细胞内的活性分子（如活性氧、金属离子等）在生命活动中扮演着关键角色，其变化水平与细胞增殖、分化、凋亡及多种疾病的发生发展密切相关。荧光染料凭借高灵敏度、高特异性、实时监测、操作简便等优势，已成为生命科学研究中检测细胞内活性分子的核心工具。这类染料能够通过与目标活性分子发生特异性相互作用（如氧化还原反应、配位结合等），引发荧光信号的改变（如荧光强度增强/减弱、发射波长位移等），从而实现对细胞内目标分子的定性与定量分析。

一、检测细胞内活性氧（ROS）相关分子的荧光染料

活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是细胞代谢过程中产生的一类含氧、具有高化学反应活性的分子，既可作为关键信号分子参与生理调控，也能引发氧化损伤^[1]。H₂DCFDA（DCFH-DA，2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一种广泛应用于氧化应激研究的细胞渗透性荧光探针。H₂DCFDA（CAS No.：4091-99-0）本身无荧光，进入细胞后经胞内酯酶水解脱去乙酰基，转化为非荧光的DCFH；后者被细胞内活性氧（ROS）氧化为强荧光产物DCF（激发/发射波长约488/519 nm），通过荧光强度的变化反映细胞内氧化应激水平^[2]。DCFH-DA的工作浓度一般为10 μM，需要使用无血清培养基配制，在避光环境下，37℃染色30分钟。

DPBF（1,3-二苯基异苯并呋喃，1,3-diphenylisobenzofuran，AbMole，M40799）也是一种高灵敏度的荧光探针，广泛用于活性氧（ROS）特别是单线态氧（¹O₂）和过氧化氢（H₂O₂）、活性氮（RNS）的检测。DPBF（CAS No.：5471-63-6）的激发和发射波长为495/523 nm。在ROS或者RNS的氧化下，细胞内的DPBF发生不可逆降解，导致其荧光强度显著降低；因此，可通过监测523 nm处荧光的减弱程度来定量分析ROS/RNS水平。该探针常用于光动力（PDT）研究中单线态氧产率的评估，需注意避光操作并控制孵育时间以避免自氧化干扰。DPBF的常用工作浓度为10–20 μM^[3]。

除了DCFH-DA和DPBF外，还有多种荧光染料可用于ROS检测。例如，MitoSOX Red（AbMole，M19992，CAS No.：1003197-00-9）是一种线粒体靶向的超氧阴离子荧光探针，它能穿透细胞膜并选择性地定位于线粒体，被超氧阴离子氧化后发出红色荧光（激发/发射波长约510/580 nm），可特异性检测线粒体中的超氧阴离子水平。另一种常用的探针是Hydroethidine（Dihydroethidium，DHE，氢化乙锭，AbMole，M9696，CAS No.：104821-25-2），其本身无荧光，进入细胞后被超氧阴离子氧化为具有红色荧光的Ethidium，Ethidium可嵌入DNA中，从而增强荧光信号，适用于检测细胞内的超氧阴离子。

SOSG（单线态氧绿色荧光探针，AbMole，M54813）是一种专门用于检测单线态氧（¹O₂）的荧光探针，其激发/发射波长约为504/525 nm。SOSG本身荧光较弱，当与单线态氧发生特异性反应后，会生成具有强荧光的产物，荧光强度与单线态氧的浓度呈正相关。该探针具有高选择性和灵敏度，常用于光化学、光生物学等领域中单线态氧生成的实时监测。

Peroxy Orange 1（PO1，AbMole，M56887，CAS No.：1199576-10-7）是一种高选择性的细胞可渗透型过氧化氢（H₂O₂）荧光探针，用于活细胞内源性H₂O₂的实时、定量检测^[4]。

Hydroxyphenyl Fluorescein（羟基苯基荧光素，HPF，AbMole，M58445）是荧光素的衍生物，主要用于羟基自由基（·OH）的检测，Hydroxyphenyl Fluorescein（CAS No.：359010-69-8）具有高摩尔吸光系数、高荧光量子产率及良好的光稳定性，当其被·OH氧化后，可生成强荧光的荧光素产物，最大发射波长为515 nm，激发波长为490 nm。

二、胞内离子荧光探针

细胞内离子（如K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等）是维持渗透压平衡、酸碱稳态、膜电位及生物催化反应的必需成分。针对胞内离子，已经开发了一系列相关探针，为胞内离子的可视化研究提供了工具。

