原名：Gut Microbiota Composition Modulates the Magnitude and Quality of Germinal Centers during Plasmodium Infections

译名：肠道微生物群的组成调节疟原虫感染期间生发中心的大小和质量

期刊：Cell Reports

1 高抗小鼠Tac和易感小鼠CR分别感染疟原虫，收集0-21天的脾脏、血清和结肠内容物进行检测。

2 评估Tac和CR小鼠体液免疫应答的数量差异，检测相关细胞和抗体滴定度。

3 评估Tac和CR小鼠体液免疫应答的质量差异，进行了BCR谱带测序。

4 感染的Tac和CR小鼠接受了阻断治疗和伯氏疟原虫再感染试验验证肠道菌群的作用。

1 肠道菌群组成导致约氏疟原虫感染后不同的生发中心（GC）反应与抵抗寄生虫病有关

为了更好地表征抗性和易感小鼠体液免疫反应之间的差异，收集在感染0至21天之间的Taconic Biosciences（Tac）C57BL / 6N高抗小鼠和CharlesRiver（CR）C57BL / 6N易感小鼠的脾脏和血清（图1）。实验中，Tac和CR小鼠之间的寄生虫负担感染后第14天的差异小于2倍；之后的Tac小鼠能够清除感染，而CR小鼠的寄生虫病日益严重，清除动力学延迟（图1A）。符合假设预期的是，细胞分析显示在感染后期Tac小鼠增加了D4 T细胞（图1B和1C），Tfh细胞（图1D和1E），浆母细胞（图1F和1G）和GC B细胞（图1H和1I）。与Tac和CR小鼠在疟原虫感染（p.i）第11天的寄生虫负担相似，循环裂殖子表面蛋白119（MSP119）特异性抗体滴度也显示Tac和CR小鼠在第11天下午是最小差异（图1J）。相反，Tac中MSP119特异性抗体滴度在第14天和第17天明显更高（图1J），对应着第14天下午可作为Tac和CR小鼠之间寄生虫病的分歧点（图1A）。总的来说，这些数据表明肠道菌群可能通过GC反应来控制疟疾的严重程度。

图1. 高抗的Tac小鼠表现出GC B细胞的增殖和寄生虫MSP1特异性抗体滴度的增加。(A)指定日期的红细胞感染约氏疟原虫的百分比(%寄生虫血症)。(B-I)在第8、11、14、17、21天取出脾脏。(J) Tac和CR小鼠感染后14天采集血清。

为了评估Tac和CR小鼠之间GC反应的差异是否是肠道菌群依赖的，用Tac（GF + Tac）或CR（GF + CR）小鼠的盲肠内容物定植基因相同的C57BL / 6无菌（GF）小鼠。如先前所示，这些定居的小鼠表现出与对照Tac和CR小鼠相同的寄生虫动力学（图2A和2B）。在p.i第19天，与GF + CR或CR小鼠相比，分别在GF+ Tac和Tac小鼠中观察到了更多的抗原经历的CD4 T细胞，Tfh细胞，成浆细胞和GC B细胞（图2C-2F）。此外，对MSP119的循环IgG滴度（图2G–2K）和整个寄生虫裂解液的测量显示，与GF⁺ CR和CR小鼠相比，Tac和GF + Tac小鼠的滴度增加（图2L）。由于Tac或CR小鼠与以Tac或CR盲肠内容物定植的GF小鼠之间具有相似的免疫反应，因此该实验提供了概念证明，即体液免疫反应的差异是由肠道菌群驱动的，而不是小鼠产地之间的遗传漂移。这些数据表明，肠道菌群组成的差异会导致不同的GC反应，这与降低的寄生虫负担相关。

图2. 肠道微生物组成影响GC B细胞的扩张和寄生虫特异性抗体的滴度。(A)感染约氏疟原虫后的寄生虫血症百分比。(B)寄生虫血症曲线的曲线下面积(AUC)分析。(C-F)于第19天取脾，于第13天采集约氏疟原虫幼鼠或指定小鼠血清中抗原特异性CD4细胞、(G-K)血清。(L)分别于第0、7、13、19天采集Tac、GF+Tac、CR和GF+CR小鼠血清，按1：200稀释后与约氏疟原虫全虫裂殖平板反应。

