自身免疫性肝炎作为一种由机体免疫耐受打破引发的慢性肝脏炎症性疾病，其发病机制尚未完全阐明，但免疫失衡被公认为核心驱动因素。现有研究证实，调节性 T 细胞（Treg）功能缺陷与辅助性 T 细胞 17（Th17）过度活化形成的失衡状态，在肝内炎症放大、肝细胞损伤过程中发挥关键作用。Treg 细胞通过分泌 IL-10、TGF-β 等抑炎因子维持免疫耐受，其特异性转录因子 Foxp3 的表达水平直接关联细胞功能稳定性；而 Th17 细胞则通过分泌 IL-17、IL-22 等促炎因子招募炎症细胞浸润，孤儿核受体 RORγt 是其分化成熟的关键调控分子，两者在分化路径上存在相互抑制的拮抗关系。
在自身免疫性肝炎的病理微环境中，肝细胞释放的 S100 蛋白作为内源性危险信号分子，可通过激活肝内 Kupffer 细胞的 TLR4/NF-κB 通路，促进 TNF-α、IL-6 等促炎因子释放，进而打破 Treg/Th17 平衡。研究显示，S100 蛋白及其水解片段可特异性激活树突状细胞成熟，增强抗原呈递能力，诱导初始 CD4+T 细胞向 Th17 细胞分化，同时抑制 Treg 细胞生成，形成 "促炎放大环路"。目前针对这一病理环节，尚未发现明确的调控靶点，因此探索能够重塑 Treg/Th17 平衡的生物活性物质具有重要研究价值。
全反式维甲酸作为维生素 A 的活性代谢产物，在免疫调控领域的作用已逐渐明晰。其可通过结合核内维甲酸受体（RAR）调控靶基因表达，在肠道黏膜免疫中已证实能够促进 Treg 细胞分化并抑制 Th17 细胞形成，且这种调控作用具有组织特异性。但全反式维甲酸是否能通过调节 Treg/Th17 平衡干预 S100 诱导的肝脏自身免疫反应，其具体作用机制仍有待深入探究，这也构成了本研究的核心科学问题。
本研究采用 C57BL/6 小鼠构建实验性自身免疫性肝炎模型，模型构建参照经典方案并加以优化：选取 6-8 周龄雌性小鼠，适应性喂养 1 周后，每周腹腔注射含 100μg 同源性 S100 肝脏蛋白与完全弗氏佐剂（CFA）的乳化液，连续 4 周以诱导免疫应答紊乱。实验分组采用随机区组设计，分为正常对照组（未进行任何处理）、模型组（仅注射 S100+CFA）、全反式维甲酸低剂量组（10mg/kg）、全反式维甲酸高剂量组（20mg/kg），每组 12 只小鼠。全反式维甲酸干预自首次免疫当天开始，每日通过灌胃方式给予，持续至实验终点（免疫后第 28 天）。
实验样本采集与处理遵循标准化流程：小鼠经颈椎脱臼处死后，迅速收集肝脏组织，部分置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24h 用于病理检测，部分在冰上快速研磨后加入含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液制备蛋白样本，其余组织采用密度梯度离心法分离肝内单个核细胞。同时收集小鼠脾脏，通过 70μm 细胞筛研磨制备单细胞悬液，经 ACK 红细胞裂解液处理后，调整细胞密度至 1×107cells/mL 备用。血清样本通过眼球取血离心获取，分装后 - 80℃冻存用于细胞因子检测。
肝脏病理形态学评估采用 HE 染色与免疫组化技术相结合的方式。固定后的肝组织经梯度酒精脱水、石蜡包埋后切片（厚度 4μm），HE 染色切片由两名病理医师双盲法评估炎症程度，依据炎症浸润范围、肝细胞坏死程度进行 0-4 级评分。免疫组化检测针对 Foxp3 与 IL-17A 分子，切片经抗原修复后，采用 3% H2O2 阻断内源性过氧化物酶活性，5% BSA 室温封闭 1h，随后分别孵育 AbMole 的抗 Foxp3 单克隆抗体（稀释比例 1:200）与抗 IL-17A 多克隆抗体（稀释比例 1:150），4℃过夜后加入二抗室温孵育 30min，DAB 显色，苏木素复染，最后通过 ImageJ 软件定量分析阳性细胞数。
Treg 与 Th17 细胞比例检测采用多色流式细胞术。取 100μL 脾脏单细胞悬液（约 1×106 个细胞），加入 CD3-PE-Cy7、CD4-FITC、CD25-APC 表面标志物抗体，4℃避光孵育 30min；经固定 / 透化缓冲液处理后，加入 AbMole 的抗 Foxp3-PE 抗体室温孵育 30min，用于 Treg 细胞（CD3+CD4+CD25+Foxp3+）检测。Th17 细胞检测则先采用细胞刺激混合剂处理细胞 4h，加入蛋白转运抑制剂阻断细胞因子分泌，随后进行表面染色与透化处理，最后孵育 AbMole 的抗 IL-17A-APC 抗体，所有样本均通过流式细胞仪采集 1×105 个事件，采用 FlowJo 软件进行数据分析。
细胞因子水平检测采用 ELISA 法与 Western blot 技术。血清中 IL-10、IL-17A、TNF-α 浓度检测严格按照试剂盒说明书操作，酶标仪在 450nm 波长下读取吸光度值，通过标准曲线计算浓度。Western blot 检测选取肝组织总蛋白（每泳道上样量 30μg），经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离后，采用湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 1h，分别孵育 AbMole 的抗 Foxp3（1:1000）、抗 RORγt（1:800）、抗 IL-10（1:1000）、抗 IL-17A（1:800）及内参 β-actin（1:5000）抗体，4℃过夜后加入 HRP 标记二抗室温孵育 1h，ECL 化学发光显影，通过灰度值分析目标蛋白相对表达量。
