Cell Metabolism：不饿不吐不反弹，PrRP甩掉一身肥肉（下）
初稿 | 吴世林
校对 | 陈芳芳 胡敏
小编注 | 陈芳芳 胡敏 吴世林
排版 | 吴世林
编辑 | 孟美瑶
5、NN501的长期给药效应同时取决于GPR10和NPFFR2
研究人员通过持续14天每天对WT小鼠和Prlhr-/-基因敲除同窝小鼠给药NN501，发现这样的治疗对小鼠的体重和脂肪利用产生了预期的影响（图4A–4E）。然而，在缺乏GPR10的小鼠中，NN501的作用减弱，这表明其作用依赖于该受体。值得注意的是，但这种效应并未被完全扭转，因为天然的PrRP和NN501均对另一种RF-酰胺受体NPFFR2具有亲和力（图S1C）。其他脂化PrRP类似物——palm11-PrRP31和GUB03385也是如此，它们均能有效地降低小鼠体重。有趣的是，研究者还发现另一种经多重乙二醇-脂肪酸修饰的PrRP类似物（MEG-FA PrRP31；Calibr18-S4）对NPFFR2的亲和力较低，但其对体重的影响也相对较弱。因此，研究者构建了一个新的NPFFR2受体条件性敲除模型（图S4A–S4I）。如先前报道一样，Npffr2-/-敲除小鼠并不表现出明显的代谢表型（图S4C）。值得注意的是，在他们的模型中，无论是纯合子Npffr2-/-敲除小鼠，还是其Npffr2+/-杂合敲除的同窝小鼠，都在转基因等位基因内表达绿色荧光蛋白（GFP）（小编注：该技术路径采用CRISPR/Cas9介导的敲入策略。研究者首先设计了一个含有LoxP-eGFP-STOP-LoxP表达盒的供体载体，通过电穿孔将靶向Npffr2起始位点的sgRNA、Cas9蛋白以及AAV包装的含有LoxP-eGFP-STOP-LoxP表达盒的供体载体一并导入小鼠受精卵；Cas9切断基因组DNA后，细胞启动同源定向修复（HDR），因LoxP-eGFP-STOP-LoxP表达盒带有基因上下游的同源序列，可将该表达盒精确置于Npffr2基因内源性起始密码子的正上游。由于STOP序列提前终止了Npffr2的翻译，纯合小鼠表现为功能性敲除，同时eGFP由Npffr2原有的内源性启动子驱动表达，使得原本表达Npffr2的神经元发出绿色荧光，从而实现示踪。原文在图S4B中展示了孤束核（NTS）和臂旁核（PBN）等脑区的GFP信号，并通过膜片钳实验验证：杂合子（Npffr2⁺/⁻）的GFP阳性神经元对NPFF肽有反应（受体部分保留），而纯合子（Npffr2⁻/⁻）的GFP阳性神经元则无反应（受体完全缺失），证明模型构建成功。因此，该策略实现了“一个等位基因，双重功能”——既破坏了Npffr2功能，又用GFP标记了其表达谱）。在已知表达内源性受体的神经元中观察到了GFP，包括孤束核（NTS）、迷走神经背侧运动核（第十对颅神经；DMX）以及PBN（图S4B）。研究人员利用脑干切片上的标准体外膜片钳电生理学技术，证明了来自杂合Npffr2+/-敲除小鼠的GFP阳性NTS神经元对天然NPFF肽有反应。正如文献中预测的那样——该研究指出NPFFR2与Gi信号通路相关联——他们观察到自发放电受到抑制（图S4F和S4G）。相比之下，来自纯合Npffr2-/-敲除小鼠的GFP阳性NTS神经元中未观察到任何影响（图S4H）。
同样，研究人员对小鼠进行体内给药NN501后，在WT小鼠中观察到体重、摄食量和脂肪利用产生了预期影响，但在同窝的Npffr2-/-纯合敲除小鼠中则未观察到此效应（图4F–4J）。因此，GPR10和NPFFR2对于NN501的减重作用均不可或缺，其作用机制涉及了抑制食欲和促进脂质利用两个方面。鉴于兴奋性GPR10受体与抑制性NPFFR2受体推测位于不同的靶神经上，确定哪些特定细胞类型能对NN501产生这种协调一致的反应，是一个值得探讨的问题。
图4 | NN501对体重的慢性影响取决于GPR10/PRLHR和NPFFR2
图S4 | Npffr2-/-纯合敲除小鼠的建立与验证
6、全身性给药的NN501可进入中枢神经系统
