背景介绍

       棕色脂肪组织长期以来被认为是一种依赖解偶联蛋白1( UCP1)介导产热的代谢器官。经典模型认为，UCP1介导的产热能够增加全身能量消耗，从而降低体重并增强葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。然而，越来越多的证据表明，BAT的代谢保护作用并不完全依赖于体重下降或能量消耗增加。例如，BAT的支链氨基酸分解代谢受损时，即使其产热功能仍然保持，也可能诱发肝脏氧化应激和全身性胰岛素抵抗；与此同时，大规模人群研究也发现，BAT活性较高与较低的2型糖尿病、血脂异常及心血管疾病患病率相关，且这种关联并不依赖于体重指数(BMI)。

此外，BAT还可释放肽类，微小RNA，代谢物和脂质，这些分子统称为棕色脂肪因子，并通过内分泌，旁分泌或自分泌方式介导BAT与其他组织器官之间的代谢通讯。已报道的例子包括成纤维细胞生长因子21(FGF21)，12,13-二羟基-9Z-十八碳烯酸(12,13-DiHOME)等，这些分子并非BAT特异性产生，其他组织同样能够合成和释放，因此难以作为反映BAT活性的特异性循环指标。目前18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)正电子发射断层显像/计算机断层扫描(PET/CT)仍是评估人体BAT活性的经典方法，但其成本高、存在辐射暴露且对设备和检测条件要求较高，因而难以实现大规模应用。因此，BAT究竟如何通过循环代谢物影响远端器官，以及能否鉴定出能够反映BAT活性的循环生物标志物，仍是该领域亟待解决的重要问题。

基于上述背景，美国哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗中心Shingo Kajimura团队联合日本东北大学医学院Takeshi Yoneshiro团队在Cell Metabolism发表研究论文“Brown fat protects against hepatic oxidative stress by remodeling the circulating metabolome”。该研究采用“循环优先”策略，结合BAT缺失小鼠模型、不同BAT活性的人体队列，以及多组织、组织细胞外液和脂肪细胞条件培养基的代谢组学与脂质组学分析，系统解析了BAT活性相关的循环代谢物谱，并进一步鉴定出一种寒冷诱导的BAT来源脂质，即3-羟基硬脂酸(3-hydroxystearic acid，3-OHSA)。研究发现，3-OHSA能够作用于肝脏线粒体，降低线粒体膜电位及活性氧(ROS)生成，从而减轻肝脏氧化应激。

图1  BAT对体内循环代谢组和脂质组的影响

图S1  BAT对体内循环代谢组和脂质组的影响(对应图1)

2、多层级来源追踪锁定BAT相关循环脂质

         为追溯这些BAT关联分子的组织来源，研究人员进一步比较12种小鼠组织中的BAT关联代谢物和脂质，并检测离体培养肩胛间BAT外植体的条件培养基，BAT与eWAT的细胞外液(EFs)，以及分化后人棕色和白色脂肪细胞的条件培养基。多数BAT关联代谢物并非由BAT特异产生。例如，BAT在寒冷条件下主动摄取BCAAs，几乎不向循环系统释放BCAAs，提示BAT更可能是BCAAs的重要代谢和清除组织，而非其主要分泌来源。同样，GSH虽与BAT的BCAA分解代谢有关，但循环GSH的主要来源仍然是肝脏(图S2A)。

         与代谢物不同，多种BAT相关脂质在BAT组织中表现出明显的富集特征，尤其是OHFAs，溶血磷脂酰胆碱(LPCs)，TGs，磷脂酰乙醇胺(PEs)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPEs)。具体而言，不同组织即使富集相同类别的脂质，其脂肪酸碳链组成也存在明显差异：心脏以C8:0和C10:0等中链OHFAs为主，而BAT特异富集C18长链OHFAs；肠道富集饱和LPEs，BAT则富集C18:2，C22:5和C22:6等高度不饱和LPEs(图2B、图2C、图S2B和图S2C)。

