图1. 本研究的图形摘要。(i) 多组学分析可以探索分子氢相关的分子生物学机制和潜在的天然药物与氢气的协同作用。(ii) 疏水自组装方法首次构建了携带氨硼烷和二氢槲皮素的自组装DQB纳米颗粒。利用藻类对多酚的吸附特性，普通小球藻能够建立一个自组装纳米系统DQB@C，以提高纳米颗粒的自组装能力。(iii) 纳米小球藻系统具有更好的感染响应性氢气和药物释放能力。体内和体外实验证明了DQB@C的抗炎和器官保护能力。
背景
氢气和小球藻都存在于自然环境中。我们的目标是将氢气和生物纳米小球藻结合起来，以扩大败血症的治疗选择。
方法
从接受盲肠结扎和穿刺（CLP）及吸入氢气的小鼠中获得磷酸化蛋白质组学、代谢组学和蛋白质组学数据。所有组学分析程序均符合标准。在单细胞和空间转录组学分析中使用多个R包来识别表达目标基因的主要细胞，以及在败血症相关肺景观中的基因共表达关系。然后，使用网络药理学方法识别候选药物。我们使用疏水力驱动的自组装方法构建二氢槲皮素（DQ）纳米颗粒。为了与分子氢合作，将氨硼烷（B）添加到DQ表面。然后，使用普通小球藻（C）作为生物载体来改善自组装纳米颗粒。进行体内和体外实验以评估抗炎、抗铁死亡、抗感染和器官保护能力。
结果
结果表明，我们确定了Esam和Zo-1是肺部分子氢治疗的目标磷酸化蛋白。铁死亡和谷胱甘肽代谢是两个目标途径。普通小球藻改善了DQB的分散性并重构了DQB的形态特征，形成了DQB@C纳米系统（大小=307.3 nm，Zeta电位=-22mv），具有良好的感染响应性氢气释放能力和生物安全性。此外，DQB@C能够减少肺部细胞中的氧化应激和炎症因子积累。通过增加Slc7a11/xCT的表达水平并降低Cox2水平参与铁死亡的调节。同样，DQB@C在CLP小鼠上发挥了肺部和多器官保护以及抗炎作用。
结论
我们的研究提出了DQB@C作为一种具有巨大潜力的新型生物纳米系统，用于治疗败血症相关的急性肺损伤，以解决氢气在临床应用中的局限性。
1. 引言
败血症是由宿主对感染反应失衡引起的生命威胁性器官功能障碍。根据《柳叶刀》最新的全球疾病负担数据，每年全世界的败血症病例已超过4800万，其中约1100万患者死亡，死亡率超过20%。美国重症医学会（SCCM）和欧洲重症医学会（ESICM）联合发布了败血症3.0的最新定义和诊断标准，强调重视器官衰竭的研究意义。欧洲重症医学会发布的最新败血症管理指南也明确指出，败血症患者的治疗重点仍然是预防和治疗多器官功能障碍。败血症最易受攻击的器官是肺部，严重情况下可发生急性呼吸窘迫综合征。然而，败血症诱导的肺损伤的发病机制尚未准确阐明，且缺乏有效的治疗方法。
磷酸化是蛋白质翻译后修饰的最重要形式，涉及几乎所有生物学过程。磷酸化蛋白质在败血症相关途径中参与并发挥重要作用。单细胞测序和空间转录组的结合可以帮助我们更全面地了解基因表达调控。Janosevic等人使用空间转录组学结合单细胞转录组学建立了小鼠败血症进展的单细胞分辨率基因表达谱。时空分析识别了生物标志物和靶点，这有助于人类败血症的分期和治疗。
目前，对败血症诱导的肺损伤机制的理解主要基于炎症和氧化应激。然而，针对这两种机制的当前治疗方法效果有限。天然产物的纳米材料在抵抗细菌感染和治疗炎症性疾病方面显示出巨大潜力。其中，基于天然产物的自组装纳米系统因其出色的抗氧化性能而受到更多关注。二氢槲皮素是一种优秀的天然抗氧化剂。Gui等人合成的超小型铁槲皮素纳米酶解决了溶解性差和生物利用度低的问题，在炎症和氧化应激损伤中发挥了保护作用。对于二氢槲皮素来说，自组装方法也有潜力提高其对感染和炎症治疗的效果。
我们之前的研究表明，H2治疗显著减轻了败血症小鼠的肺组织病理评分和氧合指数，并通过过度激活Nrf2/HO-1信号通路改善了败血症小鼠的肺损伤。但是长期吸入氢气会对呼吸道黏膜和胃肠道造成刺激，这一直是我们关注的问题。Chlorella pyrenoidosa是一种属于绿藻门小球藻属的单细胞绿藻。之前的研究显示，它可以在黑暗中产生氢气，并且其细胞壁具有携带多酚类药物的功能。在一些研究中，小球藻被用作载体以实现外源蛋白的高效表达。更重要的是，许多研究已经证实了小球藻的体内生物安全性。这使得它适合与氢气协同使用。氨硼烷（H3N–BH3，AB）是一种优秀的储氢化合物。一些研究利用其在酸性环境中释放氢气的能力，在肿瘤和胃中实现了氢气释放。败血症中的感染微环境也是酸性的，AB在这种条件下可以释放氢气。
本研究通过结合磷酸蛋白质组学、单细胞和空间转录组学、代谢组学揭示了败血症诱导的肺损伤的新发病机制，并为败血症诱导的肺损伤中的纳米纤维素负载药物提供了治疗方法和基础。
（无论如何，采用这种复杂的给氢气路线，都不是解决脓毒症的理想方法。本研究采用复杂的技术，回答已经回答的问题，不应鼓励提倡。对肺部损伤来说，吸入显然是最可行的路线。使用材料学方法，如果不是解决剂量不足问题，都不是合理的选择。任何材料的应用，都距离实现目标更遥远。我们不要忘记氢气医学初心：安全性高是氢气可用适用的基础和前提。）
2. 材料和方法