为了探究该PrRP类似物能否进入大脑，并可能与影响能量摄入和/或消耗的中枢神经回路发生作用，研究者将标记有VivoTag-750的NN501通过静脉注射（i.v.）给小鼠，并与注射溶剂的对照组进行了比较（小编注：VivoTag-750是一种近红外（NIR）荧光染料，主要作为一种分子标记或显影剂，用于生物医学研究中的体内成像。简单而言，这是一个能让研究者看见药物分子在动物体内去向的工具，并且还可以根据其荧光信号的强弱，帮助研究者判断药物在不同组织或器官中的积累程度，即同时具备定位和定性的功能）。研究者将药物处理1小时或4小时后小鼠的脑组织进行了透明化处理，并使用光片显微镜观察，以便获取全脑荧光信号。定性分析结果证实，NN501VT750信号存在于血管、脉络丛以及脑室周围器官中，包括极后区（AP）、正中隆起（ME）、终板血管器（OVLT）以及穹窿下器（SFO），其中注射后1小时观察到的信号最强（图5A-5E）。在注射溶剂对照的小鼠大脑中未检测到荧光信号（图S5A-S5E）。尽管每个脑室周围器官都没有血脑屏障，但它们在物理上与大脑的其他部分是分离的。因此，值得注意的是，在下丘脑弓状核（ARC）以及脑干孤束核（NTS）的后极区下方区域也观察到了强烈的NN501VT750荧光信号（小编注：通过VivoTag-750结合全脑光片显微镜成像，直接可视化了药物在小鼠脑内的分布。在缺乏血脑屏障的室周器官（AP、OVLT、SFO等）中检测到信号，属于预期结果。但更重要的是，在位于血脑屏障之内的ARC和NTS核团中也检测到了强荧光信号，这为NN501能够穿越血脑屏障进入大脑实质提供了直接证据。对于NN501入脑的途径，只呈现了“药物在脑实质出现”这个最终的实验现象，即证实了结果。至于它到底是通过室周器官扩散进入的，还是通过脂化修饰增强了跨膜转运，原文本身没有进行讨论或提供论据）。在大鼠和小鼠体内，这两个区域均发现了循环药物，且都含有Prlhr和Npffr2基因的mRNA。
其他小鼠则皮下注射了非荧光性NN501或溶剂，并在2小时后进行灌注，以便对细胞活性标志物FOS进行免疫组化染色。NN501显著增加了脑干中AP、NTS和PBN区域的FOS表达（图5F和5G），以及前脑中PSTN、丘脑室旁核（PVT）、中央杏仁核（CeA）和视上核（SON）的FOS表达（图5H-5K），但在其他研究脑区中未观察到这样的现象，包括弓状核（ARC）、下丘脑室旁核（PVH）、终纹床核（BSTN）、外侧网状核（LRN）或DMX（图S5F-S5J）。FOS染色缺失并不意味着该脑区不活跃，也不意味着其不参与介导NN501的作用（因为在经过电刺激沉默的细胞中，该转录因子通常不会被诱导表达）。因此，尽管FOS在ARC中并未被诱导，但NN501显然能够作用于这一重要的脑调控区域（小编注：FOS是即早基因产物，通常在神经元强烈电活动后被诱导表达。但不表达FOS不等于神经元不活动，例如抑制性神经元或某些调质性信号（例如GPCR介导的代谢型通路）不诱导FOS。NN501的荧光信号确实出现在ARC，说明药物能到达该区域。ARC是调控食欲和能量消耗的核心脑区，包含POMC、AgRP等关键神经元。即使不引起FOS表达，NN501仍可能通过非转录信号通路（如离子通道、突触传递）影响其功能。因此，FOS缺失不等于无功能影响，而药物定位提示其可能作用于ARC）。相比之下，脑干中的AP/NTS（另一个重要的脑部调节区域）对药物的摄取和激活情况表明，NN501对代谢的主要影响可能是通过这些脑干结构介导的（小编注：AP/NTS是外周信号进入中枢的第一站（无血脑屏障），是代谢调节的“门控”区域。GLP-1类药物也被证明主要通过AP/NTS→PBN→下丘脑这条环路发挥作用。在NN501处理中，AP/NTS的FOS诱导非常显著且早期出现，提示它可能是中枢作用的起始点。后续的PSTN、CeA等激活可能是次级或下游反应），这与全身性GLP-1RA的作用机制一致。
距离首份关于使用全身性GLP-1RA减轻体重的临床前研究报告发表以来，已过去了20年，而研究者们才刚刚开始识别其发挥作用所需的细胞类型。要了解双重GPR10/NPFFR2激动剂分子的作用机制有何异同，同样需要进行详尽的分析。例如，已知GLP-1RA会激活一条特征明确的致恶心通路，该通路从背侧迷走神经复合体延伸至臂旁核外侧区（eIPBN）和中央杏仁核（CeA）。尽管NN501确实在上述两个区域均诱发了活性，但在臂旁核背外侧区（dIPBN）中FOS的诱导程度高于eIPBN（图5G）。其次，与GLP-1RA类似，NN501也能激活另一个假定的下游靶点——PSTN（图5l）。PSTN中的含Tachykinin 1神经元（TAC1PSTN）已被认为与多种天然激素的减重作用有关。