         组织分布特征进一步得到了离体培养实验的支持。在离体培养体系中，BAT外植体能够大量释放OHFA 18:0、10:0和12:0，同时主动摄取培养基中的多种TGs (图2D)。eWAT来源EFs以TGs为主，BAT来源EFs则富含磷脂，其中OHFA 16:0、18:0和18:1水平均显著高于eWAT来源EFs (图2E)。此外，在人源脂肪细胞模型中，分化后的棕色脂肪细胞相较于白色脂肪细胞能够主动释放多种PCs、LPEs以及OHFA 18:0和18:1(图2F)。这一结果进一步提示，OHFAs并非仅仅是在BAT组织中被动富集，而可能是BAT主动产生并释放至细胞外环境的脂质分子。

图2  BAT响应性循环脂质的组织来源

图S2  BAT响应性循环代谢物和脂质的组织来源(对应图2)

图3  小鼠与人体BAT关联脂质的跨物种整合

图S3  小鼠与人体BAT关联脂质的跨物种整合(对应图3)

4、寒冷诱导BAT产生并释放3-OHSA

         为进一步确定OHFA 18:0这一候选脂质的化学身份，研究人员将其色谱保留时间和串联质谱谱图与2-、3-、9-和12-羟基硬脂酸标准品比较(小编注：保留时间反映了该化合物与色谱固定相之间的相互作用特征。由于羟基位点不同会改变分子的极性和色谱行为，因此比较候选脂质与不同羟基硬脂酸标准品的保留时间，并结合 MS/MS 碎片谱，可以帮助确定其具体结构)。比较结果显示，样本中OHFA 18:0与3-羟基硬脂酸(3-OHSA)标准品在保留时间和质谱特征上均完全匹配；其他脂质组学检出的OHFAs也均具有3-OHFAs所特有的诊断性MS/MS碎片特征(图4A、图S4A和图S4B)。因此，OHFA 18:0可明确鉴定为3-OHSA（小编注：文章通过两方面进行定位：首先通过保留时间（RT）与3-OHSA标准品完全一致，支持其与3-OHSA是同一化合物。其次通过MS/MS诊断性碎片，通过特征碎片的质量数及裂解方式判断羟基所在位置，确认属于3-OHFA。因此，这里的结论是进一步完成了羟基位置异构体的结构鉴定：OHFA 18:0， 3-hydroxystearic acid（3-OHSA）。这里确定为C3位。）。

         3-OHFAs可在活跃的线粒体脂肪酸氧化(FAO)过程中产生。在此代谢背景下，作者提出，寒冷使硬脂酸进入线粒体基质并经历β-氧化；随着FAO通量增加，L-3-羟基脂酰辅酶A脱氢反应可能受到局部NAD+/NADH或CoA供给的限制，从而造成L-3-羟基硬脂酰辅酶A的暂时性积累。该中间体可经线粒体酰基辅酶A硫酯酶(Mitochondrial acyl-CoA thioesterase,  ACOT)释放为游离3-OHSA，或转酯化为3-羟基酰基肉碱后输出(图4B)。与这一猜想一致的是，FAO四步反应相关酶的mRNA在BAT中的表达高于另外9种组织(图S4C)。

         随后，研究人员对12种组织进行定量，发现BAT含有最高水平的3-OHFAs，且这一差异在寒冷暴露后更加明显。具体而言，室温下，3-OHSA是BAT中含量第二高的3-OHFA，仅次于3-OHFA 18:1；寒冷使其显著升高，热中性适应则使其下降(图4C)。BAT中3-OHSA的绝对浓度约为其他受检代谢组织的20倍，同时该物质还表现出最明显的温度依赖性变化(图4D)。此外，去甲肾上腺素(NE)可显著促进分化后小鼠和人棕色脂肪细胞向条件培养基释放3-OHSA，支持寒冷通过肾上腺素能信号诱导其产生(图4E)。

         相应地，在自由进食小鼠中，寒冷暴露3d后，3-OHSA成为循环中含量最高的3-OHFA之一，其血清浓度约为0.5 μM (图4F、图4G)。进一步来看，多个独立队列均显示，寒冷暴露至少3h即可使血清3-OHSA水平升高，而这一升高在BAT−小鼠中明显减弱；转入热中性环境3d后其水平下降，1周后回到基础值，此时BAT+和BAT-小鼠之间不再存在差异(图4H、图S4E)。需要注意的是，3-OHSA在血清冻融后不稳定，冻结样本的绝对浓度低于新鲜样本。

