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在生物学研究中，通过细胞表达的RNA转录本定义细胞“类型”颇为流行，但来自斑马鱼神经元的证据表明，转录层面相似的细胞在功能上可能多种多样。
近200年前，细胞被认定为生命的基本单位，自那时起，生物学家就一直致力于描绘并分类构成每个器官和生物体的无数不同细胞类型。自19世纪神经科学家圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔绘制神经元图以来，大脑就被视为最为复杂的器官，尽管当时形态（形状）是区分神经元的唯一可用标准。在过去十年里，用于对神经元进行分类的技术取得了飞速发展，既可以通过记录神经元的活动模式从功能上进行分类，也能依据其表达的基因从分子层面进行分类。然而，在大多数神经系统中，目前对细胞的分子、形态和功能描述之间存在脱节。沙伊纳等人在《自然》杂志发表文章，讲述了他们为弥合斑马鱼（Danio rerio）大脑视觉处理区域的这种差距所做的大胆尝试。
对于如何最好地定义细胞类型，学界尚无共识 ，而且这种分歧并不局限于神经元。身体中的每个细胞都有特定的作用，因此，任何不把功能作为标准的定义都过于简化。但全面测试每个细胞的确切功能并不现实，而且功能会发生变化和适应——神经元尤其如此。在过去十年中，单细胞RNA测序（scRNA - seq）技术兴起，使得识别和量化大量单个细胞中存在的RNA转录本成为可能，为细胞的基因表达（也称为转录组）提供了无偏差的快照。最新的scRNA - seq研究 表明，哺乳动物大脑中包含数千种甚至上万种分子层面上截然不同的神经元类型，这种多样性远远超出以往任何分类尝试的预测。
为了建立分子层面与功能层面细胞类型之间的关联，沙伊纳等人对来自视顶盖的约4万个神经元进行了scRNA - seq分析。视顶盖是大脑的一个区域，直接接收来自视网膜神经元的输入，并且在脊椎动物物种中具有进化保守性。这使他们能够将转录组分类为66种“转录组类型”（t型），这些类型应涵盖了视顶盖神经元的大部分分子多样性。尽管scRNA - seq能够对全基因组的信使RNA进行采样，但它需要将细胞从组织中分离出来，这意味着空间信息会丢失。
因此，作者们还使用了一种称为杂交链式反应的技术，来检测完整组织中数量有限的mRNA。这两种方法结合起来十分强大：通过关注从scRNA - seq中识别出的差异表达标记基因，作者们能够确定大多数t型在视顶盖中的空间分布（图1）。随后，他们记录了视顶盖神经元对行为相关刺激的功能反应。由于斑马鱼幼体是透明的，这可以通过光学方式实现，即使用荧光传感器报告细胞内钙离子水平，该水平会随着神经元活动而升高。
图1 斑马鱼（Danio rerio）大脑中的神经元。
沙伊纳等人 根据神经元表达的RNA转录本，将视觉处理中心视顶盖的神经元分类为“转录组类型”（t型）。作者表明，t型并不总能反映基于神经元功能或形态（形状）的分类，但与神经元在视顶盖中的位置有关。荧光标记显示了两种不同的t型。（改编自参考文献1的图6） 图片来源：I. 沙伊纳等人/《自然》
在杂交链式反应的帮助下，沙伊纳等人将记录的“功能类型”（f型）与t型进行了匹配。正如预期的那样，同一t型中的细胞在功能上往往比其他细胞彼此更为相似。然而，令人惊讶的是，研究人员也观察到分子层面相似的神经元存在功能多样性。尽管将f型分配给t型有时并不明确，但在一些情况下，单一t型中显然包含功能反应和形态都不同的神经元。有趣的是，作者报告称，t型内的这些变化与这些神经元在视顶盖中的位置密切相关。
作者得出结论，在视顶盖分子层面无法区分的细胞类型中，可观察到的特征或表型存在可测量的多样性。他们认为，基因相同的神经元在分化过程中，可能会由于局部环境的限制，比如附近可供形成连接（突触）的神经元的可用性，以及引导神经元突起（轴突）生长的分子的可用性，在功能和形态上变得不同。这些局部限制可能对基因表达影响不大。
但在观察到的t型中的一些功能多样性，可能仍然代表基因指定的类型或亚型。首先，由于scRNA - seq数据本身就很稀疏，t型的分辨率在很大程度上取决于采样细胞的数量，以及对每个细胞转录组测序的详尽程度，在像大脑这样的多样组织中尤其如此。如果没有关于目标组织或细胞的预先信息，转录组分组（或聚类）中的细微差异很容易被忽略，特别是对于稀有细胞类型。
其次，仅根据成熟神经元中的基因表达来定义t型存在问题。例如，在果蝇（Drosophila melanogaster）大脑的视觉系统 和嗅觉系统 中，神经元类型之间的转录组多样性在神经元回路形成期间最高。果蝇视觉系统中T4和T5神经元的八个亚型就说明了这两个潜在问题。这些亚型在发育早期就由基因决定 ，并在成年果蝇中对不同方向的运动做出选择性反应。在发育过程中，这八个亚型都可以通过scRNA - seq可靠地分辨出来 ，但在成年果蝇中却无法分辨，因为介导它们不同连接性、导致其形态和功能不同的基因在发育过程中短暂表达。然而，具有不同连接性的成年神经元在运动检测中执行相同的计算，它们的转录组也变得难以区分。
最后，视顶盖被组织成一个“视网膜拓扑图”，反映视网膜接收视觉信息的方式，每个神经元代表视野的特定区域 。跨越这个图谱的分子差异可能呈现为连续体，类似于参与引导视网膜轴突的埃phrin蛋白的表达梯度 。在通过聚类方法进行的scRNA - seq分析中，这种变化也很难检测到，这或许可以解释部分功能多样性。
那么，细胞“类型”最终应该如何定义呢？要记住，分类法（无论是针对细胞类型还是物种）的目的，不是解释所有可观察到的表型多样性，而是提供一个实用且逻辑一致的参考框架。生物学中的一个重要讨论是如何区分细胞类型与更短暂的细胞状态，因为两者都可以通过基因表达差异体现出来。
在不同物种中，越来越多的证据表明，一个由称为终末选择子的转录因子组成的网络 ，在每个神经元的各种状态和发育阶段维持其类型特异性身份。因此，沙伊纳等人认为细胞“类型”界定了神经元的表型潜力，而不是完全决定它，这一观点是正确的。终末选择子的组合，也可能是为进化分析定义神经元类型最实用的方法 。调控基因表达的DNA区域的快速进化，能够使同一细胞类型在不同物种间具有表型灵活性。这种情况可以在无需修改终末选择子组合或指定它们的上游发育机制的情况下发生。
单细胞转录组学彻底改变了科学家理解和分类细胞的方式，尤其是在能够对发育过程中的大量神经元进行评估时。然而，目前对人类大脑中细胞类型数量的估计相差几个数量级。这可能是因为单细胞转录组学只涉及基因调控的一个方面，而转录后机制也起着重要作用。或许需要单细胞蛋白质组学，即对细胞正在表达的所有蛋白质进行快照，才能全面理解细胞的分子多样性。
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