英文原题：Developing Rhodotorula as microbial cell factories for the production of lipids and carotenoids
作者：Ting-Ting Zhang, Ai-Hua Wu, Muhammad Aslam, Ji-Zhen Song, Zhen-Ming Chi, Guang-Lei Liu*
01 论文信息
论文信息
T.T. Zhang, A.H. Wu, M. Aslam, et al. Developing Rhodotorula as microbial cell factories for the production of lipids and carotenoids[J]. Green Carbon, 2024 2(4) 409-420.
论文关键词Rhodotorula; Lipids; Carotenoids; Microbial cell factory; Genetic manipulation
论文网址
https://doi.org/10.1016/j.greenca.2024.09.004
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Developing Rhodotorula as microbial cell factories for the production of lipids and carotenoids
中文解读原链接
Green Carbon文章│中国海洋大学刘光磊教授：红酵母——高效合成脂质和类胡萝卜素的细胞工厂
02 背景简介
红酵母属是一种属于担子菌门的非常规酵母菌，其细胞呈圆形、椭圆形或细长杆状，可产生醒目的红色或橙色色素。其广泛存在于各种自然环境中，可以在较为宽泛的温度和pH条件下生长繁殖。实验室培养红酵母通常使用的培养基包括酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基和含有葡萄糖、木糖、蔗糖和甘油等多种碳源的发酵培养基。红酵母还可以利用各种廉价碳源如：玉米水解物、木质纤维素等生长发酵有机物。作为优秀的产油酵母，红酵母在生物合成方面具有多样性，可生产非常有前途的生物燃料微生物油脂：甘油三酯（TAGs）、磷脂、甾醇酯（SE）、脂肪酸多元醇酯（PEFA）等；以及作为抗氧化剂、免疫增强剂的类胡萝卜素，包括β-胡萝卜素、托鲁烯和托鲁霍丁等。由于其可以利用各种廉价碳源高效生产大宗有机物，红酵母受到越来越多关注。
来自中国海洋大学刘光磊教授团队于Green Carbon上发表标题为“Developing Rhodotorula as Microbial Cell Factories for the Production of Lipids and Carotenoids”的综述文章，对红酵母起源、产品多样性以及遗传进展进行了全面的文献回顾，论述了红酵母作为微生物脂质、类胡萝卜素生产的高质量细胞平台的前景。
03 文章简介
简要介绍
本文综述了红酵母的研究进展和面临的挑战，包括适用的碳源及其利用机制、主要脂质和类胡萝卜素产物及其代谢途径。还提供了可用的基因操作技术和相关挑战的概述。在此基础上，强调了红酵母的研究意义，并探讨了其作为天然生物制品替代来源的潜力，如图1。
图1. 红酵母利用各种碳源以及基因改造途径生产有机化合物示意图
红酵母的分类
红酵母属于真菌界，担子菌门，锁掷酵母科。图2展示了红酵母属内的主要菌种以及来自密切相关属的一些重要菌株。Fresenius于1852年发现了第一株红酵母，最初被命名为Cryptococcus glutinis。2011年进行的系统发育研究导致红酵母属在2015年彻底更名为Rhodotorula。
图2. 从ITS序列推断红酵母属酵母种的系统发育
红酵母利用各种碳源
红酵母独特的代谢能力使其能够利用多种碳源产生多种有机化合物。包括易得的单糖，如葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖和阿拉伯糖，以及需要通过水解分解的更复杂的底物（图3），包括菊粉、糖蜜、木质纤维素、烷烃和游离脂肪酸。
菊粉经过红酵母菊粉酶水解可以被转化成果糖和少量葡萄糖利用；木质纤维素经过常见的预处理同步糖化发酵等可以被红酵母利用生产各种有机物；红酵母缺少直接利用木薯淀粉的能力，木薯淀粉需经过酸处理、酶固定化、脉冲无线电波等处理才能被红酵母利用吸收；红酵母还可以直接利用糖蜜、粗甘油产生酯类、类胡萝卜素等有价值化合物。
图3. 红酵母通过多种途径利用廉价碳源的示意图
红酵母可以积累大量的微生物脂质和类胡萝卜素
微生物脂类，也称为微生物油或SCO，包含一系列化合物，包括三酰基甘油、糖脂、甾醇和磷脂。红酵母是一种典型的担子菌，具有较高的产脂能力，与其他酵母和真菌不同，红酵母可以从不同的碳源合成脂质。在限氮条件下，酵母中的脂质积累可达干细胞重量的70%。从1943年开始，研究人员发现红酵母可以积累脂质后，至今为止通过基因编辑等手段，红酵母中脂质积累最高可达89.4 g/L。红酵母中脂质合成主要发生在细胞质基质中，首先在细胞质基质中合成脂肪酸，在经过一系列的转移酶首先转化为磷脂酸，再去磷酸化形成二酰基甘油。经过转移酶转化为三酰基甘油TAG，再经过脂肪酶催化转化为甾醇。研究表明，与其他产油酵母相比，红酵母的某些菌株表现出明显更高的脂质产量。这种区别可能是由于在脂肪酰基合成酶（Fas）中存在两个关键的酰基载体蛋白（Acp）结构域。这些Acp结构域在高脂产酵母菌脂质生物合成过程中将丙二酰辅酶A转化为酰基辅酶A中起关键作用。
类胡萝卜素是一种天然色素，可以提高人体免疫力，主要来源于植物提取物、真菌和细菌的维生素生物合成以及化学合成。类胡萝卜素分为两类：一类是仅由碳和氢组成的胡萝卜素（如β-胡萝卜素和番茄红素），另一类是含有羟基、酮、羧基和甲氧基等氧官能团（如叶黄素和虾青素）的叶黄素。红酵母可以积累大量的天然类胡萝卜素以及生产较为稀有的类胡萝卜素，托鲁烯和托鲁霍丁。目前红酵母产类胡萝卜素产量最高可以达到366.1 mg/L。红酵母利用糖酵解产生的乙酰辅酶A通过甲羟戊酸途径合成异戊烯焦磷酸再通过二磷酸戊烯基途径异构成二甲基丙烯焦磷酸，接下来通过丙烯基转移酶与三个异戊烯焦磷酸分子结合合成植物烯，再通过植物烯去饱和酶进一步将植物烯去饱和为链孢红素。然后，根据抑制剂或存在的应激条件，链孢红素可以经历各种转化，产生不同的类胡萝卜素。