         在人群队列中，绝对定量分析进一步验证了这一BAT依赖性的寒冷响应，而低BAT活性组未出现明显的诱导变化；温暖条件下两组基础浓度无显著差异(图4I)。因此，3-OHSA更适合作为寒冷激活BAT的动态循环读出，而非在温暖或热中性条件下区分BAT活性高低的基础标志物。

图4  3-OHSA是寒冷诱导并由BAT释放入循环的脂质

图S4  3-OHSA是寒冷诱导并由BAT释放入循环的脂质(对应图4)

5、3-OHSA以结构依赖方式降低肝线粒体ROS生成

         BAT-小鼠在室温和寒冷条件下均出现更高水平的肝脏氧化应激，具体表现为脂质过氧化指标丙二醛(MDA)和蛋白氧化指标蛋白羰基(PC)含量升高(图5A)。鉴于这一体内表型，研究人员进一步在分离的肝脏线粒体中直接评估3-OHSA的作用，发现其可显著降低H₂O₂生成速率，其抑制幅度与化学解偶联剂FCCP相当(图5B)。研究人员进一步进行剂量-反应分析后发现，3-OHSA对H₂O₂生成的抑制作用呈明显剂量依赖性，半数有效浓度(EC50)为0.51 µM，处于寒冷条件下的生理循环浓度范围(图5C)。

         研究人员进一步比较后发现，3-OHSA对不同代谢组织来源线粒体的作用并不相同。0.5 µM 3-OHSA可以显著降低肝脏和肾脏线粒体H₂O₂生成，但在骨骼肌中的作用较弱，对BAT线粒体则无显著影响(图5D、图5E)。这种差异不是由线粒体含量改变造成(图S5A)。此外，3-OHSA也可提高线粒体呼吸，但其促进呼吸的EC50约为5.5 µM，明显高于其抑制H₂O₂生成所需的浓度(图S5B-D)。因此，超生理浓度3-OHSA可能像其他脂肪酸一样促进呼吸，而其生理浓度下的主要作用更可能是降低线粒体ROS生成。

         在结构层面，研究人员比较了不同脂肪酸在0.5 μM浓度下对肝线粒体H₂O₂生成的影响。结果显示，3-OHSA的抑制作用明显强于未羟基化的硬脂酸、棕榈酸和油酸(图5G)。进一步分析发现，脂肪酸碳链长度与其降低H₂O₂生成的能力呈正相关，作用强度依次为3-OHFA 18:0 > 3-OHFA 16:0 > 3-OHFA 14:0 > 3-OHFA 12:0(图5H)。与此同时，羟基所在的位置同样决定了其作用强度。在相同浓度下，3-OHSA降低肝线粒体H₂O₂生成的能力明显强于2-OHSA、9-OHSA和12-OHSA(图5I)。也就是说，并非所有羟基化脂肪酸都具有相同的线粒体抗氧化效应，羟基的存在本身以及其具体位置都会影响这一作用。

图5  3-OHSA降低肝脏线粒体ROS生成

图S5  3-羟基硬脂酸导致肝脏线粒体效率降低(对应图5)