在此，研究者通过FOS免疫组化实验证明，无论是系统性给药GLP-1RA还是NN501，均可激活TAC1PSTN神经元（图6A和6B）。接下来，为了探究投射到这些细胞的上游输入，研究者再次向先前已在PSTN中注射了逆行示踪剂Fluoro-Gold的小鼠注射GLP-1RA或NN501（图S6A和S6B）。结果表明，在注射NN501后，投射至PSTN的dIPBN神经元中含有FOS，但在注射GLP-1RA后则不含有（图S6C和S6D）。研究者此前已证实，eIPBN中由GLP-1RA激活的神经元会投射至CeA，但这些神经元似乎不会直接投射至PSTN（图6D）。最后，研究者还探究了在TAC1PSTN神经元被选择性失活的小鼠中，对NN501和GLP-1RA的反应。将AAV-DJ-CMV-DIO-eGFP-2A-TeNT（Tac1CrePSTN-TeNT）或AAV8-hSyn-DIO-mCherry对照（Tac1CrePSTN-mCherry）双侧注射至Tac1Cre小鼠体内（图S6E和S6F）。破伤风毒素轻链的表达不会杀死神经元，但会阻止它们释放神经递质(小编注：破伤风毒素轻链通过切割突触小泡蛋白（如VAMP2）特异性阻断神经递质释放，但不损害神经元存活，同时保留其细胞完整性和潜在的非递质功能。外周组织则常用白喉毒素来杀死特定细胞，例如在肝脏、胰腺或免疫细胞中特异性表达白喉毒素受体，然后注射白喉毒素来清除这些细胞。白喉毒素的毒性A亚基进入细胞后，会催化ADP-核糖基化的反应，从而抑制蛋白质合成。一旦蛋白质合成被中断，细胞就会启动凋亡程序并最终死亡。破伤风毒素是由破伤风梭菌产生的神经毒素，主要作用于神经系统)。术后让小鼠先休养1至2周，然后才开始喂食高能量饮食。无论喂食普通饲料还是高能量饲料，Tac1CrePSTN-TeNT小鼠的体重增长速度均快于Tac1CrePSTN-mCherry对照组（图S6G-S6I）。随后，小鼠接受了为期2周的GLP-1RA或溶剂的皮下注射。GLP-1RA的治疗使Tac1CrePSTN-TeNT小鼠以及Tac1CrePSTN-mCherry对照小鼠的体重均有所下降（图6C和6D）。相比之下，仅Tac1CrePSTN-mCherry对照小鼠（而非Tac1CrePSTN-TeNT小鼠）在接触NN501后出现了体重下降（图6E和6F）。因此，研究者得出结论：TAC1PSTN神经元对于NN501的减重作用是必不可少的，而全身性GLP-1RA的减重作用则不依赖这些神经元。并且还需要进一步的研究来确定，究竟是这种差异，还是其他作用机制上的差异，导致了这些药物对代谢产生的不同影响。
图5 | NN501能作用于大脑，从而引发神经元激活
图6 | NN501（而非司美格鲁肽）的减重效应依赖于TAC1PSTN神经元
图S5 | NN501作用于大脑
图S6 | TAC1PSTN神经元参与体重调节
总结
催乳素释放肽及其同源受体——GPR10在啮齿动物和人类的体重生理调节中起重要作用。本文介绍了一种名为NN501的修饰肽，该肽同时具有GPR10和NPFFR2的激动特性，在全身给药后，NN501可降低体重且不引起明显的厌恶性反应。其减重效果与GLP-1RA相似，但对食物摄入量的影响较小，提示其具有不同的减重机制。此外，停药之后，接受NN501治疗的小鼠体重恢复更为缓慢，且未出现代偿性摄食增加（这与热量限制和GLP-1RA治疗的情况相似）。相反，NN501在治疗期间能增加能量消耗，并对脂肪酸氧化产生持续作用。这些结果表明，GPR10/NPFFR2受体激动作用通过不同于GLP-1RA作用的机制来实现减重，提示它可能成为肥胖治疗的可行替代或补充疗法。
原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(25)00481-4
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