1. 钙离子荧光染料

钙离子（Ca²⁺）作为经典的第二信使，可调控基因表达、增殖、分化、DNA修复、凋亡、激素分泌及细胞迁移。Fluo-4 AM（AbMole，M3836，CAS No.：273221-67-3）是一种乙酰甲酯（AM）修饰的小分子荧光钙指示剂，其中AM基团赋予探针脂溶性，使其可自由穿透细胞膜；进入胞质后，被内源性酯酶水解为带负电荷的Fluo-4，滞留于胞质中。当与游离Ca²⁺结合时，荧光强度显著增强（激发/发射波长约485/526 nm），实现对胞质钙动态的实时监测。Fluo-4的荧光信号具有钙依赖性——可被钙螯合剂（EGTA 、BAPTA-AM ）抑制，被钙离子载体（Calcimycin 、离子霉素 增强^[5]。Fluo-4 AM多用于哺乳动物神经细胞（如海马神经元、三叉神经节神经元），以及心血管与肌肉细胞中的钙离子检测。Fluo-3 AM（AbMole，M9960，CAS No.：121714-22-5）和Fluo-8 AM（AbMole，M15051，CAS No.：1345980-40-6）是Fluo-4 AM的类似物，也是科研经常使用的钙离子荧光探针，其中Fluo-8 AM具有与Fluo-4 AM相同的光谱特性，但量子效率更高，荧光强度更强。

Mag-Fluo-4 AM（AbMole，M31282， CAS No.：1097709-31-3）是在Fluo-4 AM的基础上经过特定的化学修饰降低了其自身对钙离子的亲和力，这种修饰有利于对胞内含有较高钙离子浓度的细胞器进行检测，例如内质网，以降低对胞质钙离子的敏感性。因此Mag-Fluo-4无需复杂的细胞器靶向修饰，即可实现对高钙细胞器的特异性检测。

Fura-2 AM（Fura-2-acetoxymethyl ester，M9807，CAS No.：108964-32-5）是一种比率型钙离子荧光探针，Fura-2 AM为脂溶性前体，可穿透细胞膜进入胞内，经酯酶水解为水溶性Fura-2，后者可逆结合游离Ca²⁺。结合钙离子后，其最大激发波长由380 nm（钙离子未结合状态）移至340 nm（钙离子结合和状态），而发射波长保持约510 nm不变。通过同步测定340 nm与380 nm激发下的荧光强度比值（340/380），可定量反映胞内游离钙浓度^[6]。

2. 铁离子探针

铁离子作为多种酶和辅因子的关键组分，参与线粒体电子传递、氧化磷酸化、ATP生成及铁硫簇（Fe/S）组装，DNA合成与修复、核苷酸合成等多种细胞活动，对细胞呼吸和能量代谢至关重要。铁离子的失衡可导致铁过载，触发细胞的铁死亡。

FerroOrange（AbMole，M42835）是一种特异性检测细胞内二价铁离子（Fe²⁺）的荧光探针，在活细胞中无需固定或透化处理即可实现Fe²⁺的检测，在结合Fe²⁺后发橙红色荧光（激发波长540 nm，发射波长580 nm）。FerroOrange具有较高的选择性：对Fe²⁺的选择性比Fe³⁺高约1000倍，并且对其他金属离子（如Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺等）不敏感。FerroOrange常用于研究铁死亡（ferroptosis）过程中的铁离子变化，以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病中的铁沉积研究。

FeRhoNox-1（亚铁离子荧光探针，AbMole，M21552）是一种基于罗丹明骨架的荧光探针，其中罗丹明B发色团作为荧光信号源，在未结合铁离子时，FeRhoNox-1呈闭环结构，几乎无荧光；而当FeRhoNox-1与铁离子结合后，分子内电子转移（PET）效应被抑制，荧光显著增强。最大激发波长为560 nm，最大发射波长580 nm，发红色荧光。

3. 锌离子探针

锌离子（Zn⁺）是许多酶与蛋白质的辅因子或者结构稳定剂，更为重要的是锌离子还具有转录调控活性：锌离子通过结合锌指蛋白，参与转录因子的活性调节。锌离子探针是研究锌离子功能的重要工具，其中TSQ（锌荧光探针，6-甲氧基-(8-对甲苯磺酰胺基)喹啉，AbMole，M55640，CAS No.：109628-27-5）是一种经典的锌离子荧光探针，与锌离子、囊泡锌结合后形成荧光加合物，显著增强自身荧光信号^[7]。