6、3-OHSA部分通过ANT2降低肝线粒体膜电位和氧化应激

         鉴于线粒体ROS的过度生成通常与较高的线粒体膜电位(ΔΨm)相关（小编注：这句话的核心依据是线粒体电子传递链在高膜电位状态下更容易产生电子泄漏并形成ROS。正常情况下，呼吸链复合体I和III在传递电子的同时将H⁺泵出线粒体基质，建立跨内膜的质子电化学梯度(Δp)，其中ΔΨm是主要组成部分。当ΔΨm过度升高时，质子回流受到抑制，电子传递链处于较高还原压力，电子更容易从复合体I、III等部位“泄漏”给O2，形成超氧阴离子(O2⁻)，进一步产生H2O2等ROS。因此，适度降低过高的ΔΨm（如通过质子泄漏/轻度解偶联）反而能够缓解线粒体ROS生成。这也是该研究考察3-OHSA降低ΔΨm是否伴随H2O2生成下降的理论基础。参考文献：Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2020;21:363–383.  Use the protonmotive force: mitochondrial uncoupling and reactive oxygen species.Journal of Molecular Biology. 2018;430:3873-3891.），研究人员进一步考察了3-OHSA对肝ΔΨm的影响。在苹果酸，谷氨酸，丙酮酸和琥珀酸存在时，3-OHSA降低肝ΔΨm的极化速率，作用幅度与FCCP相当，EC50为0.57 µM(图6A、图6B)（小编注：测量ΔΨm主要是在分离的小鼠肝线粒体中，利用 Safranine O (番红O)荧光法动态检测ΔΨm的极化速率。番红 O 是亲脂阳离子探针，线粒体膜电位越高，探针越容易进入线粒体基质并发生荧光淬灭，荧光强度下降越快，以此反映膜电位极化速率。研究人员在反应体系中同时加入苹果酸、谷氨酸、丙酮酸或琥珀酸等呼吸底物和5 μM的番红O，使肝线粒体维持氧化磷酸化并形成ΔΨm。随后逐渐增加3-OHSA浓度，同时实时监测ΔΨm的变化，得到3-OHSA对膜电位的抑制曲线。图 6A 显示，3-OHSA 可明显降低 ΔΨm 的极化速率，其作用幅度与 FCCP 相近。图 6B 进一步加入不同浓度的 3-OHSA，由剂量-反应曲线计算出3-OHSA的EC50≈0.57 μM，说明其在亚微摩尔浓度即可明显影响线粒体膜电位。图6C则是在相同 0.5 μM 浓度下比较 3-OHSA 与其他脂质对ΔΨm极化速率的影响。）。相应地，这一剂量-反应关系也与其降低H₂O₂生成的效应相符。研究人员进一步比较后发现，在相同的0.5 µM浓度下，3-OHSA降低ΔΨm极化速率的作用明显强于未羟基化脂肪酸、短链3-OHFAs以及2-OHSA (图6C)。此外，较高剂量的3-OHSA还可增加状态4呼吸，降低ATP合成速率和P/O比值(图S6A)（小编注：这里并不是常规 Seahorse 曲线。论文使用分离的肝线粒体，并通过 Oroboros O2k 等方法分析线粒体呼吸。经典意义上的 State 4 respiration 是在线粒体有充足呼吸底物、但缺乏 ADP 或 ADP 已耗尽时的非磷酸化呼吸；因此 Figure S6A 中 ADP=0 的起始点可以反映 State 4，而随着 ADP 浓度增加，线粒体逐渐进入 ADP 驱动的 State 3 呼吸。作者之所以采用 ADP 浓度作为横坐标，是为了观察从非磷酸化状态到活跃氧化磷酸化状态过程中线粒体呼吸和能量转换效率的变化。左图显示氧耗随 ADP 的变化，其中 3-OHSA 提高了 ADP 缺乏时的 State 4 respiration，提示质子泄漏增加；中图显示 ATP 合成速率，3-OHSA 降低 ATP 生成；右图为 P/O 比值，即 ATP 生成相对于氧消耗的效率，3-OHSA使其下降。综合结果说明 3-OHSA 具有解偶联效应：线粒体氧气消耗增加，但 ATP 合成效率下降，质子发生渗漏，这和前文 3-OHSA 降低线粒体膜电位、减少 ROS 生成的结论相互印证。）。