脂肪酸多元醇酯（PEFA）也是红酵母的主要产物之一，是一种胞外糖脂，具有优异的两亲性、乳化活性、临界胶束浓度和抗真菌活性，是化工和制药工业中优良的表面活性剂。1960年从红酵母的发酵产物中分离得到脂肪酸和多元醇酯（PEFA前体物）后，到目前为止发现红酵母可以积累的PEFA产量最高可达48.5 g/L。红酵母生产PEFA的代谢途径尚未被解析，目前3-羟基脂肪酸、阿拉伯糖醇、甘露糖醇等前体物的合成已经有研究。
图4. 红酵母中代谢途径汇总
红酵母的遗传操作
与大肠杆菌等细菌和酿酒酵母、黑曲霉等真菌相比，红酵母的遗传操作由于其担子菌的特殊性和复杂性面临更大的挑战。开发有效的遗传操作方法非常有必要性。目前已经开发了四种将外源基因导入红酵母的转化方法，包括聚乙二醇原生质体介导转化（PMT）、农杆菌介导转化（ATMT）、电穿孔和醋酸锂法。其中PMT方法使用较少，1985年使用PMT转化方法成功转入苯丙氨酸裂解酶，转化效率1000 个/μg DNA。在红酵母的转化中，ATMT转化法较PMT转化法更为常用，2012年，有研究人员建立了红酵母完整的ATMT方法，其适用广泛，转化效率从70到1000每转化平板不等。红酵母目前最常用的转化方法为电穿孔转化法，转化效率可达2×103 个/μ DNA。也有研究人员完善醋酸锂转化法，但目前其效率只能达到25 个/μ DNA，转化效率相对较低。根据菌株特性选择合适的转化方法，多角度优化转化条件是红酵母遗传操作目前需要解决的问题。
图5. 红酵母转化方法示意图
目前关于红酵母遗传操作的相关遗传工具有筛选标记、启动子终止子等遗传因子。选择合适的筛选标记是红酵母转化的关键。红酵母可使用多种耐药标记，包括潮霉素耐药基因（Hpt-3）、诺尔斯菌素耐药基因（Nat）和博来霉素耐药基因（Ble）。此外，URA3基因（尿嘧啶营养缺陷型）和亮氨酸营养营养缺陷型等标记在筛选过程中起着关键作用；启动子和终止子等遗传因子在红酵母的遗传修饰中起着至关重要的作用，目前红酵母中的强启动子包括Ppgi、Ppgk等、诱导性启动子包括Pdao1、Picl1等以及终止子tHSP、tGPD等。利用这些遗传工具研究人员可以优化红酵母基因表达、提高基因修饰的效率和精度。
红酵母目前可利用的基因编辑工具基本有两种，同源定向修复（HDR）以及CRISPR-Cas系统。关于同源定向修复有研究人员证明敲除负责非同源修复的Ku70基因，红酵母的基因编辑效率提高。CRISPR-Cas系统再红酵母基因编辑中应用多为表型基因的破坏如Ura3基因及类胡萝卜素合成必需基因CrtI（敲除后显示白化表型），还未有更深层次的利用。
总结及展望
红酵母可以利用廉价碳源生产具有高价值的脂质、类胡萝卜素产品，通过代谢工程、优化生产工业等可以进一步提高红酵母的工业价值；通过对红酵母中独特代谢机制的研究，为微生物油脂代谢提供新思路；优化红酵母遗传代谢操作，为担子菌的代谢工程提供模式菌株。
04 文章摘要
Abstract
Amid resource shortages and environmental concerns, microbial synthesis has emerged as a promising and sustainable alternative to traditional chemical synthesis. Rhodotorula, a genus of yeasts known for producing red pigments, has gained recognition for its ability to synthesize triglycerides, phospholipids, sterol esters, polyol esters of fatty acids, β-carotene, γ-carotene, torulene, and torularhodin. Rhodotorula has garnered increasing attention as a microbial cell factory, particularly for the production of valuable lipids and carotenoids. In this study, we review the research advancements and challenges associated with Rhodotorula, covering topics such as applicable carbon sources and their utilization mechanisms, key lipid and carotenoid products, and their metabolic pathways. We also provide an overview of the available gene manipulation techniques and associated challenges. Furthermore, this study emphasized the research significance of Rhodotorula based on recent developments and explored its potential as an alternative source of natural biological products.
05 作者简介
刘光磊 教授
刘光磊，中国海洋大学海洋生命学院教授、博士生导师，Green Carbon青年编委。主要从事海洋酵母菌资源开发应用以及代谢途径解析重构和调控机制的研究。近年来，主持山东省优青项目，国家自然科学基金面上项目，山东省重点研发项目，山东省自然科学基金重大基础子课题等项目，以第一或通讯作者在Molecular Microbiology, The ISME Journal, Applied and Environmental Microbiology, Carbohydrate Polymers, Critical Reviews in Biotechnology等权威杂志发表SCI论文30余篇，授权发明专利6项，以主要完成人获得山东省自然科学二等奖，并获青岛市青年科技奖。
06 Green Carbon
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