理的紧急医疗准备策略的特别重要组成部分 。辐射防护剂通常根据其作用机制分为四类：自由基清除剂、激活生物防御机制的药剂、防止全身吸收和沉积的药剂以及促进放射性核素排泄的药剂 ；此处介绍的UBHW被认为主要作为自由基清除剂发挥作用。氨磷汀（WR2721）已被开发为一种具有自由基清除特性（如对羟基自由基）的辐射防护剂。它是唯一被美国食品药品监督管理局批准用于临床的辐射防护剂 。然而，由于其剂量依赖性的副作用，如低血压、恶心和呕吐 ，该药物并未被广泛认为是一种有用的首选辐射防护剂。平野等人最近表明，尽管氢气是一种惰性物质，但与其他抗氧化剂相比，它是唯一具有线粒体通透性且能够还原羟基自由基的分子，这使其在未来医疗应用中具有前景 。他们认为选择性羟基自由基清除剂作为辐射防护剂可能具有潜在的医学应用价值。
<span style=\".\"font-family:\">本研究表明，在对接受WBI且饮用UBHW存活小鼠第30天的血清蛋白分析中，共发现375种差异表达蛋白。其中，提取出26种与TW相比在UBHW中表达显著改变的蛋白，其中9种上调，17种下调（表1）。基于9种上调血清蛋白的生物学过程的GO统计分析，筛选出再生、Cdc42蛋白、脂蛋白和磷脂转运（图4C）。这些蛋白在京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析中涉及胆固醇代谢、酒精性肝病、脂质与动脉粥样硬化、维生素消化与吸收以及非洲锥虫病（图5A）。Cdc42是一种小GTP酶，在细胞极性、增殖和血管修复中起关键作用，内皮Cdc42缺乏会损害炎症损伤后的血管再生 。这些发现突出了Cdc42及其脂质介导的调节在自由摄入UBHW导致的各种细胞过程中的重要性，并表明其对辐射暴露诱导的血管损伤可能具有潜在疗效。另一方面，基于生物学过程的GO统计分析表明，17种下调的血清蛋白与炎症反应、急性期反应、防御反应、免疫反应以及对另一生物体解剖结构的破坏有关（图4D）。这些蛋白在KEGG通路分析中涉及细胞因子 - 细胞因子受体相互作用、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、铁死亡和急性髓系白血病（图5B）。MAPK信号通路在调节无脊椎动物和脊椎动物的免疫和应激反应中起着至关重要的作用。MAPK磷酸酶 - 1是急性先天免疫反应的关键调节因子，控制炎症、代谢和急性期反应 。此外，铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的细胞死亡类型，受各种信号通路和防御机制调节，包括谷氨酸 - 胱氨酸反向转运体/谷胱甘肽/谷胱甘肽过氧化物酶4轴和NFE2L2依赖的抗氧化反应 。此外，森下等人最近报道了充氢超细气泡（$H_2$ NanoGAS®）水对大鼠因持续饮酒引起的肝脏氧化应激的抗氧化作用，表明充氢超细气泡显著抑制了血脂过氧化水平，并将线粒体电子传递系统的功能活性维持在正常水平 。因此，有人认为UBHW可能增强并调节这些功能，从而减轻接受亚致死剂量WBI小鼠的损伤。然而，本研究在真正理解UBHW的辐射防护作用方面存在许多局限性，例如小鼠的样本量和所检查的条件数量。未来的研究对于阐明UBHW在不同性别、年龄和各种小鼠品系中的辐射防护作用、辐射暴露后血清蛋白和线粒体功能的时间依赖性变化、对癌症、生活方式相关疾病和衰老等的预防作用以及对健康小鼠健康寿命的延长作用至关重要。此外，有必要研究UBHW的辐射防护作用是否仅归因于氢气，或者超细气泡本身是否也对辐射防护作用有贡献。
结论
本研究表明，富氢水，特别是UBHW形式，在减少辐射损伤方面具有潜在应用。然而，需要进一步研究以充分了解使用UBHW作为辐射防护剂的机制和潜在挑战。
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