2.1. 样本获取和磷酸蛋白质组学测定
使用盲肠结扎穿孔（CLP）方法成功构建了严重败血症小鼠模型。从军事医学科学院卫生与环境医学研究所实验动物中心购买了体重为20–25克的成年雄性C57BL/6J小鼠用于建模。进行操作时，用七氟醚麻醉雄性C57BL/6J小鼠，并在无菌条件下切开腹腔。在无菌条件下使用七氟醚麻醉切开腹腔，轻轻拉出盲肠并在远端2/3处结扎盲肠。为了促进炎症的发展，特意挤出少量粪便，然后将盲肠重新放回腹腔并缝合腹壁。为了进行复苏，向小鼠颈部皮下注射37°C生理盐水（5 ml/100g）。具体程序参考了我们小组发表的文章[28]。
接受分子氢治疗的小鼠被放置在一个密封的Plexiglas盒子中，通过气体表将氢气和自然空气混合。混合后，通过入口端口将气体送入盒子。使用H2Scan（Valencia，CA，USA）测量氢气浓度（保持在2%）以及室内的氧气和二氧化碳水平。未接受氢气治疗的对照组仅被放置在没有氢气治疗的相同环境中。未接受分子氢治疗的对照组仅被放置在没有氢气治疗的相同环境中。
对于磷酸蛋白质组学测定，简要工作流程如下：1. 样品全蛋白提取；2. 蛋白酶解成肽段；3. 肽段脱盐；4. 酸化肽段富集；5. Q-exactive分析；6. 定性和定量蛋白质组学结果；7. 获得不同样品中蛋白质相对于其量化的相对定量比值。
2.2. 代谢组学检测
在4°C下缓慢解冻肺样本后，加入适量的预冷甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1, v/v），涡旋混合，然后在低温下超声30分钟。接着在-20°C下静置10分钟，以14,000 g离心20分钟。为了进行质谱分析，加入100 μL乙腈水溶液（乙腈:水 = 1:1, v/v），涡旋，然后在4°C下以14,000 g离心15分钟，取上清液进行分析。
样品在Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱（UHPLC）柱上分离。使用AB Triple TOF 6600质谱仪获取样品的一次和二次光谱。
原始数据通过ProteoWizard转换为mzXML格式，然后使用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和峰面积提取。XCMS提取的数据首先进行代谢物结构鉴定和数据预处理，然后进行实验数据质量评估，最后进行数据分析。
2.3. 磷酸蛋白质组学检测的生物信息学分析
2.3.1. 聚类分析
为了评估磷酸蛋白质组学数据的质量和分布，我们基于R语言通过R studio软件进行了聚类分析。
2.3.2. 差异磷酸化蛋白的定量分析
通过Skyline定量分析PRM（平行反应监测）质谱结果，并在内标肽的信号校正后获得每个样品中目标肽段的表达信息。然后，经过信号校正，得到每个样品中目标肽的表达量。进一步进行统计分析，以识别不同样品组中目标蛋白的差异表达。
此外，由于存在多个磷酸化位点的修饰蛋白以及在不同磷酸化位点的不同下调趋势，不可能在修饰蛋白的水平上进行定量分析，因此针对磷酸化肽段进行差异表达分析。筛选出折叠变化大于2倍（上调超过2倍或下调少于0.5倍）且p值小于0.05的磷酸化肽段。根据分子氢可以逆转败血症诱导的表达变化的准则，筛选候选肽段和蛋白。使用维恩图方法筛选共同磷酸化位点和蛋白。
2.3.3. GO和通路分析
使用Blast2Go软件注释所有鉴定为差异表达蛋白的基因本体（GO）功能。然后对与差异表达磷酸化肽对应的蛋白进行GO功能富集分析。包括三种功能：细胞成分（CC）、生物过程（BP）、分子功能（MF），以揭示不同组之间的生物学功能变化。
对于通路分析，使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库评估上述候选蛋白的富集通路。R包ggplott2用于展示结果。特别关注不同组之间通路的差异富集。
2.3.4. 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
使用String数据库构建候选蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。Cytoscape软件帮助可视化网络。根据度这一指标对蛋白质的重要性状态进行排序，该指标表示与特定蛋白质相互作用的蛋白质数量。
2.4. 代谢组学的生物信息学分析
2.4.1. 主成分分析
主成分分析（PCA）是一种无监督数据分析方法，将所有最初识别的代谢物重新组织成一组新的复合变量。从而实现了降维的目的。同时，代谢物的主成分分析还可以反映样本组间和样本内的变异性。因此在数据分析中，通常首先使用PCA方法观察样本组间的整体分布趋势和样本组内的变异程度。
2.4.2. 单变量统计分析
单变量统计分析方法是最常使用的统计分析方法之一。基于方差分析，对所有在正负离子模式下检测到的代谢物（包括未鉴定的代谢物）进行分析差异。FC > 1.5或FC < 0.67，p值 < 0.05为差异代谢物。然后使用火山图展示正离子模式和负离子模式下的差异代谢物。基于代谢物的种类，热图也帮助展示这些差异代谢物。