2 易感小鼠脾脏内GC结构早期消失对T:B细胞相互作用和功能的影响

Tac和CR小鼠之间的B和T细胞区别明显，而脾脏在幼年小鼠pi第7天则无法区分（图3A）。疟原虫感染过程中脾脏迅速充血并带有血红蛋白沉积，并逐渐膨胀至幼年脾脏重量的。这表明Tac和CR小鼠之间在p.i第9天开始存在类似GC的结构差异。感染后第11天，抗性小鼠和易感小鼠之间的寄生虫病通常发生分化，在Tac小鼠中仍可检测到独特的类GC结构，而在CR小鼠中则不明显（图3A-3C）。GC数量的差异与来自感染小鼠脾脏的CD3⁺细胞，GL7⁺细胞和B220⁺细胞（图3D-3F）。这些数据表明，抗性小鼠在疟原虫感染后可在更长的时间内保持GC结构，从而增加了GC B细胞的数量，并增加了血清抗体滴度。

图3.在约氏疟原虫感染期间，Tac小鼠与CR小鼠相比，有持续的脾脏GC结构。(A-C)指定日期(A)的Tac和CR小鼠的代表性脾脏切片(A)。Tac脾D11(B)和CR脾D11 (C)感染的拼接马赛克图像。(D-F)感染小鼠第0、7、9、11天每个脾脏总B220+(D)、(E)CD3+和(F)GL7+细胞。

T和B细胞的相互作用对GC反应至关重要，而GC B细胞从Tfh细胞接受持续的指令，产生更高亲和力的抗体，因此我们评估了高抗和易感小鼠之间T和B细胞结合的数量(图4A)。根据这一发现，Tac和CRB小鼠在pi后第7天GCB细胞数量和GC反应数量是相似的。疟原虫感染后第7天，Tac小鼠和CR小鼠的T、B细胞结合物数量相似 (图4B)。从第9天开始，Tac小鼠的T和B细胞结合物增加(图4B)，这表明Tac小鼠脾脏中维持GC反应的能力增强支持了T和B细胞的相互作用以及GC B细胞，因此接收到必要的激活和分化信号。Bcl-6在GC B细胞中的表达是GCB细胞分化和功能所必需的蛋白质，依赖于CD4+T细胞共刺激信号和细胞因子。与Tac小鼠T和B细胞结合物数量增加一致，Tac小鼠与CR小鼠相比有更多的Bcl-6+GCB细胞(图4C-4E)。

与Tac鼠中T和B细胞结合物的数量增加一致，随着感染进程发展，Tac鼠的脾中CD73+GC B细胞的频率和数量比CR鼠高(图4F-4I)，并且Tac鼠这些GC B细胞上CD73的表达要高于CR鼠(图4I)。最后，Tac小鼠相对于并CR小鼠的MBC(CD19⁺IgD^-CD138^-CD38⁺)的数量有所增加(图4J和4K)。

图4. 高抗小鼠增加T细胞B细胞相互作用和B细胞功能。(A)第9天脾细胞的典型等高线图和流式细胞术门控。(B) 感染指定日期每个脾脏的T和B细胞结合物(CD3+CD4+CD19+B220+双胞胎)总数。(C)第14天的代表性等值线图(B220+CD19+细胞上的门控)。鉴定GC B细胞(GL7+CD95+)。(D)有代表性的直方图鉴定bcl-6+GC B细胞。(E)第8天和第14天每只小鼠脾脏中bcl-6+GC-B细胞的百分比。(F)第21天脾脏CD73+GC B细胞的代表性流式细胞术图谱。(G)每个脾脏CD73+GC B细胞的百分比。(H)每个脾脏CD73+GC B细胞总数。(I)GC B细胞表面CD73的平均荧光强度(MFI)。(J)CD19+IGD的代表性等高线图。CD138。CD38hi记忆B细胞(MBCs)。(K)指定感染日期每个脾脏的单核细胞总数。

3 肠道微生物驱动疟原虫耐药相关的B细胞受体(BCR)谱系的差异特征

为了进一步评估Tac和CR小鼠体液免疫应答的潜在质量差异，对pi后10天B细胞(免疫球蛋白M[IgM])和GC B细胞(IgM和IgG)进行了BCR谱带测序。之所以选择第10天，是因为这个时间点的抗体谱可能捕捉到了与Tac小鼠在随后几天快速清除感染的能力相关的任何差异，而CR小鼠的寄生虫血症继续增加(图1A和5A)。在每个细胞室和同型中，我们评估了克隆丰度和谱系多样性(图5B)的整体测量以及其他谱系特征。虽然CR小鼠的总体谱系多样性有降低的趋势(图5B)，但观察到的组间差异没有统计学意义(p<0.05)。此外，尽管Tac组和CR组之间的谱系多样性有明显差异，但几乎没有证据表明CR小鼠的谱系是由对相同基因片段的偏见使用所主导的。我们观察到，与TAC小鼠的谱系相比，CR小鼠的IGHV片段谱系在GC B细胞亚群和同型上有更大的组内差异(图5C)；这种差异在IgG⁺GC B细胞中最为显著(图5C)。

