以下是一个假说及其实验过程。
假说：昆虫的腿是其听觉器官。
实验：
（1） 定性实验：把昆虫腿全部截断后，猛敲桌子，昆虫不会逃跑；
（2） 定量实验：选取一批昆虫，不同程度地截断其腿，发现：昆虫腿截断的越严重，猛敲桌子后，其逃跑速度越慢（以至于0）；
（3） 对照实验：正常的昆虫，猛敲桌子，会跑；
（4） 补充实验：将截断腿的昆虫的腿续上，猛敲桌子，昆虫恢复逃跑。
结论：昆虫逃跑的速度和截断腿的多少相关，证明腿是昆虫的听觉器官。
（昆虫图）
有些滑稽，对不对？从目前生物实验假说及实验论证的框架下，这种情形还不少。曾近距离遇到过一个实例。万古霉素水解酶(VanX)能水解万古霉素，造成这种抗生素失效，这个水解过程是不会产生颜色变化。在做酶学实验的时候，就用了一种和万古霉素结构类似但可以产生颜色变化的物质作为底物，方便用吸光值的变化来实时记录酶的反应速率。这也是酶学中常用的一个策略。但是测这个酶的米氏常数时候发现，酶的活性变化很大，重复性不好。难道是酶的纯化有问题？重新纯化一批，再测，结果依然如此，而且两批之间的酶的活性差异很大。经过几年的折腾，才发现万古霉素水解酶纯化过程中，有一个大肠杆菌的酶（Peptidase N）同时被纯化出来，含量很低但正是这个宿主的酶水解了底物，而不是VanX的作用。最后确认VanX是无法水解这个有颜色变化的底物的。
（勘误文章）
（酰胺键被水解后，产生颜色底物用于检测）
万万没想到！
这样的事并不是孤例。杜克大学的Hellinga是一个蛋白酶理性设计的先行者，他相信通过rational design，可以设计并生产出我们需要的酶。2004的时候，他们实验室宣称成功设计出了一种基于受体（缺乏催化活性）的酶NovoTIM，模拟功能是TIM，而后者是糖酵解中一个异构酶。文章发表在《science》后引起轰动。大水牛大学的Richard觉得太了不起了。他和Hellinga实验室联系，拿到实验材料开始实验，结果蛋白纯化出来后，根本没有Science文章所宣称的活性，根本没有活性！这下问题就大了，后面的学生和导师，PI和学校，以及合作者之间的斗争非常戏剧，就不在此展开了。从实验设计的角度看，这个问题不复杂。TIM是大肠杆菌中本身就有的蛋白，Hellinga的学生在表达NovoTIM的时候用的是含有TIM的宿主菌，同时她在纯化蛋白的时候用的是分步洗脱，结果导致有活性的TIM（来源于宿主菌）和没有活性的NovoTIM同时被洗脱；在后面的实验中，混有TIM的NovoTIM表现出活性。而Richard纯化的时候，用了更精细的方法，他纯化的蛋白没有掺入宿主菌的TIM，因而检测不出活性。
（2004年，Hellinga组发表《Science》上的论文，该文章于2008年被撤回）
跟实验对照缺失相比较的，还有一个就是过度解读数据。
2010年的时候，NASA召开了一个新闻发布会，宣布找到了一种非凡的生物。Wolfe-Simon等在加州的一个砷含量很高盐水湖里分离出一种微生物GFAJ-1（有人解释说是论文作者当时正在申请J-1签证，该细菌命名表达了希望获取签字的愿望： Great Felisa Acquires J-1 ）。在控制磷在很低水平同时，通过逐步提高培养液中砷的含量，使得GFAJ-1可以在极高的砷溶液里生存。通过一系列的数据和分析，她认为GFAJ-1的DNA里的磷，（至少一部分）被砷取代了。如果DNA里的磷能被替代，这是一个了不起的突破，说明现在的生命形态是可以扩展的，组成生命的主要元素不只限于碳，氢，氮，氧，磷，硫，还可以用砷来替代磷。文章在《science》发表之后，随即引来众多的质疑。首先，由于磷的广泛存在，在实验中无法100%的清除磷，而这些背景浓度的磷，是否支持GFAJ-1在高浓度砷下生长。其次，磷脂键在水溶液里是稳定的，但是砷脂键在水溶液里是不稳定的，半衰期以分钟的计, 这些砷代的DNA怎么在体内稳定遗传的呢？当然，这个实验有一个不平凡的发现，就是在实验室里培育出极端耐砷的微生物。如果继续它的耐砷机理的话，应该有很多发现。但是在数据不够solid情况下，得出核酸里的磷被砷替代的结论，可以理解为过度解读数据了。尽管有非常多的人一直要求Science撤回该文章，但是没有证据表明该文章存在学术不端的情形，直到2025年的7月24日，Science杂志才决定将该篇论文撤回。
（2010年，Wolfe-Simon组发表《Science》上的论文，该文章于2025年被撤回）
在研究生时期，我也曾遇到类似的困境。毕业课题的一个任务是要确认一种含两个锌离子酶是需要0个，1个，2个锌离子才会有活性。当时的实验设计就是尽可能的去掉溶液里面的锌离子，然后用含有0个，1个，2个锌离子的酶（先把含离子的酶里面锌离子去掉，然后定量加入不同比例的锌离子）做活性测试，根据活性数据来回答到底需要几个锌离子；看着毕业师兄的数据，以及我重复的数据，我陷入深深的沉思：不同数量锌离子形态的酶，其Kcat, Km差异并不大，很难说明问题。我后来发狠，用接近毫摩尔的浓度的蛋白进行实验，结论就很清晰了：不含离子的蛋白没有活性；含1个离子的蛋白活性很低，而且反应机理与含2个离子的蛋白活性不一样；含2个离子的蛋白活性最高。原因在哪里呢：因为不管我们如何去除溶液里面的锌离子，溶液里仍然有100nM的是极难去掉的。而我们做稳态实验，用的酶就是nM级别浓度，溶液中自由的锌离子会结合到蛋白上去。而我用高出背景锌离子5个数量级的酶来做前稳态动力学实验（浓度太高，无法做稳态动力学实验），消除了这种干扰，也算是幸事一桩了。
（含有两个金属结合位点的酶: metallo-b-lactamase L1）
参考文献：
（1） Golich FC, Sigdel T, Breece RM, Detar L, Herron LR, Crowder MW. L-alanine-p-nitroanilide is not a substrate for VanX. Anal Biochem. 2004 Aug 15;331(2):398-400
（2） Dwyer MA, Looger LL, Hellinga HW. Computational design of a biologically active enzyme. Science. 2004 Jun 25;304(5679):1967-71
（3） Wolfe-Simon F, Switzer Blum J, Kulp TR, Gordon GW, Hoeft SE, Pett-Ridge J, Stolz JF, Webb SM, Weber PK, Davies PC, Anbar AD, Oremland RS. RETRACTED: A bacterium that can grow by using arsenic instead of phosphorus. Science. 2011 Jun 3;332(6034):1163-6
（4） Hu Z, Periyannan G, Bennett B, Crowder MW. Role of the Zn1 and Zn2 sites in metallo-beta-lactamase L1. J Am Chem Soc. 2008 Oct 29;130(43):14207-16
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