2.4.3. KEGG通路分析和差异代谢物
使用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)数据库识别与代谢物相关的代谢通路。重要通路的标准是：p值 < 0.05。Rstudio软件用于绘制这些通路的点图。
2.5. 单细胞、mRNA转录组和空间转录组的数据获取
我们从GEO数据库下载了单细胞数据集矩阵，GSE207651，以分析CLP手术后肺部基因表达的变化。对于空间转录组，从数据库获取了GSE202322数据集。该数据集包括感染甲型流感病毒的小鼠样本。我们使用这两种类型的小鼠模型进一步评估磷酸化基因的变化。
2.6. 单细胞预处理和质量控制
使用R包Seurat进行预处理程序。只有符合以下标准的细胞和基因才会被保留用于后续分析：至少在三个细胞中表达的基因，能够检测到两百个基因的细胞。不符合条件的将被舍弃。数据质量控制基于线粒体比例，含有从200到2500个基因并且线粒体基因不超过5%的细胞被保留用于后续分析。此外，为了降低由于大量低质量细胞引起的潜在错误率，进行了数据标准化和突变基因筛选。然后，为了区分不同集群的细胞，根据基因表达执行了主成分分析（PCA）算法。最后，通过tSNE算法实现了可视化，展示了细胞在二维水平上的分布情况。
2.7. 细胞类型鉴定和基因分布检测
用于识别混合在单细胞矩阵中的细胞类型的细胞标记物源自Cell Marker2.0数据库以及之前的文献或研究。首先，在单细胞景观中标记磷酸化基因的分布，以找到与这些基因关系最密切的重要细胞类型。然后，提取与磷酸化相关的细胞，观察三种炎症基因（Tnf, Il1和Il6）与磷酸化基因之间的表达关系。在与磷酸化相关的细胞群中，我们根据Tjp1基因的表达水平分离细胞。较高表达的细胞被称为高表达组，其余的为中等表达组或低表达组。
2.8. 空间转录组学分析
使用R包Seruat、hdf5r和patchwork处理空间转录组学数据。还实现了基因和细胞类型的空间分布。旨在探索对照组和肺炎组中基因表达变化和共定位关系。
2.9. 候选药物筛选
我们使用了药物数据库HERB，这是一个基于高通量实验和参考文献的传统中医药数据库。通过将编码蛋白的基因列表导入数据库，搜索针对这些蛋白的潜在中药草药。然后在这些候选药物中识别常见的草药。
2.10. 构建携带自组装纳米颗粒的小球藻
我们从中国科学院获得了小球藻，二氢槲皮素从shycbio公司获得。为了提高DQ的溶解性，我们将温度提高到70摄氏度，DQ在水中的浓度为5毫克/毫升。然后加入质量比为1:1的酪蛋白酸钠作为乳化剂和稳定剂。使用能产生超声波的细胞破碎仪，功率为70瓦，时间为7分钟。同时，将温度降至0摄氏度。创建了自组装DQ纳米颗粒。然后，根据质量比5:1（二氢槲皮素和氨硼烷），向DQ自组装系统中添加氨硼烷。最终DQ的浓度为11毫克/毫升。使用低温超速离心机从小球藻培养液环境中提取小球藻。计数1×10^7对数生长期小球藻加入到1毫升DQB纳米颗粒系统中。放置在磁力搅拌器上后，将温度保持在30摄氏度，搅拌速度为400转/分钟。过夜后，获得了纳米微藻系统DQB@C。
2.11. DQB@C的物理和特性检测
使用动态光散射技术检测DQ、DQB和DQB@C纳米颗粒的zeta电位和粒径。然后，使用电子显微镜观察DQB@C和DQB的形态。通过用碘化丙啶（PI）标记DQB，并在微藻内共定位，使用荧光显微镜和流式细胞分析仪检测微藻对DQB的吸附[31, 32]。然后，进行溶血实验以评估体内生物稳定性。通过细胞计数试剂盒-8（CCK8）检测两种细胞类型（人脐静脉内皮细胞HUVECs和人肺（支气管）上皮细胞BEAS-2B）的细胞毒性。设置的治疗浓度参考二氢槲皮素（从0微克/毫升到100微克/毫升）。使用微电极（Unisense公司）检测CLP小鼠体内的氢气释放速度和活体内炎症器官的氢气浓度[25, 33]。为了检测模拟感染环境中纳米系统的产氢和释放能力，将pH调节至6.5。在体内，对CLP小鼠进行腹腔注射200微升DQB@C，并跟踪感染器官中氢气浓度的变化。由于肺部无法在活体状态下固定，因此检测肝脏。
2.12. 细胞摄取测定和吞噬小球藻观察
在细胞水平上使用了肺部的两种细胞类型BEAS-2B和HUVECs。将DQB@C与细胞共培养（20微克/毫升，参考二氢槲皮素的浓度）。然后，通过免疫荧光显微镜在不同时间点观察荧光密度变化。使用Dil膜染料标记细胞膜。在免疫荧光显微镜下追踪细胞的动态吞噬过程。
2.13. 氧化应激检测及ELISA、铁死亡评估
