利用AI设计眼镜蛇蛇毒结合蛋白( I)

    对于蛇毒中毒的治疗主要依赖抗蛇毒血清，其生产成本高，不耐热，需要冷链运输，这并不利于经常发生在野外毒蛇咬伤个体的抢救。

David Baker 实验室尝试利用AI设计可结合蛇毒的蛋白。与传统生产的免疫血清相比，具有结合亲和性强，热稳定性好易于储存和运输，组织穿透能力强并可大大降低生产成本，质控好等优势。

  虽然眼镜蛇有不同种类，但其致病机理大致分为两种：神经毒和细胞毒。

图 1 蛇神经毒构象及致病机制

A, 来自电鳐的烟碱型肌肉乙酰胆碱受体构象（浅蓝与乙酰胆碱结合位置（粉色）。

B, 正常情况下，乙酰胆碱受体的一些芳香族氨基酸残基形成一个“笼子”,把乙酰胆碱装入“笼子”中。

C，Alpha-cobratoxin(眼镜蛇蛇毒)破坏了“笼子”,使得乙酰胆碱不能与之结合。

D,来自电鳐的烟碱型肌肉乙酰胆碱受体结合乙酰胆碱的构象被alpha 短链神经毒（short-chain alpha-neurotoxins, ScNtx）破坏。(Susana Vázquez Torres 2025)

神经毒的大致构象如同三个指头，称为三指状构象。

图2 Alpha 神经毒（alpha-Neuritoxins）属于三指状蛇毒（Three finger toxins ,3FTx）的一个亚型，由多个Betta 片层结构和从疏水核突出的三个loops形成，其结构由高度保守的二硫键桥接形成稳定结构，图中保守的半胱氨酸以小棒状表示，三个指状结构分别以I ，II,III表示。(Susana Vázquez Torres 2025)

1，针对神经毒性蛋白的设计。    

  A，针对短链一致性alpha 神经毒设计结合蛋白

眼镜蛇有不同的种类，究竟选择一类型呢？已经有人对不同种类的眼镜蛇神经毒的DNA序列进行比对找出一致性，这些具有一致性特征的肽段称之为短链一致性alpha 神经毒（short-chain  consensus alpha-neurotoxin ,ScNtx）(图1 D)。

    David Baker 将ScNtx作为设计模板进行设计，直接从蛋白立体构象方面设计而非结合位点从而达到从功能上中和的目的。

     大体上，整个过程先采用基于扩散模型生成的RFdiffusion 算法，这种算法适合于3指状构象中Betta-片层结合蛋白的设计，当初步产生扩展Betta-片层与结合蛋白的骨架（backbone)后，再用Protein MPNN产生出序列，产生的设计用AlphaFold(AF2)初步推测（initial guess )和Rosetta 的指标（metrics） 做筛选,最佳的候选设计进行体外试验。

    具体是先将初步设计得到的44个候选基因片段克隆表达，采用酵母表面展示技术筛选，可以找出其中一个候选序列，其结合ScNtx 的解离常数（disso-ciation constant （K_d) 为842nM，这个数据并非令人满意，需再将此候选蛋白进行优化。

    优化采用该实验室2024年报道的针对alpha-螺旋设计结合蛋白的方法进行。      

     用partial diffusion 优化后，由这个候选蛋白衍生出的78个选中的设计中有11个设计与ScNtx 结合的亲和力高于最初选中设计，这11个设计中其中一个结合亲和力Kd=0.9nM，该设计蛋白称为SHRT。

图3 SHRT与靶蛋白结合复合物局部图，左图，ScNtx中Cyc41与SHRT中Tyr45之间形成局部的氢键。中图，SHRT设计模型（灰色）的结晶构象。右图：ScNtx（蓝）与SHRT之间形成的氢键。(Susana Vázquez Torres 2025)

     B 针对长链 alpha 神经毒 （long-chain alpha neurotoxin，如图1C所示) 的结合蛋白设计

     选择由Naja Kaouthia 得来的alpha-眼镜蛇毒（alpha-cobratoxin，P01391)进行结合蛋白设计：先用RFdiffusion 设计，得到42个设计结果，其中的一个候选蛋白结合亲和力为1.3uM（采用BLI方法）,再采用partial diffusion 算法优化该候选蛋白，先产生出38个设计，其中一个设计的最高亲和力蛋白称之为LNG，Kd达到1.9nM，（SPR法）,热稳定性Tm>95V,其与alpha –cobratoxin结合复合物的X线结晶分析已经完成。

图4 针对长链alpha神经毒结合蛋白LNG与alpha cobratoxin 复合物通过结晶实际检测的结果，左，alpha-cobratoxin 的loopII中Agr33与LNG中Glu69,Tyr40,Try49之间形成的氢键。中图 LNG与alpha-cobratoxin结合的总体观。右图，alpha-cobratoxin 的Betta链和LNG之间的氢键。(Susana Vázquez Torres 2025)

2 ，针对细胞毒设计结合蛋白

    蛇毒除神经毒外（即阻断乙酰胆碱与其受体结合）,还可以破坏脂质双层膜，包括细胞膜。细胞毒的构象也属于3指状构象。

图5 细胞毒破坏脂质双层结构机制模式图

图中可见Betta链与loops一起参与脂质双层膜的破坏。(Susana Vázquez Torres 2025)

     为了让设计出的结合蛋白中和能力更加广谱，所用的把序列为86种蛇的细胞毒，（type IA  cytotoxin sub-subfamily)细胞毒亚族群 ） 先用ProteinMPNN和alphafold2 进行筛选，然后再用patial diffusion进行结构优化，选出55种设计，将其重组后在大肠杆菌中培养，用SEC纯化，选18个单体进行细胞存活分析，其中有一个蛋白有较强的溶解率。称之为CYTX。CYTX对Naja Pallida和Naja nigricollis 来源的蛇毒有高度的中和能力。用SPR测定，对于来源于N. pallida细胞毒Kd值为271nM。Tm值为61C，显示了热稳定性。

作者还对CYTX与N.pallida 细胞毒复合物进行结晶以获得真实构象。 但这种复合物的构象呈现动态变化，不易做出结晶。于是作者加了一些二硫键，将Tm值提高至70.3C。此时针对N.pallida细胞毒的Kd值增加：740nM。由于从CYTX得来，作者将其命名为 CYTX_B10。

图6 CYTX_B10蛋白与Naja pallida细胞毒复合物的结晶结构，左图，结合蛋白CYTX_B10(米黄色)与Naja pallida 细胞毒之间的静电反应状态。中图，CYTX_B10与Naja pallida细胞毒复合物的结晶。右图，来自细胞毒（粉红色）Lys18与来自CYTX_B10（米黄色）的Asp57之间形成盐桥键。(Susana Vázquez Torres 2025)

至此，David baker 用AI设计出四条蛇毒结合蛋白肽链，其长度在100个氨基酸残基上下。具体序列如下：

最后，作者进行了细胞水平和小鼠的体内实验，下图为小鼠体内实验。

图 7 SHRT和LNG 的小鼠生存试验 (Susana Vázquez Torres 2025)

(未完待续）