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周雍进研究员与Green Carbon │ 高性能甲醇酵母细胞工厂构建

已有 596 次阅读 2025-8-12 18:15 |个人分类:合成生物技术与绿色生物制造|系统分类:科研笔记

2024年4月19日-21日，第一届Green Carbon青年编委会生物方向研讨会暨“合成生物技术与绿色生物制造——高版本底盘工程”学术沙龙在青岛召开。中国科学院大连化学物理研究所周雍进研究员应邀出席并作题为“高性能甲醇酵母细胞工厂构建”的邀请报告。

高性能甲醇酵母细胞工厂构建

背景介绍

一碳资源（CO₂、甲烷、甲醇和甲酸等）作为生物炼制原料日益受到关注。其中，甲醇可由太阳能等可再生能源驱动CO₂还原大量制备，能量密度高、易运输、发酵过程中液-液传质效率高，有望成为重要的生物炼制原料。然而，甲醇代谢速度慢、调控机制不清晰且有一定生物毒性，制约了其生物转化效率。周雍进研究员结合课题组科研工作，介绍了利用合成生物学策略构建高性能甲醇酵母微生物细胞工厂合成化学品的研究进展。特别是介绍甲醇遗传操作平台构建、酵母甲醇代谢及耐受强化，实现甲醇高效生物转化合成脂肪酸衍生物等高值化学品方面的探索。

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周雍进研究员在“合成生物技术与绿色生物制造——高版本底盘工程”学术沙龙上作邀请报告

报告内容

微生物细胞工厂的甲醇生物转化

碳中和与低碳生物制造是指通过生物技术实现的工业生产过程，它使用可再生原料和生物催化剂，在温和条件下进行，旨在最大限度地减少能源消耗和温室气体排放，进而促进实现整个社会经济系统的CO₂净排放量降至零的目标。但除了光合作用外，高度氧化且无能量的CO₂直接利用非常困难，因此必须对其进行赋能，自然界的赋能是光合作用，受耕地及水资源限制，效果有限，但在化学中进行赋能，可生产各种赋能产物，如甲酸、甲醇、乙酸、乙醇等。

周雍进研究员团队选择的是甲醇作为转化前体，选择甲醇的原因是甲醇是目前化工领域的重要原料，能和化工中甲醇的储存、运输很好的耦合，另外甲醇和水是无限互溶，作为生物制造的原料在前期的液-液传质效率高。以甲醇作为原料可生物合成多种含氧多碳化学品。目前以甲醇为碳源已有较多的研究，宿主细胞包括大肠杆菌、酿酒酵母等，其中大肠杆菌对甲醇的利用效率低，难以产业化，因此周雍进研究员团队选择了天然利用甲醇的微生物-多形汉逊酵母（Ogataea polymorpha）为宿主细胞，多形汉逊酵母是一种用于蛋白质表达的非模式工业酵母，具有许多优点，例如耐热性（>50 ℃）、底物谱广和发酵密度高等。

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多形汉逊酵母利用甲醇的挑战

2009年研究人员使用多形汉逊酵母实现了乙醇的生产；2013年实现了全基因组测序；2018年建立了CRISPR的基因编辑方法，但精准编辑效率低。关于多形汉逊酵母的研究进展非常缓慢，最大的制约因素是缺乏高效，精准的基因操作工具，如果不能改造就很难实现理性设计，使多形汉逊酵母的细胞工厂难以构建。以多形汉逊酵母为宿主菌，目前存在3个挑战，一是缺乏基因编辑工具；二是甲醇毒性；三是甲醇转化效率不足。

首先关于缺乏基因编辑工具的挑战，CRISPR只是实现了基因的剪切，基因的敲除和外源基因的加入位置存在偶然性，因此周雍进研究员团队使用同源重组基因编辑手段进行改造。