体外实验包括五组：正常组、脂多糖（LPS）刺激组、LPS+富氢水组、LPS+DQB组、LPS+DQB@C组。当细胞生长至50%密度时，分别用100微克/毫升LPS和10微克/毫升LPS开始刺激HUVECs和BEAS-2B，持续24小时。创建富氢水介质（HW）的方法参照我们之前的研究[34]。所有体外处理均与LPS刺激同时开始。对于DQB和DQB@C的处理剂量，两者均为20微克/毫升（参考二氢槲皮素的浓度）。二氢乙定（DHE）可以检测细胞内超氧阴离子水平。我们从Aladdin公司获得了DHE染料。将50微摩尔DHE与细胞孵育并固定。此外，通过DCFH-DA探针（Solarbio公司）检测活性氧物种（ROS），间接揭示谷胱甘肽代谢的变化。通过Ferroorange探针（Servicebio公司）动态检测细胞内Fe2+浓度变化。线粒体状态变化对铁死亡也至关重要，通过JC1探针（Solarbio公司）追踪这一变化有助于评估DQB@C的效果。我们还量化了五种组中两种细胞分泌的炎症因子水平。对于HUVECs和BEAS-2B，IL-6是主要分泌因子。同时，我们检测了Tnf-α和Il-1β的水平，以验证它们与Zo-1和Esam的关系。然后，使用两种主要的铁死亡标记物，抗Cox2抗体（ab179800）和抗Slc7a11/xCT抗体（ab307601），与蛋白质结合。我们使用荧光检测来观察细胞内蛋白质表达水平的变化。
2.14. Western blot
为了快速裂解细胞，我们在HUVECs和BEAS-2B中使用RIPA缓冲液（Sigma R0278）提取五组蛋白。同时添加苯甲基磺酰氟以抑制蛋白降解。接下来的二辛可宁酸法和电泳、膜转移、蛋白封闭程序均按照标准进行。在一抗孵育（抗Zo-1抗体（bs-34023R）、抗Esam抗体（bs-5838R）和抗β-actin抗体（ab8226））后，使用Abcam公司的二抗与一抗结合。
2.15. 体内抗炎和器官保护效果评估
如2.1所述构建CLP小鼠模型。术后1小时和6小时时间点，向腹腔注射100微升DQB@C或DQB。对于CLP+美罗培南组，将美罗培南（4毫克/千克）溶解于生理盐水中并在CLP手术后注射。在体内实验中采用五组：Sham, CLP, CLP+DQB, CLP+DQB@C, CLP+美罗培南。记录24小时生存率。通过ELISA试剂盒使用血清检测转氨酶（ALT）、肌酐、C反应蛋白（CRP）、表面活性相关蛋白D（SP-D）和可溶性晚期糖化终末产物受体（sRAGE），以评估系统性炎症和多器官功能。此外，分别从四组（sham, CLP, CLP+DQB@C, CLP+美罗培南）提取50微升血液用于平板细菌培养，以评估抗感染效果。然后，提取重要器官，包括心脏、肝脏、肺、肾和脾脏进行H&E染色。急性肺损伤是我们关注的焦点，因此通过免疫荧光观察肺组织切片中的两个目标蛋白Zo-1和Esam的蛋白表达变化。我们还使用组织Fe2+含量检测试剂盒（AKIC001M）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（KGA7305-100）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（S0131S）来检测肺组织中的铁和抗氧化剂水平。
2.16. 统计分析
使用ImagJ软件定量测量荧光强度。使用Origin软件和GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计分析。我们使用单因素方差分析（one-way ANOVA test）来分析组数据。统计显著性被确定为：p值<0.05。
3. 结果
3.1. 差异磷酸化蛋白质和通路分析
在图2A中，我们鉴定了败血症与正常、败血症与吸入氢气后的败血症之间的差异表达磷酸化蛋白质和位点。然后，为了精确定位磷酸化位点，我们使用了上述相同的维恩图方法进行筛选（图2B）。并将分子氢靶向的磷酸化位点对应的蛋白质与上述蛋白质进行比较，找出关键蛋白质。总共筛选出二十个磷酸化位点和十七个磷酸化蛋白质。分别对于两个差异表达的蛋白质群，即败血症-分子氢和败血症，假手术和败血症，展示了富集通路（图2C）。然后，我们确定了两个群中的十六个共有蛋白质（补充材料图1S）。其中，我们鉴定了Zo-1中的S(1)VAS(1)S(1)QPAKPTK和Esam中的MGAVPMVPAQS(1)QAGS(1)LV作为候选磷酸化位点。三个通路，维生素消化和吸收、多种物种的凋亡以及ABC转运体被认为是在败血症与吸入氢气的败血症组之间具有显著意义的通路。其中，ABC转运体是一种代谢途径。它也与我们关注的铁死亡有关[36]。
图2. 磷酸化蛋白质组学和蛋白质组学综合分析的结果。（A）败血症、对照组和氢气组之间差异表达的磷酸化蛋白质的热图分布；红色表示高表达，蓝色表示低表达。（B）与分子氢相关的磷酸化位点和蛋白质的维恩图。标准是：分子氢能够逆转由败血症引起的表达变化。（C）与氢相关的磷酸化蛋白质的KEGG和GO通路。（D）与分子氢相关的磷酸化蛋白质的PPI网络。点代表蛋白质，线表示蛋白质之间的关系。（E）与氢相关的磷酸化蛋白质的激酶-底物网络。发射箭头的蛋白质是激酶，指向的蛋白质是底物。（F）蛋白质组学和磷酸化组学之间的共同蛋白质。绿松石色代表在蛋白质组学中筛选出的蛋白质，黄色代表在磷酸化组学中筛选出的蛋白质。（对于解释此图例中的颜色参考，读者请参阅本文的网页版。）