Zinpyr-1（AbMole，M29845，CAS No.：288574-78-7）是一种广泛应用于生物体系中锌离子检测的小分子荧光探针，基于荧光素平台构建，其结构含席夫碱基团。锌离子结合后诱导席夫碱水解，形成金属配合物，引发荧光增强与发射光谱蓝移。随着锌离子浓度增高，Zinpyr-1的激发波长从515nm迁移到507nm。

Zinquin ethyl ester（AbMole，M58577，CAS No.：181530-09-6）是一种由紫外激发的荧光染料，能特异性结合游离Zn²⁺，用于实时检测生物样本中的锌动态分布。未结合锌离子时，Zinquin ethyl ester （ CAS No.：181530-09-6）几乎无荧光，与锌离子结合后可由紫外光激发并发出蓝色荧光（激发波长355-368 nm，发射波长490-491 nm）。

4. 铜离子 (Cu⁺)探针

铜死亡是一种铜离子（Cu⁺）依赖性的新型细胞死亡方式，由细胞内铜离子异常积累触发。研究发现铜离子可特异性结合线粒体三羧酸（TCA）循环中的脂酰化蛋白，导致蛋白功能障碍和聚集，并诱导细胞死亡。铜离子的变化是铜死亡探究中最重要的研究指标，Coppersensor 1（CS1，AbMole，M55335）是一种基于 BODIPY（氟硼二吡咯）骨架的 “turn-on” 型荧光探针，专门用于检测活细胞内的一价铜离子（Cu⁺），Coppersensor 1（CAS No.：874748-20-6）由荧光报告基团和Cu⁺识别受体两个部分组成，其荧光报告基团为BODIPY发色团，而富含硫醚（thioether）的侧链则作为Cu⁺识别受体，对 Cu⁺具有皮摩尔级（pM）的高亲和力，且能有效区分 Cu⁺与 Cu²⁺及其他常见金属离子（如 Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）。未结合 Cu⁺时，硫醚侧链通过光诱导电子转移（PET）效应，淬灭 BODIPY 的荧光，当 Cu⁺与硫醚受体特异性结合后，PET 效应被阻断，BODIPY 的荧光恢复并显著增强（激发约 543 nm，发射约 576 nm）。该探针具有良好的膜通透性，可实时追踪细胞内铜离子的变化。

5. 钠离子和氯离子探针

钠离子（Na⁺）和氯离子（Cl⁻）是细胞内最丰富的无机离子之一，它们共同维持着细胞的稳态和多种生命活动，例如维持渗透压与细胞体积、调节膜电位与电信号传导。SBFI-AM（AbMole，M13423，CAS No.：129423-53-6）是一种比率型紫外激发 Na⁺荧光探针，SBFI-AM具有膜通透性，可被动进入细胞。进入后，胞内酯酶水解AM酯，生成带负电的SBFI，被“捕获”在胞内。SBFI 分子含有两个羧酸基团，可特异性结合 Na⁺。未结合 Na⁺时，SBFI在340 nm 激发下荧光较弱；结合Na⁺后，构象改变，340 nm激发的荧光增强，而380 nm 激发的荧光减弱。通过检测 340 nm/380 nm 激发下的荧光强度比值，可定量细胞内 Na⁺浓度。MQAE（AbMole，M13793，CAS No.：162558-52-3）是一种荧光猝灭型 Cl⁻探针，其本身具有强烈的蓝色荧光（激发350 nm，发射460 nm），在无 Cl⁻时荧光量子产率高。Cl⁻作为碰撞猝灭剂，与 MQAE 分子碰撞后，通过非辐射跃迁消耗激发态能量，导致荧光强度显著降低。其荧光猝灭程度与 Cl⁻浓度呈线性关系。

三、一氧化氮 (NO)探针

一氧化氮（NO）是重要的气体信号分子，参与血管舒张、神经传递、免疫防御及细胞凋亡等多种生理病理过程，其稳态失衡与高血压、炎症、神经损伤、肿瘤等疾病密切相关。DAF-2DA（5,6-Diaminofluorescein diacetat，AbMole，M29138）与 DAF-FM DA（Diaminofluorescein-FM diacetate，AbMole，M7749）是目前检测活细胞内NO最常用的荧光探针，二者均以 AM 酯形式进入细胞，经酯酶水解后与 NO 发生特异性反应，生成强荧光产物，实现针对NO的实时成像与定量分析。DAF-FM DA（CAS No.：254109-22-3）和DAF-FM DA（CAS No.：254109-22-3）具有荧光更强、光稳定性好、pH 不敏感等优势，应用广泛。两种探针已成为心血管、神经、免疫及肿瘤等领域中，监测 NO 动态变化、阐明信号通路与评价分子活性的重要工具。

