氢水提高生菜耐盐性能的机制研究【江苏大学】
亮点
- 微纳米气泡富氢水地下滴灌（SDH）提高了生菜的耐盐性能。
- SDH增强了生菜的抗氧化能力和渗透调节物质的合成，并调节了离子稳态。
- 生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）水平的变化表明，应激激素信号传导参与了SDH介导的耐盐过程。
- 应用SDH增加了植物根际促生菌的数量，并提高了细菌多样性。
摘要
土壤盐渍化是一个严峻的环境问题，限制了全球农作物的生长和产量。微纳米气泡富氢水地下滴灌（SDH）是一种创新方法，可在实际农业生产中实现氢气（H₂）在提高植物抗盐胁迫能力方面的作用。然而，关于SDH如何影响植物耐盐性能的信息有限。特别是，其潜在的生理响应、激素调节及土壤微生物介导机制至今尚未见报道。在本研究中，我们探究了在正常和盐胁迫条件下，SDH对生菜（Lactuca sativa L.）生长、光合作用、根系发育、抗氧化系统、植物激素以及土壤微生物群落的影响。结果表明，在盐胁迫下，SDH显著提高了生菜的鲜重、光合作用活性和根系生长。叶片抗氧化酶活性增强，活性氧（ROS）含量降低，从而减轻了氧化损伤。丙二醛（MDA）含量降低，表明导致细胞损伤的膜脂过氧化程度较低。SDH还有助于维持渗透稳态，这体现在可溶性蛋白（SP）含量的增加上。Na⁺/K⁺ 比率和ROS的降低，并未引发应激反应激素脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的过量产生，从而减轻了其介导的生长抑制作用。SDH增加了土壤中植物根际促生菌（PGPR）的丰度，如节杆菌属（Arthrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）。这可能是生菜中激素吲哚乙酸（IAA）增加以及土壤中1 - 氨基环丙烷 - 1 - 羧酸（ACC）脱氨酶活性提高的原因，有利于抑制乙烯生成并促进植物生长。在正常条件下，除了根系发育外，受SDH影响的生理和生长指标变化与盐胁迫条件下相似。水中高浓度的溶解氢气可能会排出氧气。由此引发的土壤缺氧环境限制了氧气扩散，进而抑制了根系呼吸和生长。未来可进一步研究不同盐含量下氢气浓度对植物耐盐胁迫能力的影响。
引言
土壤盐渍化是一种有害的环境胁迫因素，威胁着农作物的产量和品质，阻碍了现代农业的可持续发展（托马兹等人，2020）。盐渍化影响了全球超过三分之一的灌溉土地（联合国粮食及农业组织，2011）。此外，不当的灌溉和施肥会导致土壤次生盐渍化，进而降低农田质量（琼斯和埃杰塔，2016；周等人，2022）。因此，开发一种绿色、可持续且环保的方法来提高植物的耐盐性成为一项具有挑战性的任务（李等人，2022；赵等人，2020）。
氢气（H₂）是一种无毒、无色、无味的气体（莫米尔兰和韦齐罗格鲁，2002）。大泽等人（2007）发现，H₂ 作为一种抗氧化剂，可以选择性地减少细胞毒性自由基，并改善大鼠的缺血性脑损伤。此后，H₂ 在生物医学领域的潜在治疗价值引起了研究人员的关注（陈等人，2023）。先前的研究还发现，在各种逆境胁迫下，如百草枯（金等人，2013）和盐胁迫（谢等人，2012；徐等人，2013），多种农作物自身会增加内源性H₂ 的产生。受临床应用和内源性H₂ 释放现象的启发，研究人员想知道施加氢气是否能提高植物对非生物胁迫的耐受性。
最常用的方法是将氢气溶解在水中制备富氢水（HRW）用于植物水培。由于H₂ 分子量小，它可以有效地扩散并穿透细胞膜。研究发现，HRW具有多种作用，从促进种子萌发（徐等人，2013）、增加幼苗生长（吴等人，2015）到促进不定根发育和侧根生长（林等人，2014；徐等人，2013）。同时，通过提高代表性抗氧化酶活性、维持非酶抗氧化物质（谷胱甘肽 - 抗坏血酸）稳态以及调节金属转运蛋白，HRW减轻了重金属积累和诱导的氧化损伤，如铝（陈等人，2014）、汞（崔等人，2014）和镉（苏等人，2019）。关于渗透胁迫，谢等人（2014）发现HRW通过增加细胞内H₂ 的产生和减小气孔孔径，增强了拟南芥的耐旱性。谢等人（2012）发现，在150 mM NaCl处理后，HRW增强了拟南芥幼苗根系对Na⁺ 的外排并维持了离子稳态。同时，HRW提高了抗坏血酸过氧化物酶（APX）的蛋白水平和总活性，以抑制ROS的过度产生和脂质过氧化。对于水稻种子萌发（徐等人，2013），HRW提高了抗氧化酶的总活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和APX，以减轻盐胁迫对水稻种子诱导的氧化损伤。尽管HRW已成功提高了植物对各种非生物胁迫的耐受性，但H₂ 在水中的低溶解度和短停留时间限制了其田间应用（李等人，2022）。目前的研究仅限于水培条件下的短期实验。