在PPI网络中，图2D，我们发现Tjp1-Tjp2-Esam网络位于中心，与其他蛋白质相连，表明其在参与分子氢的磷酸化过程中起主要作用。
此外，通过将这些蛋白质导入iGPS，我们获得了差异表达磷酸化蛋白质的激酶-底物网络，图2E。网络中识别出三种相互作用，smMLCK- Casp7, Apc- Casp7, Esam-Tjp1。这三对是激酶-底物对。一致地，也识别出了Tjp1-Esam对。我们还使用之前的肺部蛋白质组学数据来识别共同蛋白质，图2F，筛选出了Zo-1。总的来说，在差异表达分析中，Tjp1的磷酸化位点在分子氢治疗后被下调，表明底物的恢复。相反，Esam的磷酸化位点表达水平上调，表明激酶的激活。
3.2. 代谢组学结果
在图3A中，两组能够独立分离，表明CLP和CLP后的分子氢处理之间的差异显著。然后，我们分别展示了POS和NEG模式下的差异代谢物（图3B）。在NEG和POS模式下分别鉴定出1045种和636种代谢物。根据主要类别的代谢物，脂质和类脂分子；生物碱及其衍生物；苯并恶嗪；核苷、核苷酸及类似物；有机酸及其衍生物；有机氮化合物；杂环化合物；苯丙素和聚酮类以及未定义，展示了样本中差异最大的代谢物的分布（图3C）。通路分析后，图3D，表明铁死亡和谷胱甘肽代谢通路被富集并且具有差异丰度。因此，进一步实验也将关注这些方面。
图3. 代谢组学结果的生物信息学分析。（A）样本的空间主成分分析分布；不同颜色代表不同组；（B）两种模式下的差异代谢物；蓝色=下调，灰色=无显著差异，红色=上调；（C）不同组中的差异代谢物；（D）KEGG通路和差异丰度的点图。点的颜色代表p值和丰度得分。点的大小代表代谢物的数量。（对于解释此图例中的颜色参考，读者请参阅本文的网页版。）
3.3. Tjp1和Esam在单细胞分析中的基因定位
我们在图4A和C中鉴定了肺部九种细胞类型的分布，包括自然杀伤细胞、中性粒细胞、mki67+增殖细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、经典单核细胞和间质成纤维细胞、纤毛细胞。评估了CLP和假手术小鼠肺中两个基因的共定位。我们可以观察到，Tjp1和Esam mRNA在血管内皮细胞中最丰富（图4B和D）。因此，提取血管内皮细胞进行进一步分析。在图4E和F中，分别在CLP和正常肺的血管内皮细胞簇中识别出两个簇。有趣的是，Esam和Tjp1的表达变化一致，同时在一个细胞簇中高表达，在另一个细胞簇中低表达。我们还观察到Tjp1和Esam的下调表达伴随着炎症基因Tnf、Il-1b和Il-6的高表达。这表明炎症内皮细胞表达较少的Tjp1和Esam mRNA。
图4. 空间和单细胞整合转录组学分析。（A, B）正常肺的细胞景观和两个基因共定位景观。红色虚线标记的区域是两个基因高表达细胞簇。（C, D）CLP肺的细胞景观和两个基因共定位景观。红色虚线标记的区域是两个基因高表达细胞簇。（E）正常血管内皮细胞簇中两个基因表达的细胞景观。分别是散点图和tSNE景观。（F）CLP血管内皮细胞簇中两个基因表达的细胞景观。分别是散点图和tSNE景观。（G, H）正常肺和肺炎肺组织中两个基因的空间共定位。从红色到蓝色代表Tjp1和Esam两个基因在空间点中的基因表达状态。（对于解释此图例中的颜色参考，读者请参阅本文的网页版。）
3.4. 两个基因在空间转录组学中的共定位
在图4G和H中，我们比较了病毒感染肺部与正常肺部之间两个基因的空间共定位。我们可以观察到，病毒感染前后肺部存在大量的共高表达空间定位。病毒感染九天后，Tjp1和Esam的表达水平都下调。此外，炎症基因高表达区域中Tjp1和Esam的表达水平较低。这表明两个基因的共表达明显，感染可以在肺的空间维度下调它们的表达水平。
3.5. Esam和Tjp1的目标植物药成分
筛选出三种成分，3,4-苯并芘、美登素和槲皮素，用于Esam。筛选出十六种成分用于Tjp1。共同的成分是槲皮素（补充材料表1s）。因此，作为槲皮素的结构类似物，具有更多酚羟基的二氢槲皮素被用于后续的纳米治疗。
3.6. 构建小球藻纳米粒子
首先，我们构建了携带硼烷和二氢槲皮素的小球藻纳米粒子。通过自组装，DQ纳米粒子的直径约为113.0 nm（图5A）。硼烷与DQ的结合依赖于大分子之间的极性相互作用。结合后的尺寸能够达到168 nm。然而，DQB的完全自组装不足且缺乏良好的分散性。小球藻的细胞壁由多糖结构组成，能够吸收像二氢槲皮素这样的多酚类物质。由于微藻对DQB的吸收，DQB的自组装系统得到了改善。并且我们可以观察到由于DQB的吸附，小球藻的表面ζ电位发生了变化（图5A）。最终纳米系统的尺寸接近300 nm。在图5B中，TEM检测显示，单纯的DQB系统容易聚集，稳定性较差。而DQB@C纳米系统则具有更好的分散性。DQB@C纳米粒子被吸收到小球藻的表面或周围。这有助于在炎症微环境发生时快速释放纳米粒子。