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其次关于甲醇毒性的挑战，以甲醇合成脂肪酸为例，合成脂肪酸只需要敲除FAA1基因，以葡萄糖为碳源，菌生长OD₆₀₀ = 11.6，脂肪酸产量约1 g/L，但以甲醇为碳源，细胞不能生长，说明甲醇代谢与糖代谢具有显著差异，推测可能是甲醇毒性原因，随后对该菌株进行改造。在糖异生代谢中，Xu5P是甲醇代谢中的关键代谢前体，因此提高Xu5P的供应可能提高菌的生长状态，但OD₆₀₀仅仅从0.05增加至0.15，改造中心代谢PPP循环强化前体供给并不能恢复高产脂肪酸酵母细胞在甲醇中生长。因此，尝试了定向进化方法，通过一步步降低葡萄糖的含量，进过3个月的进化，筛选出一批可以以甲醇为唯一碳源生长的菌株，OD₆₀₀ = 9.9，脂肪酸产量约400 mg/L。定向进化实现了细胞在甲醇中的“起死回生”，其机制是什么呢?周雍进研究员团队对多形汉逊酵母进行了第三代测序，发现LPL1（酯酶基因）与IZH3（锌代谢膜蛋白基因）失活突变是脂肪酸高产细胞起死回生的关键，LPL1与IZH3缺失突变还能显著提高野生型细胞对甲醇的耐受性，具有工业化意义。

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进一步发现死亡的细胞中磷脂含量比较低，而甲醛含量比较高，野生型和驯化的细胞磷脂含量比较高，而甲醛含量比较低，研究发现甲醇的代谢都在过氧化物酶体膜中完成，合成大量脂肪酸时竞争了磷脂合成，影响过氧化物酶体膜组装，造成甲醛泄露，影响甲醇代谢，带来细胞坏死。为了避免甲醛的积累，研究人员设想是否能让甲醛快速代谢，来提高甲醇的转化效率，因此过表达了DAS1/2基因，结果发酵菌株OD₆₀₀约16，脂肪酸含量约200 mg/L，为了进一步提高脂肪酸产量，研究人员通过转录组学分析指导甲醇代谢改造，强化了PPP、糖异生途径，实现了甲醇为唯一碳源合成脂肪酸的高效转化，摇瓶补料脂肪酸8 g/L，发酵罐补料发酵脂肪酸16 g/L，前期批式过程甲醇为碳源效果最好，证明了工程菌株的鲁棒性。

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甲醇生物转化制备脂肪醇

获得了以甲醇为唯一碳源的底盘细胞后，研究人员尝试以甲醇生物转化制备脂肪醇。脂肪醇是脂肪酸下游的还原产物，但导入ScADH5基因后，该菌在甲醇中生长缓慢，因此将该途径整合到过氧化物酶体中，使得甲醛的转化与产物的合成进行耦连，脂肪醇的产量提升了3.9倍，随后增强了前体供给、甲醇耐受以及还原力供给，生产和生长趋于协调，但甲醇代谢中间产物甲醛（生物毒性）积累依然较高，进一步过表达了DAS1/2基因，降低甲醛积累，缓解甲醇代谢生物毒性拉动甲醇转化，提升脂肪醇生产，补料分批发酵下以甲醇为单一碳源生产了3.6 g/L脂肪醇，是甲醇制备脂肪醇的最高产量。

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专家介绍

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周雍进研究员

周雍进，博士，研究员，博士生导师，研究组组长，张大煜优秀学者，国家自然科学基金委优秀青年基金项目获得者（2019）、国家引进人才青年项目入选者（2018）、中国科学院引进人才（2017）、Green Carbon青年编委。曾于江南大学获得食品科学与工程学士学位（2006）；天津大学获得生物化工硕士学位（2008）；大连化学物理研究所获得生物化工博士学位（2012）；2012-2016年在瑞典查尔姆斯理工大学从事博士后研究。2017年1月回到中国科学院大连化物所组建合成生物学与生物催化课题创新特区研究组，受聘为课题组长，研究组于2022年1月进入正式研究组序列，更名为“合成微生物学研究组”。曾在Cell、Nature Energy、Nature Metabolism、Nature Chemical Biology、Nature Communications、JACS、PNAS等期刊发表论文100余篇，被引用6300余次。曾获得2015年度中国药学会科学技术奖一等奖，2016年国际代谢科学会议青年科学家奖，2018年‘伦世仪’基金会杰出青年学者奖，2019年全国生物技术创新大会“最具发展潜力奖”。目前担任Biotechnology Journal主编，Synthetic and Systems Biotechnology，BioDesign Research副主编，FEMS Yeast Research等多个学术期刊编委。