C1/C5 bi-substrate strategy boosts single-cell protein production in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris)
Bingqing He, Yan Xia, Tim McCubbin, Esteban Marcellin*, Yin Li, Taicheng Zhu*
01背景介绍
以粮食作物为原料的生物制造面临与粮食生产争夺耕地和原料的挑战，因此，开发不依赖粮食作物的非粮碳源，是推动可持续生物制造的重要方向。木糖是木质纤维素生物质中最丰富的五碳糖，属于第二代碳源，具有来源广泛、成本较低等优势，但相较于葡萄糖，微生物对木糖的同化速率通常较低。甲醇可利用可再生能源由二氧化碳转化制得，被视为第三代碳源，但其高效利用同样面临同化效率和碳转化得率低的挑战。
从代谢机制看，甲醇与木糖具有协同利用的理论基础。在甲基营养型酵母中，两者的代谢交汇于同一个关键中间产物——木酮糖-5-磷酸。甲醇首先被氧化为甲醛，随后甲醛与木酮糖-5-磷酸反应，进入一碳同化途径。为维持这一过程，细胞必须通过多步碳骨架重排持续再生木酮糖-5-磷酸，而这一再生环节可能制约甲醇的整体同化效率。木糖则可转化为木酮糖-5-磷酸，再经磷酸戊糖途径进入中心代谢。基于这一共同代谢节点，木糖有望为甲醛同化补充五碳受体，减少对部分碳骨架重排步骤的依赖；甲醇的加入也可能进一步影响木糖代谢及细胞整体的碳流分配。由此，甲醇/木糖双底物共利用能否突破单一碳源的效率瓶颈？其协同作用又通过何种代谢机制实现？这些问题仍有待系统验证。
近日，中国科学院微生物研究所朱泰承副研究员与澳大利亚昆士兰大学Esteban Marcellin教授团队于Green Carbon发表题为“C1/C5 bi-substrate strategy boosts single-cell protein production in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris)”研究文章，在工业应用广泛的甲基营养型酵母毕赤酵母中建立并验证了甲醇/木糖双底物策略的可行性，显著提升了单细胞蛋白产量，并阐明了其内在机制。
02 文章简介
简要介绍
单细胞蛋白（single-cell protein）是培养微生物获得的富含蛋白质的生物质，酵母来源的单细胞蛋白中，蛋白质可占细胞干重的40%–50%，在动物饲料领域应用成熟，并正逐步向人类营养食品拓展。毕赤酵母既是工业上应用最广泛的蛋白表达宿主之一，也是研究甲基营养型代谢的经典模式生物。
本研究以毕赤酵母为对象，将甲醇与木糖两种“非粮”碳源同时用于培养，从生长表型、代谢流与蛋白质组三个层面系统回答了一个此前尚未被验证的问题：两种碳源能否互相促进？结果表明，双底物策略在提升单细胞蛋白产量上取得了实质性突破，并揭示出两方面的增效机制（图1）。
图1. 研究总览：甲醇/木糖双底物策略的增产效果与两条增效机制
双底物策略使单细胞蛋白产量比单底物显著提升
研究团队在前期工作中对毕赤酵母的木糖利用能力进行了改造。野生菌株虽能利用木糖，但在木糖上的比生长速率较低，限制了双底物策略优势的发挥。通过引入异源木糖异构酶并结合适应性进化，研究获得了木糖利用能力增强的工程菌株GS-XI，其在木糖上的比生长速率达到与甲醇相近的水平，为两种底物的协同利用奠定了基础。
随后，团队以GS-XI为对象，比较了单独供给甲醇、单独供给木糖及两者混合供给时的生长与底物利用情况（图2）。在初始总碳源质量浓度均为20 g/L、培养72 h的摇瓶条件下，所测试的三种混合配比均获得了高于单一底物培养的终生物量。其中，原文报告20%甲醇/80%木糖（初始质量配比）条件下的终生物量较纯甲醇培养提高41%，较纯木糖培养提高65%，显示出明显的双底物协同优势（图3）。