我们还检测了小球藻的自体荧光以评估其存活情况。在FITC的激活阈值下，观察到绿色荧光，表明结构的完整性（补充材料图2S）。PI无法进入活细胞，但在PI激活光阈值下，红色标记PI与微藻的重叠表明DQB纳米粒子的结合。此外，流式细胞术帮助量化了小球藻对DQB的携带能力。在图5C中，我们主要关注两种DQB@C纳米系统，小于1000 nm和大于1000 nm。根据我们的结果，包裹DQB后PI吸收率显著增加。对于较小的DQB@C，吸收率范围从1.07%到94.05%。事实上，这部分代表了DQB。这表明DQB能够与PI结合。在较大的DQB@C系统中，吸收率从18.85%增加到86.13%。这种增加是由于DQB在小球藻上的附着所致。这些结果表明我们成功构建了DQB@C，微藻平台改善了DQB自组装纳米粒子的稳定性和分散性。
图5. DQB@C纳米系统的构建及细胞内摄取检测。（A）颗粒大小和ζ电位分布图；不同颜色代表ζ电位条形图中的不同纳米粒子。（B）DQB、小球藻和DQB@C的TEM图像；红色箭头指向DQB，粉色箭头指向小球藻。（C）通过PI染色的DQB@C流式细胞术分布图。>1 μm：表示粒径大于>1 μm的颗粒；<1 μm：表示粒径小于>1 μm的颗粒。红框内的颗粒为PI阳性。（D）体外纳米系统溶血率统计图。（E）HUVECs和BEAS-2B在不同DQB@C浓度下的细胞活力图；（F）模拟感染微环境下DQB@C和DQB 24小时氢气释放速度曲线（200μL DQB和200μL DQB@C）。（G）注射DQB@C后24小时体内氢气浓度曲线（200μL DQB和200μL DQB@C）。（H）DQB@C细胞内吸收的荧光图像。从0小时到12小时，24小时。绿色代表被细胞吸收的纳米粒子。红色代表细胞膜。蓝色代表细胞核。标尺，40μm。所有条形图均以平均值±标准差表示，n=5。（关于此图例中颜色的解读，读者可参考本文的网络版本。）
3.7. 氢气释放和生物安全性检测
我们还评估了体外和体内的生物安全性。对于血管内皮细胞和肺泡上皮细胞，在0–100 μg/ml的浓度范围内未发现显著毒性。而在20 μg/ml的浓度下，两种类型的细胞均表现出明显的增殖促进效果（图5D）。因此，后续体外实验均采用这一浓度。体内生物安全性通过溶血试验进行检测。即使在最高浓度100 μg/ml下，也未观察到明显的溶血现象（图5E）。因此，我们证明了DQB@C的生物安全性和还原能力。我们主要关注氢气的释放。在图5F中，与DQB相比，DQB@C在pH 6.8环境中具有持续而缓慢的氢气释放。并且在CLP手术后6小时的时间点，全身性炎症开始形成，我们可以观察到器官中出现大量的分子氢（图5G）。
3.8. 细胞内吸收和抗氧化应激检测
在图5H中，我们观察到两种类型的细胞在与DQB@C共培养2小时、12小时和24小时后均显示出较强的绿色荧光。这表明DQB@C具有良好的携带药物进入细胞的能力。此外，我们通过DHE探针检测超氧阴离子。如图6A所示，两种类型的细胞在LPS激活后产生大量超氧阴离子。加入富含分子氢的水后，细胞内超氧阴离子水平开始下降。与氢水相比，DQB具有更好的保护能力。而DQB@C能够最大限度地防止细胞内超氧阴离子的产生。与超氧阴离子不同，DCFH-DA检测可以间接反映GSH的消耗。活性氧物种的变化类似于超氧阴离子（图6B）。DQB@C能够减少由LPS诱导的细胞内ROS积累。这可以防止细胞内GSH的过度消耗。Fe2+的积累也与氧化应激有关。在图6C中，我们可以明显观察到细胞内Fe2+的荧光强度显著增加。HW和DQB抑制了这种积累。有趣的是，DQB@C处理几乎可以将Fe2+积累水平恢复到正常水平。二氢槲皮素能与Fe2+形成复合物，具有更好的抗氧化应激和减少Fe2+积累的能力[38]。
图6. 体外抗炎和抗氧化应激验证。（A）两种细胞类型的DHE染色荧光图像。红色代表DHE。蓝色代表细胞核。直方图表示相对DHE荧光强度。不同颜色代表不同组。标尺，40μm。直方图以平均值±标准差表示，n=5。（B）两种细胞类型的ROS检测荧光图像。绿色代表活性氧。直方图表示相对ROS荧光强度。不同颜色代表不同组。标尺，40μm。直方图以平均值±标准差表示，n=5。（C）细胞内Fe2+分布的荧光图像。红色代表由FerroOrange探针标记的Fe2+。蓝色代表细胞核。直方图表示相对Fe2+荧光强度。标尺，40μm。直方图以平均值±标准差表示。（D）线粒体膜电位的荧光图像。红色代表JC-1聚合体，绿色代表JC-1单体。标尺，10μm。直方图以平均值±标准差表示，n=5。（E）三种炎症因子的ELISA结果。使用虚线分隔不同细胞的结果。直方图以平均值±标准差表示。图中标注了具体的P值，n=5。（关于此图例中颜色的解读，读者可参考本文的网络版本。）
线粒体功能也受到氧化应激的影响。在图6D中，LPS能够降低线粒体膜电位。分子氢能够在一定程度上阻止这种下降。自组装的DQB纳米颗粒增强了这一效果。更重要的是，DQB@C纳米系统实现了保护线粒体免受LPS损伤。