地下滴灌是农业生产中最有效的节水技术之一。它具有将蒸发、径流和深层渗漏造成的水分损失降至最低的优点（马丁内斯和雷卡，2014）。同时，微纳米气泡通常直径小于1μm，由于其尺寸小、浮力低和高效的气体溶解度，能够延长气体在水中的存在时间（特梅斯根等人，2017）。因此，在灌溉管道的长距离输送过程中，气泡和氢气在水中的稳定性可以得到提高。通过地下滴灌系统（SDH）将微纳米气泡富氢水直接输送到土壤中的根区，是基于氢气的农业生产的理想替代方案。然而，SDH是否能实现氢气的抗盐胁迫作用仍存在疑问，且相关研究非常有限。
对于盐胁迫，H₂ 的生理效应和主要缓解机制被发现为提高抗氧化能力、改善ROS清除系统以及调节负责Na⁺ 外排的反向转运蛋白和H⁺ 泵的基因/蛋白质（谢等人，2012）。土壤微生物参与土壤养分循环和植物生长。土壤盐渍化扰乱了土壤生态环境（张等人，2023），并对土壤微生物群落产生负面影响，而土壤微生物群落是土壤地球化学循环不可或缺的一部分（贾等人，2023）。先前的研究证明，土壤中的氢气也参与了微生物活动和植物生长（戈尔丁和董，2010）。几十年来，豆科植物一直被用于轮作，通过在土壤中留下残留氮来提高后续作物的产量。然而，轮作效益中只有25%归因于残留氮（菲森和奥克斯，1990；布洛克，1992）。氢气是固氮酶的一种必然副产物，固氮酶是豆科植物根瘤中的一种固氮酶（舒伯特和埃文斯，1976）。在固氮豆科作物固氮过程中，氢气产量每公顷每天可达5000升（亨特和莱泽尔，1993；董和莱泽尔，2001）。研究发现，以H₂ 为能源通过氧化H₂ 的土壤微生物在根瘤周围迅速繁殖（斯坦等人，2005）。其中一些氢氧化细菌菌株已在实验室中成功分离，并显示出促进植物生长的特性（张，2006）。董等人（2003）进一步发现，在氢气处理过的土壤中，非结瘤大豆植株、小麦、大麦和油菜的生物量可提高15 - 30%。氢气产生可能是轮作效益中其余75%的原因（戈尔丁和董，2010）。目前尚不清楚氢气如何通过调节微生物群落来促进植物生长。但有证据表明，盐诱导的细菌群落可以缓解植物的盐胁迫，而且这种物种特异性效应主要发生在根际而非内生细菌中。最近的研究对能够增强植物耐盐性的植物根际促生菌（PGPR）表现出浓厚兴趣。PGPR特定菌株的有益作用归因于维持离子和渗透平衡、减轻氧化应激、增强水分和养分吸收以及提高光合效率（穆拉利等人，2021）。因此，研究SDH如何影响土壤根际微生物群落，特别是其与植物生长和耐盐性的关系及机制是很有价值的。
植物激素（植物荷尔蒙）在植物发育和生长中起着至关重要的作用。这些小分子化学物质对于植物的非生物胁迫耐受机制也至关重要（瓦阿德等人，2022）。如众多研究所报道，植物激素的浓度和活性取决于不同的植物和胁迫条件（科查曼，2023）。水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和乙烯被视为应激反应激素。曾等人（2013）首次报道，H₂ 可能作为一种气态植物激素，如乙烯或一氧化氮（NO），参与高等植物的应激反应。用HRW预处理的水稻幼苗中，多种植物激素受体基因的转录增加。外源施加ABA和JA导致内源性H₂ 的产生，这表明H₂ 可能通过参与植物激素网络中的信号通路来提高水稻对盐胁迫的耐受性。刘等人（2016）发现HRW上调了野生稻幼苗中两个氢化酶基因、SA、JA和乙烯的合成及受体基因的表达，表明H₂ 的产生可以迅速激活植物激素信号通路以响应非生物胁迫。氢气对植物激素的作用可能不同于其对羟基自由基和ROS的选择性清除作用，这表明氢气在植物中发挥作用的分子机制具有复杂性。现有研究主要集中在氢气在激素依赖途径中介导的信号级联反应（曾等人，2013；刘等人，2016；苏等人，2020），而关于在整个生长周期稳定施加氢气的条件下，植物生理过程、表型参数和生物量积累对激素含量的响应报道较少。
生菜作为消费最多的叶菜类蔬菜之一，对渗透胁迫敏感。低水平的盐度会因叶片边缘出现坏死病斑，严重影响其商品生物量和品质（卡里略等人，2019）。基于上述考虑，我们提出假设：SDH可能通过增强抗氧化系统、调节植物激素水平和富集氢氧化细菌菌株来提高生菜的耐盐性。为了验证这些假设，我们进行了一个包含四种处理的盆栽实验和16S rRNA测序，以检测生菜在以下方面生理和生化反应的变化：（1）光合作用、渗透调节和离子调节；（2）抗氧化能力和膜系统稳定性；（3）植物激素水平；（4）土壤微生物群落结构。最后，阐明了地上部 - 根系形态改善和耐盐性能提高的潜在原因。
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