四、葡萄糖探针

葡萄糖是细胞能量代谢与增殖活动的核心底物，其摄取效率直接反映细胞代谢状态，检测胞内葡萄糖在肿瘤发生、免疫激活、神经功能及糖尿病研究中具有重要意义。2-NBDG（AbMole，M6327，CAS No.：186689-07-6）是一种经典的荧光标记葡萄糖类似物，结构与天然葡萄糖高度相似，可通过葡萄糖转运蛋白（GLUT）被活细胞特异性摄取。因其自带绿色荧光，可实时示踪葡萄糖的转运与分布，荧光强度与细胞葡萄糖摄取量呈正相关。该探针操作简便、生物相容性好，适用于荧光显微镜、流式细胞仪等检测，被广泛用于评估细胞代谢水平、筛选糖代谢调节剂、揭示肿瘤与免疫细胞的代谢重编程机制，是细胞葡萄糖摄取研究的常用工具。

五、胞内酶检测

Fluorescein diacetate（FDA，二乙酸荧光素，AbMole，M5115）、Fluorescein di(β-D-galactopyranoside)（FDG，AbMole，M13784）及其衍生物 C12FDG（AbMole，M57284）是一类基于酶促激活的经典荧光探针，广泛用于细胞活性、溶酶体功能及细胞衰老检测。Fluorescein diacetate（CAS No.：596-09-8）可被动穿透细胞膜，被活细胞内酯酶水解生成绿色荧光的荧光素，荧光强度直接反映细胞内酯酶活性与细胞膜完整性，是快速评估细胞活力、存活率的通用探针。Fluorescein di(β-D-galactopyranoside)（CAS No.：17817-20-8）是 β‑半乳糖苷酶的天然底物，可用于示踪细菌、细胞及组织内的酶活性。在此基础上改造而成的 C12FDG （CAS No.：138777-25-0）具有更好的脂溶性与细胞通透性，被β‑半乳糖苷酶水解后产生强绿色荧光，可特异性标记衰老细胞，是检测细胞衰老标志物 SA‑β‑Gal的常用工具。

六、胞内pH检测

细胞内 pH是细胞维持正常生理功能的核心理化指标之一，其稳态由细胞膜上的离子转运体（如 Na-H⁺交换体、HCO₃⁻-Cl⁻交换体）和细胞器膜上的质子泵精准调控。检测细胞内 pH 的荧光探针多为pH 敏感型荧光染料，核心特性是荧光发射/激发光谱随环境 pH 改变发生可逆性变化（即荧光强度、荧光比值与 pH 呈定量关系），通过检测荧光信号的变化可换算出细胞内的实际pH值。BCECF-AM（AbMole，M9520，CAS：117464-70-7）是目前应用最广泛的细胞内 pH 检测探针，具有较强的细胞膜透过性，进入细胞后经酯酶水解为BCECF 。BCECF（CAS：85138-49-4） 的发射光谱十分稳定（最大发射波长约 535 nm），激发光谱受 pH 调控，存在两个特征激发峰：酸性条件下：440 nm（近紫外）激发的荧光强度较高；碱性条件下：490 nm（蓝绿）激发的荧光强度较高。在生理 pH 范围内，490 nm/440 nm 激发下的荧光强度比值（F490/F440）与 pH 呈严格的线性关系。

范例详解

1. AbMole的DCFH-DA（AbMole，M9096）用于检测巨噬细胞RAW264.7中的ROS变化。

源自文章：ACS Nano. 2025 Oct 21;19(41):36813-36825.

2. AbMole的2-NBDG（AbMole，M6327）是一种葡萄糖摄取荧光探针，用来评估HepG2细胞及原代肝细胞中的葡萄糖摄取情况。

源自文献：Nano Today. Volume 45. 2022. 101541.

参考文献及鸣谢

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[2] de Haan, L. R.; Reiniers, M. J.; Reeskamp, L. F.; et al. Experimental Conditions That Influence the Utility of 2'7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH(2)-DA) as a Fluorogenic Biosensor for Mitochondrial Redox Status. Antioxidants (Basel, Switzerland) 2022, 11 (8).

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