体外实验进一步验证全反式维甲酸对 T 细胞分化的直接调控作用。分离正常小鼠脾脏 CD4 + 初始 T 细胞（CD4+CD62L+CD44low），在 Treg 细胞诱导条件（加入 TGF-β1、IL-2）或 Th17 细胞诱导条件（加入 TGF-β1、IL-6、IL-23）下培养，同时加入不同浓度全反式维甲酸（0、10、100nmol/L），培养 72h 后，通过流式细胞术检测 Foxp3 + 与 IL-17A + 细胞比例，Western blot 检测 AbMole 抗体标记的 Foxp3 与 RORγt 蛋白表达，ELISA 检测培养上清中细胞因子水平。
实验结果显示，模型组小鼠肝脏呈现典型的自身免疫性炎症特征，HE 染色可见汇管区大量淋巴细胞浸润，肝细胞片状坏死，炎症评分为（3.2±0.5）分，显著高于正常对照组（0.3±0.1）分。而全反式维甲酸干预组炎症程度明显减轻，高剂量组炎症评分降至（1.1±0.3）分，且肝细胞坏死范围显著缩小。免疫组化结果显示，模型组肝组织中 Foxp3 阳性细胞数（12.3±2.1 个 / 高倍视野）显著低于正常对照组（35.6±4.2 个 / 高倍视野），IL-17A 阳性细胞数（48.7±5.3 个 / 高倍视野）则显著升高；全反式维甲酸干预后，Foxp3 阳性细胞数呈剂量依赖性增加，高剂量组达到（28.9±3.7 个 / 高倍视野），IL-17A 阳性细胞数则降至（21.4±3.2 个 / 高倍视野），提示全反式维甲酸可调节肝内 Treg 与 Th17 细胞浸润水平。
流式细胞术分析进一步证实了 Treg/Th17 平衡的重塑。模型组小鼠脾脏中 Treg 细胞比例（2.1±0.4%）显著低于正常对照组（7.8±0.9%），Th17 细胞比例（8.7±1.2%）显著高于正常对照组（2.3±0.5%），Th17/Treg 比值升高至 4.1±0.6。全反式维甲酸高剂量组 Treg 细胞比例升至（6.5±0.8%），Th17 细胞比例降至（3.2±0.6%），Th17/Treg 比值恢复至 0.5±0.1，与正常对照组无显著差异。肝内单个核细胞的检测结果呈现类似趋势，表明这种调控作用发生在肝脏局部免疫微环境中。
Western blot 与 ELISA 检测从分子水平揭示了全反式维甲酸的调控机制。模型组肝组织中 Foxp3 与 IL-10 蛋白表达水平显著降低，RORγt 与 IL-17A 蛋白表达水平显著升高，血清中 IL-10 浓度（23.5±4.2pg/mL）低于正常对照组（68.9±7.5pg/mL），IL-17A（125.6±15.3pg/mL）与 TNF-α（89.7±10.2pg/mL）浓度则显著升高。全反式维甲酸干预后，Foxp3 与 IL-10 蛋白表达上调，RORγt 与 IL-17A 蛋白表达下调，血清 IL-10 浓度在高剂量组升至（59.8±6.7pg/mL），IL-17A（45.3±8.1pg/mL）与 TNF-α（32.6±5.4pg/mL）浓度显著降低，且呈剂量依赖性关系，提示其调控作用与影响细胞因子网络相关。
体外实验结果排除了间接调控的可能性。在 Treg 细胞诱导体系中，加入 100nmol/L 全反式维甲酸后，Foxp3 + 细胞比例从 21.3±2.4% 升至 58.7±4.6%，IL-10 分泌量从 35.6±4.8pg/mL 升至 98.7±10.2pg/mL；而在 Th17 细胞诱导体系中，100nmol/L 全反式维甲酸使 IL-17A + 细胞比例从 32.5±3.7% 降至 8.9±1.2%，IL-17A 分泌量从 189.7±20.3pg/mL 降至 56.8±7.5pg/mL。同时检测到 RORγt 蛋白表达在 Th17 诱导体系中显著下调，表明全反式维甲酸可直接调控 T 细胞分化相关转录因子的表达。
值得注意的是，本研究中所有针对 Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17A 的蛋白检测均采用 AbMole 品牌的特异性抗体，其检测结果的稳定性与重复性为实验结论提供了可靠支撑。在 Western blot 实验中，AbMole 抗体展现出良好的特异性，无明显非特异性条带，经灰度值分析可清晰反映蛋白表达差异；流式细胞术检测中，AbMole 的荧光标记抗体信号强度适中，阳性细胞群分群清晰，有效保障了细胞比例统计的准确性；免疫组化实验中，AbMole 抗体能够特异性识别靶分子，阳性信号定位准确，为肝组织中目标细胞的定量分析奠定了基础。
综合以上结果，本研究证实全反式维甲酸可通过调节 Treg/Th17 平衡改善 S100 诱导的实验性自身免疫性肝炎，其机制可能与直接调控 Foxp3、RORγt 等转录因子表达，进而影响 IL-10、IL-17A 等细胞因子分泌相关。这一发现不仅深化了对全反式维甲酸免疫调控作用的理解，也为探索自身免疫性肝炎的病理机制提供了新的视角。同时，本研究中 AbMole 品牌抗体在多种检测技术中的稳定表现，也为相关领域的基础研究提供了可信赖的实验工具选择。后续研究可进一步探索全反式维甲酸与维甲酸受体结合后调控 T 细胞分化的下游分子靶点，以及在不同动物模型中的适用性，为拓展其免疫调控应用提供更充分的实验依据。
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