图2. 不同碳源配比下的细胞生长曲线。双底物培养的终生物量显著高于任一单一底物（论文 Fig.2a）
图3. 共底物策略机制解析设计示意：碳源配比与¹³C标记，以及¹³C代谢流分析、蛋白质组分析解析路径（论文 Fig.2c）
甲醇促进木糖利用机制：甲醇激活木糖同化网络
甲醇为什么能帮助酵母利用木糖？形态观察显示，与纯木糖培养相比，加入甲醇后，细胞内的过氧化物酶体大量增殖。以纯木糖培养为对照，20%甲醇/80%木糖培养的蛋白质组分析进一步发现，其中多种碳骨架重排相关酶明显上调，而细胞质中的部分同类酶则出现下调，提示碳重排功能可能在不同细胞区室之间重新分配（图4）。
作者据此推测，过氧化物酶体的诱导增殖可能是促进木糖利用的关键：其一，过氧化物酶体内增强的碳重排能力可能补偿细胞质中相关酶下调的影响，使木糖代谢中间物进入过氧化物酶体后被重排为甘油醛-3-磷酸，再返回细胞质参与糖酵解与糖异生；其二，碳重排酶在过氧化物酶体内的空间限域可能有利于底物在细胞器内局部富集，为碳骨架重排提供更有利的微环境。
图4. 甲醇诱导过氧化物酶体增殖并激活其内的碳重排网络，可能促进木糖代谢中间物的高效重排（论文 Fig.3）
木糖促进甲醇利用机制：木糖改善碳流分配与能量利用
木糖如何改善甲醇利用效率？甲醇在毕赤酵母中被氧化为甲醛后，既可经同化途径用于生物量合成，也可经异化途径进一步氧化为二氧化碳。后者有助于解除甲醛毒性并产生还原当量，但也伴随着碳损失。
为量化这一过程，研究团队建立了包含细胞质、线粒体与过氧化物酶体分区的¹³C代谢流分析模型（图5）。模型估算显示，在三种混合底物条件中，随着木糖质量比例由20%升至80%，甲醇流向异化途径的比例由56.3%降至31.2%，同时碳流分配向糖异生、磷酸戊糖途径与三羧酸循环等途径调整，表明木糖的加入有助于减少甲醇异化造成的碳损失。
基于代谢流的估算显示，能量代谢也随之发生变化：随着木糖比例升高，NADPH生成通量增加，NADH生成通量减少，其中来自甲醇代谢的NADH占比由68.6%降至24.4%，ATP生成通量则与细胞生长速率同步提升。此外，在80%甲醇/20%木糖条件下，模型估算仅约三分之一的ATP来自氧化磷酸化，提示甲醇代谢产生的还原当量向线粒体的转运或其后续利用可能存在限制（图6）。
作者据此推测，在所测试条件下，甲醇异化产生的还原当量未必能充分转化为支持生长的能量，该途径可能更多地承担甲醛解毒功能。木糖的加入则通过减少异化碳损失、改善碳流与能量分配，使双底物利用更有利于细胞生长和生物量积累。
图5. 不同碳源配比下模型估算的细胞内代谢流分布。木糖比例升高后，甲醇流向异化途径的碳通量显著减少，更多碳流转向糖异生、磷酸戊糖途径与三羧酸循环（论文 Fig.4）
图6. 不同碳源配比下细胞的氧化还原与能量代谢。木糖比例升高后，模型估算的NADPH与ATP生成通量增加，NADH总生成通量下降（论文 Fig.5）
分区代谢流模型与蛋白质组学结果相互印证
以80%甲醇/20%木糖为参照，同一组培养物的蛋白质组数据与代谢流预测总体吻合：木糖比例升高时，过氧化物酶体中催化木酮糖磷酸循环的酶以及甲醛氧化的关键酶显著下调，木糖同化酶、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环与乙醛酸循环的多种关键酶则上调。这支持了分区¹³C代谢流分析的合理性，也说明纳入亚细胞分区信息有助于解析真核细胞的代谢重排（图7）——若忽略分区信息，模型给出的预测与实测蛋白质组数据相互矛盾。
研究还结合已有文献，提出双底物条件下可能存在碳代谢阻遏：木糖代谢产生的信号可能激活Mig1/Mig2/Nrg1等抑制因子，削弱甲醇代谢激活因子的作用，使甲醇同化通路受到抑制。这可能解释了为何双底物条件下甲醇消耗速率会随木糖浓度升高而下降，也为后续通过解除阻遏进一步放大策略效应提供了潜在靶点。