         为验证3-OHSA的体内作用，研究人员向高脂饮食诱导的肥胖小鼠腹腔注射牛血清白蛋白(BSA)偶联的3-OHSA，剂量为8mg/kg/d，连续2周，并以BSA偶联硬脂酸或未偶联BSA作为对照（小编注：3-OHSA 属于脂肪酸类小分子，在水溶液中水溶性较差，直接进行腹腔注射极易发生聚集沉淀，难以在体内稳定递送；同时游离脂肪酸进入循环后，天然就会与血液里的白蛋白结合。将 3-OHSA 与 BSA预先偶联，一方面可以提升3-OHSA 水溶性，避免给药后析出，保证腹腔注射能够顺利吸收入血；另一方面可以模拟生理状态下脂肪酸与白蛋白结合的存在形式，让给药后 3-OHSA 在体内的分布、转运方式更贴近生理情况，减少游离脂肪酸本身带来的非特异性毒性与干扰）。处理后循环3-OHSA达到0.43±0.04 µM，与寒冷暴露后观察到的生理浓度相当；肝脏3-OHSA约升高3倍，但仍处于生理范围内(图6D、图6E)。3-OHSA处理未改变体重，脂肪量，瘦体重或组织重量(图6F、图S6B-E)，但显著降低肝脏MDA和蛋白羰基，相同剂量的硬脂酸并未产生类似的抗氧化作用(图6G、图6H)。

         研究人员以室温下BAT+小鼠为各实验基线进行归一化后发现，寒冷使BAT+小鼠肝脏MDA降低24%，而室温下BAT消融使其升高83%，且BAT消融显著削弱寒冷的保护效应。与寒冷暴露类似，3-OHSA处理使肝脏氧化应激降低28%，其效应幅度与寒冷诱导的保护作用相近(图6I)（小编注：图 6I 是以室温条件下 BAT+小鼠作为基线，将前面实验所得到的各组肝脏氧化应激数据进行归一化，从而在同一标尺下横向比较寒冷暴露、BAT 消融和 3OHSA 给药的影响。实验设置室温 BAT+（基线）、寒冷暴露 BAT+、室温 BAT 消融、寒冷暴露 BAT 消融等组别，并额外设置室温 BAT+且3-OHSA 给药组，以肝脏 MDA等指标综合表征氧化应激水平，该图的核心逻辑是通过归一化对比，把 3-OHSA 的体内抗氧化作用与生理性寒冷激活 BAT 所产生的肝脏保护效应放在同一标尺下，提示 3-OHSA 可能介导了寒冷BAT 下游的肝脏抗氧化信号）。总体而言，这些结果将3-OHSA在分离线粒体中的作用与肥胖小鼠体内肝脏氧化应激改善联系起来，同时表明该效应不依赖体重或脂肪量的变化。

         为进一步解析其作用机制，研究人员比较了腺嘌呤核苷酸转位酶(ANT)和线粒体通透性转换孔(mPTP)两条可能通路。结果显示，ANT抑制剂羧基苍术苷(CATR)能够逆转3-OHSA对ΔΨm极化速率的抑制作用，低剂量CATR也以剂量依赖方式阻断3-OHSA降低H₂O₂的作用；另一种ANT抑制剂米酵菌酸(BA)产生部分逆转，而mPTP抑制剂环孢素A(CsA)无此作用(图6J-L、图S6G-J)。此外，研究人员在原代肝细胞中使用siRNA急性敲低肝脏和肾脏高表达的腺嘌呤核苷酸转位酶2(ANT2)，这一操作也可部分但显著削弱3-OHSA对ΔΨm的作用(图S6K、图S6L)。因此，3-OHSA至少部分通过ANT2降低肝线粒体膜电位，但仍可能存在其他机制。

图6  3-OHSA降低肝脏线粒体膜电位和氧化应激

图S6  3-OHSA降低肝脏线粒体膜电位和氧化应激(对应图6)

总结  

         本研究通过小鼠与人体的循环代谢组和脂质组整合，确认BAT参与清除BCAAs和甘油三酯，并鉴定出寒冷诱导的BAT来源脂质3-OHSA。功能上，生理浓度3-OHSA可降低肝线粒体膜电位和ROS生成，在肥胖小鼠中缓解肝脏脂质及蛋白氧化，其作用至少部分依赖ANT2。综合来看，这些结果支持一条将BAT脂肪酸氧化与肝脏氧化还原保护相连接的BAT-肝脏代谢轴。转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自徐凌燕科学网博客。链接地址：https://blog.sciencenet.cn/blog-3483272-1552226.html

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