3.9. 抗炎能力检测
此外，我们观察了两种细胞在LPS刺激前后以及纳米系统影响下的炎症因子分泌能力。对于内皮细胞和上皮细胞，IL-6是主要的分泌因子，因此检测了IL-6的表达水平[35]。同时，我们检测了TNF-α和IL-1β的水平，以验证它们与Zo-1和Esam蛋白的关系。如图6E所示，LPS刺激后IL-6水平显著增加。富含分子氢的水能够将这种异常变化减少到病理状态的一半。DQB@C增强了这一正面效果。在HUVECs中，DQB@C能将Il-6从258.4 pg/ml降至134.5 pg/ml。在BEAS-2B中，经DQB@C处理后，Il-6从138.5 pg/ml降至73.5 pg/ml。对于这两种细胞类型，TNF-α和IL-1β水平的变化也表现出与Il-6类似的趋势。因此，我们的纳米系统在抗炎方面具有协同效应。
3.10. 体外抗铁死亡和紧密连接保护评估
对于铁死亡，检测了两种蛋白质（Slc7a11/xCT和Cox2）。对于Slc7a11，一种起保护作用的蛋白质，LPS刺激降低了两种细胞类型中的表达水平。DQB@C防止了这种下降并保持了比HW更高的蛋白表达水平（图7A）。
图7. 体外抗铁死亡和紧密连接保护的结果。（A）细胞内Slc7a11/xCT蛋白表达水平的荧光图像。绿色代表Slc7a11，蓝色代表细胞核。标尺，40μm，n=5。（B）细胞内Cox2蛋白表达水平的荧光图像。红色代表Cox2，蓝色代表细胞核。标尺，40μm，n=5。（C）内皮细胞中Zo-1和Esam蛋白的Western blot结果。直方图以平均值±标准差表示。图中标注了具体的P值，n=3。（关于此图例中颜色的解读，读者可参考本文的网络版本。）
我们还观察了细胞水平上Cox2的变化。由于LPS的影响，两种细胞的蛋白质水平均有所增加。这些导致了铁的积累和细胞损伤。这与我们在氧化应激中所观察到的一致。随着富含分子氢的水和DQB的加入，我们观察到异常升高的蛋白质水平回落（图7B）。Zo-1和Esam这两种蛋白质主要在血管内皮细胞中表达。因此，我们重点关注HUVEC中的蛋白质水平变化。我们观察到20μg/ml的DQB和富氢水能够保护细胞免受LPS毒性。在HW和DQB的影响下，Zo-1蛋白表达水平分别增加到LPS的1.5倍和2倍（图7C）。DQB@C能够增强这一正面效果。Esam蛋白是组装的结果。与仅使用分子氢相比，DQB@C具有更有效的保护效果。这表明DQB@C能够保护Zo-1和Esam免受炎症状态的影响。它最大化了分子氢和二氢槲皮素在HUVEC中的协同保护作用。
3.11. 生存率和体内抗炎效果评估
如图8A所示，根据此过程进行了体内实验。首先，我们将小鼠24小时生存率与假手术组、CLP组、CLP+DQB组、CLP+DQB@C组和CLP+美罗培南组进行了比较（图8B）。DQB@C能够将生存率提高到70%，与美罗培南相同（CLP为40%，CLP+DQB为50%）。
图8. 体内抗铁死亡和器官保护验证。 （A）体内实验的具体流程。（B）五组的生存率曲线。不同的颜色代表不同的组。直方图以平均值±标准差表示，n=5。（C）体内实验中血清CRP水平的变化。直方图以平均值±标准差表示。图中标注了具体的P值，n=5。（D）不同组的细菌血培养结果。（E）体内实验中血清ALT、肌酐、Sp-D和s-RAGE水平的变化。直方图以平均值±标准差表示。图中标注了具体的P值，n=5。（F）体内实验中重要器官的H&E染色。包括五个器官和五组。标尺（心脏、肝脏、肺、肾），50μm。标尺（脾脏），100μm。（G）肺部Esam和Zo-1蛋白共定位的荧光图像。绿色代表Esam，红色代表Zo-1。蓝色代表细胞核。标尺，50μm，n=5。（H）肺部Fe2+、GSH和MDA浓度的结果。直方图以平均值±标准差表示。图中标注了具体的P值，n=5。（关于本图例中颜色的解读，读者可参考本文的网络版。）
首先，我们评估了体内的抗炎效果。CRP是评估炎症的直接指标。在图8C中，DQB治疗并不能显著降低血清中的CRP浓度。然而，DQB@C能够改善DQB的抗炎效果，其效果接近美罗培南。此外，我们还评估了抗感染效果，这也是CLP小鼠败血症的诱因之一。在图8D中，DQB@C能够减少由CLP手术引起的血液中细菌浓度，但其抗感染效果不如美罗培南。
3.12. 体内器官保护和靶向治疗效果
肝脏和肾脏的代谢指标得到了指示。在图8E中，经过DQB@C治疗后，ALT水平下降，这表明肝功能得到了恢复。对于肌酐水平，DQB@C治疗组表现出比美罗培南治疗组更好的清除肌酐的能力。对于两个与肺相关的指标，sRAGE和s-PD都能反映肺的损伤程度。在这些指标上，DQB@C也表现出比美罗培南更好的保护能力。
对于H&E染色，CLP手术后五个器官都出现了损伤迹象。从图8F中，我们可以观察到DQB@C治疗的效果，包括修复心肌纤维、缓解肺泡肿胀、肝细胞和肾小管上皮细胞的病变以及脾脏骨髓结构的恢复。