图7. 不同碳源配比下中心碳代谢关键蛋白的表达变化。木糖比例升高时，甲醇同化与异化相关酶下调，木糖同化与中心代谢的多种相关酶上调（论文 Fig.6）
总结展望
这项工作提出并验证了C1/C5双底物策略，揭示了“甲醇促进木糖同化速率、木糖改善甲醇转化得率”这一双向增效机制，为以木质纤维素生物质和甲醇为原料的可持续生物制造提供了实验依据和可操作的路线。下一步，可通过解除碳代谢阻遏、提高木糖异构酶拷贝数与木糖转运效率进一步放大策略效应，并在发酵罐尺度开展高密度培养验证，推动单细胞蛋白与高附加值产品共生产的产业化进程。
03 作者
朱泰承 副研究员
朱泰承，中国科学院微生物研究所副研究员。主要从事甲基营养型酵母的系统生物学与合成生物学研究，通过改造与重构毕赤酵母细胞工厂，实现利用一碳原料生产多种重要工业酶制剂、疫苗及高附加值化学品。先后作为课题负责人主持国家自然科学基金项目（4项）、北京市自然科学基金项目、国家重点研发计划子课题及中国科学院重点部署项目子课题等多项国家和省部级课题。在国内外期刊发表论文近50篇，申请或获授权发明专利10余项。现兼任中国生物工程学会一碳生物技术专业委员会委员、Green Carbon青年编委，并担任Nature Communications、Metabolic Engineering、Bioresource Technology、Chemical Engineering Journal、ACS Synthetic Biology、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Microbial Cell Factories等二十余个主流国际学术期刊审稿人。
Esteban Marcellin 教授
Esteban Marcellin，澳大利亚昆士兰大学澳大利亚生物工程与纳米技术研究所（AIBN）教授、生物可持续性中心创始主任，兼聘于化学工程学院，澳大利亚研究委员会（ARC）中期职业产业研究员。主要从事先进生物制造与系统代谢工程研究，融合多组学与计算模型，开展微生物细胞工厂设计及发酵工艺优化。牵头建设气体发酵中试平台及投资约6,000万澳元的生物可持续性中心，与LanzaTech、Woodside等企业开展深度合作；该中心于2025年获《澳大利亚金融评论报》高等教育行业合作奖。主持或承担多项ARC及产业合作项目，任Metabolomics Australia昆士兰节点负责人。在PNAS、Nature Communications、Nature Cell Biology、Metabolic Engineering等期刊发表论文130余篇，论文被引约5,400次，h指数40，并作为发明人申请或获授权多项发明专利。
04论文信息
论文信息：
Bingqing He, Yan Xia, Tim McCubbin, Esteban Marcellin, Yin Li and Taicheng Zhu. C1/C5 bi-substrate strategy boosts single cell protein production in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris)[J]. Green Carbon, 2025.
论文网址：
https://doi.org/10.1016/j.greenca.2025.11.009
论文下载：
中文解读链接：
Green Carbon文章丨甲醇/木糖双底物协同利用提升甲醇酵母单细胞蛋白产量
转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自GreenCarbon科学网博客。
链接地址：https://wap.sciencenet.cn/blog-3620330-1560050.html?mobile=1
收藏
