在蛋白功能研究中，亲和力测定是揭示分子互作机制的关键环节。然而，传统方法通常依赖高纯度蛋白，而许多蛋白如膜蛋白、低溶解度蛋白等的研究就受到了限制。微量热泳动技术 (MST) 以其高灵敏度、低样本需求和对粗样品的兼容性，不仅可以检测重组蛋白，还为难纯化蛋白的亲和力测定提供了突破性的解决方案。
Section.01
微量热泳动 (MST)
微量热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）是一种通过监测温度梯度场中生物分子的迁移行为来研究分子互作的技术。该技术利用荧光标记，精确捕捉分子在热泳动效应下的运动变化，从而实现对结合亲和力的高灵敏度定量分析。
MST 技术通过红外激光在样品溶液中建立局部温度场实现分子相互作用分析。实验时，将一个分子（如蛋白）用荧光染料标记或融合 GFP 标签，与待测分子按浓度梯度置于毛细管中。当激光聚焦加热时，会在照射区域形成温度梯度分布，分子由高温区域向低温区域定向迁移，其迁移的程度与质量、带电性及分子间相互作用密切相关，通过检测荧光标记的分子或天然荧光分子的荧光信号，可以获得分子间结合的亲和力常数 Kd。
图 1. MST 技术示意图。
Section.02
方案一: 直接检测重组蛋白
实验流程
案例一
2024 年，研究人员在 Cell 上发表了题为 "A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism" 的研究论文，揭示了 Cholesin（肠抑脂素）通过与 GPR146 蛋白结合，可抑制肝脏中的 PKA-ERK1/2 信号传导，从而控制胆固醇的合成，最终降低循环胆固醇水平[1]。
图 2. MST 检测 Cholesin 和 GPR146 (WT or Mut) 蛋白的亲和力[1]。
本研究中，作者使用 MST 技术定量测定了 Cholesin 与 GPR146（WT）蛋白的亲和力，测得平衡解离常数 Kd 值为 21.34 ± 0.98 nM，表明两者具有很高的亲和力。
为了确定关键结合位点，作者基于 AlphaFold 预测的 GPR146 蛋白结构，构建了多个突变体，并通过 MST 检测 GPR146（Mut）蛋白与 Cholesin 的亲和力。结果显示，突变体蛋白测定的 Kd 值显著降低，为 971.0 ± 91.5 nM，证实了突变氨基酸对二者结合的重要性，为胆固醇代谢调控机制提供了分子层面的证据。
Section.03
方案二: 使用细胞裂解液检测
实验流程
案例一
2024 年，研究人员在 Nature 上发表了题为 "Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury" 的研究论文，揭示了谷氨酸不仅通过 N-甲基-D-天冬氨酸受体 (NMDAR) 激活细胞死亡通路，还可通过增强酸敏感离子通道(ASICs) 的电流，加剧缺血性脑损伤，为开发更有效的中风治疗药物提供了新的靶点[2]。
图 3. 不同 pH 条件下，谷氨酸和 ASIC1a 的 MST 检测结果[2]。
作者构建了 ASIC1a（酸敏感离子通道 1a 亚型）与 GFP（绿色荧光蛋白）的融合质粒，并将其转染至 HEK293T 细胞中。随后，细胞被裂解，离心后取上清液，直接使用细胞裂解液进行 MST 实验。实验证明，在 pH 6.8 和 pH 7.0 的条件下，谷氨酸与 hASIC1a-GFP 结合，测得的亲和力（Kd）分别为 113.3 μM 和 392.5 μM，表明谷氨酸在较低的 pH 下结合更强。
案例二2023 年，研究人员在 Cell Chem Biol 上发表了题为 "Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2" 的研究论文，报道了一种具有抗肿瘤活性的倍半萜内酯二聚体 ainsliadimer A (AIN)，其通过直接靶向 PRDX1 和 PRDX2 蛋白，抑制它们的过氧化物酶活性，进而抑制结直肠癌细胞增殖并诱导凋亡，同时抑制小鼠肿瘤生长和肿瘤类器官模型生长[3]。
图 4. AIN 与 PRDX1、PRDX2 重组蛋白的 MST 检测结果[3]。
作者首先通过 MST 检测发现，AIN 与重组蛋白 PRDX1 和 PRDX2 均能结合，Kd 值分别为 1.66 μM 和 9.35 μM。随后，为了确定 AIN 分别与 2 个蛋白的结合位点，作者利用细胞裂解液检测了野生型与突变型 PRDX1/2-GFP 与 AIN 的结合。结果表明，PRDX1 的 Cys173 和 PRDX2 的 Cys172 是 AIN 的关键结合位点，突变这两个位点后，AIN与 PRDX1 和 PRDX2 蛋白均不结合。
图 5. AIN 与 PRDX1-GFP、PRDX2-GFP 的 MST 检测结果[3]。
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微量热泳动 (MicroScale Thermophoresis, MST) 是一种定量分析生物分子间相互作用的技术。 |
[1] Hu X.L, et al. A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism. Cell. 2024 Mar 28;187(7):1685-1700.e18.
[2] Lai K, et al. Glutamate acts on acid-sensing ion channels to worsen ischaemic brain injury. Nature. 2024 Jul;631(8022):826-834.
[3] Lv C, et al. Ainsliadimer A induces ROS-mediated apoptosis in colorectal cancer cells via directly targeting peroxiredoxin 1 and 2. Cell Chem Biol. 2023 Mar 16;30(3):295-307.e5.
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