我们特别关注了肺部相关蛋白表达的变化。在图8G中，Zo-1和Esam蛋白的变化是一致的。CLP手术导致Zo-1和Esam蛋白水平下降，而DQB能够恢复这些下降。与单独使用DQB相比，综合使用DQB@C能够增强保护效果。更重要的是，与美罗培南相比，DQB@C在Zo-1和Esam的表达水平上表现出更好的效果。这表明DQB@C能够在体内靶向紧密连接。为了揭示肺部与铁死亡相关的变化，检测了GSH、MDA和Fe2+浓度。
这三个指标能够显示肺部的氧化应激和铁积累变化。DQB@C有助于消除过多的铁离子积累并增加抗氧化剂（MDA和GSH）的水平（图8H）。
4. 讨论
对于严重败血症患者，约50%会发展为急性肺损伤，且败血症诱导的肺损伤与其他原因导致的肺损伤相比具有更高的死亡率。在本研究中，Tjp1-Esam和铁死亡被确定为氢气治疗的潜在蛋白和通路靶点。为了促进氢气治疗，基于自组装纳米粒子的纳米藻系统被构建。进一步的实验验证了纳米藻系统能够将氢气和天然药物治疗结合起来，用于预防急性肺损伤。
在生物体中，大量的蛋白质发生磷酸化，这会影响细胞内信号传导、细胞生命周期、代谢过程，并调节病原微生物的适应性等。许多研究表明，一些重要的生物标志物在疾病如肺癌、皮肤癌、慢性髓细胞性白血病、阿尔茨海默病和糖尿病等中存在磷酸化紊乱。磷酸化蛋白质组学在揭示败血症的发病机制和分子氢治疗方面的作用也有报道。例如，氢气可以通过磷酸化介导的PI3K-Art信号通路减轻败血症诱导的脑损伤。在与败血症相关的肺损伤中，我们通过磷酸化蛋白质组学分析发现Esam和Tjp1的表达发生了显著变化。Esam是一种磷酸化激酶，研究表明Esam基因失活会增强肺血管的通透性，但不会影响心脏、皮肤和大脑。Tjp1是一种紧密连接蛋白，是Esam的底物，对维持血管完整性起着重要作用。在我们的研究中，我们发现在败血症中，Zo-1的S(1)VAS(1)S(1)QPAKPTK磷酸化位点表达上调。氢气治疗能够使其下调表达。研究证明，Zo-1的磷酸化可以破坏紧密连接。对于Esam，我们鉴定了MGAVPVMVPAQS(1)QAGS(1)LV位点，分子氢能够防止其在败血症中的下调表达。Esam是Zo-1的激酶，因此其磷酸化对于保护紧密连接是有益的。
代谢变化和代谢组学模式对急性肺损伤的发展至关重要。在代谢组学分析中，铁死亡和谷胱甘肽代谢同时被提出。研究表明，谷胱甘肽代谢的功能障碍在铁死亡的发生中起着关键作用。最近的研究显示，铁死亡在败血症的发生和发展中扮演重要的调控角色。研究人员开始关注靶向铁死亡是否能够达到疾病预防和治疗的目标。一项研究报告称，二氢槲皮素通过调节Nrf2信号通路抑制COPD中的铁死亡。因此，这两条途径被视为我们研究中氢气的作用靶点。
二氢槲皮素具有强抗氧化能力，分布广泛且含量丰富，因此其药用价值在一定程度上得到了认可。最新研究表明，二氢槲皮素通过调节巨噬细胞M2极化改善了LPS诱导的小鼠急性肺损伤。另一项研究还显示，二氢槲皮素可以改善败血症诱导的肺毛细血管渗漏。然而，由于二氢槲皮素的水溶性差及其吸收困难。自组装纳米系统DQB@C最大程度地保留了二氢槲皮素的化学特性。体外实验表明，它具有良好的抗氧化能力和快速的细胞内吸收与释放能力。
我们主要依靠氨硼烷的产氢能力和Chlorella pyrenoidosa的携带能力来实现感染响应的氢气释放。许多研究已经证实了氢气在各种疾病中的保护作用，包括败血症，目前的给药方法主要是氢气吸入和富氢水的灌胃。一项研究开发了一种可生物降解的载有妥布霉素的镁微型发动机（Mg-Tob motor），作为潜在的氢气发生器和活性抗生素输送剂，用于协同治疗败血症，显著提高了败血症患者的生存率。然而，金属纳米粒子可能带来生物安全问题。与之前将微藻嵌入阳离子聚合物的研究不同，DQB@C纳米系统是一个动态稳定的系统。CLP模型中败血症的发展迅速，因此，DQB@C系统中的主动性吸收和动态附着可以确保DQB纳米粒子在炎症期间快速释放氢气和二氢槲皮素。体外实验结果显示，血管内皮细胞和肺泡上皮细胞都将携带自组装纳米粒子的纳米藻吞噬到细胞内，从而提高了细胞的氧化应激反应并增加了Esam和Tjp1的表达水平。
进一步的体内实验确认了纳米藻系统的有效性。纳米藻减少了全身的炎症反应，提高了生存率，并调节了小鼠的紧密连接和铁死亡。我们特别比较了纳米藻系统与美罗培南的效果。之前的一研究开发了一种银金属有机框架（AgMOF）纳米粒子来抵抗细菌和治疗炎症，也与美罗培南进行了比较。根据我们的实验数据，DQB@C在严重败血症的急性阶段可以实现接近美罗培南的多器官保护效果。这与我们的研究假设一致，而且我们构建的纳米藻显著提高了二氢槲皮素的利用率。
在抗感染方面，DQB@C可能由于组织中紧密连接的保护而抑制菌血症的发展。然而，DQB@C仍然缺乏类似美罗培南的杀菌能力。这将是我们未来的研究重点。
5. 结论
本研究构建了一种新型纳米系统，能够在感染微环境中释放氢气。自组装纳米粒子具有良好的生物安全性，与氢气相同，并提高了对败血症相关急性肺损伤的预防效果。
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