在感染后13天收集的Tac和CR小鼠的对抗约氏疟原虫感染的整个红细胞裂解物(图5D)。Tac小鼠(第1-4行)与CR小鼠(第5-8行)相比，具有与更广泛的寄生虫抗原结合的特异性抗体。Tac小鼠还表现出彼此之间更一致的反应，这在CR小鼠中是看不到的)。总而言之，这些数据表明，由于Tac小鼠GC反应的寿命延长以及T细胞和B细胞相互作用增强，Tac小鼠的GC B细胞更具针对性，从而增加了IGHV片段的使用范围，并使抗体反应更有效地清除了约氏疟原虫。

图5. 高寄生虫血症抗性和易感小鼠BCR谱系的质的差异。(A)去脾前小鼠的寄生虫血症。(B)幼稚细胞、IgM+GC B细胞和IgG+GC B细胞的谱带多样性程度为q=2。(C)谱系相异指数(RDI)，基于幼稚细胞、IgM+GC B细胞和IgG+GC B细胞中IGHV基因的总体使用情况。(D)抗约氏疟原虫全寄生虫裂解物的D13血清Western blot。

4 肠道微生物通过GC反应发挥对约氏疟原虫高寄生血症的保护作用

这些数据导致了这样的假设，即肠道微生物调控GC反应以控制寄生虫负担。为了验证这一假设，约氏疟原虫感染的Tac和CR小鼠接受了MR1治疗，MR1是一种阻断CD40L的单克隆抗体，以防止T和B细胞相互作用和GC反应的形成(图6A)。如果肠道微生物群独立于GC反应决定疟疾的严重程度，那么干扰GC对寄生虫负担的影响将微乎其微。在MR1治疗后，与B细胞反应相比，CD4⁺T细胞反应的影响相对较小，在TAC和CR小鼠中，GC B细胞分化均被阻断(图6B和6C)。与阻断GC B细胞分化一致，MSP119特异性抗体在MR1处理的小鼠中没有发生同型转换(图6D)。为了支持这一假设，接受MR1治疗的Tac和CR小鼠都显示出重叠的寄生虫血症动力学和总寄生虫负荷，与对照CR小鼠相似(图6E和6F)。这些数据表明，GC反应的调节是肠道微生物影响疟疾严重程度的一种机制。

图6.肠道微生物调节GC反应以控制约氏疟原虫感染。(A)Tac和CR小鼠分别在第3、5、7、9、11和13天感染约氏疟原虫，并用CD40L或IgG(对照)治疗。(B)第7天和第14天每个脾脏抗原特异性CD4+细胞、Tfh细胞、浆母细胞和GCB细胞总数。(C)第7天和第14天IgG处理组小鼠与CD40L处理组小鼠(B)的细胞数之比。(D)第21天的MSP119特异性抗体滴度。(E)感染约氏疟原虫后的寄生虫血症百分比。(F)AUC分析。

5 对约氏疟原虫高寄生症的抗药性可预防致命性约氏疟原虫感染

有趣的是，与CR小鼠相比，感染约氏疟原虫后TAC小鼠的单核细胞数量增加(图4J和4K)。因此，为了确定Tac小鼠对约氏疟原虫的肠道微生物依赖性耐药性是否会导致对随后的疟原虫感染的耐药性，在最初的约氏疟原虫感染60天后，小鼠被致死的伯氏疟原虫ANKA攻击(图7A)。约氏疟原虫感染后，小鼠表现出预期的寄生虫动力学(图7B)，与Tac小鼠相比，CR小鼠的寄生虫血症增加(图7C)。伯氏疟原虫在C57BL/6小鼠中是典型的致死性感染，对照组、约氏疟原虫幼稚Tac和CR小鼠在伯氏疟原虫感染后表现出100%的实验性脑疟疾(ECM)死亡率(图7D)。然而与约氏疟原虫感染的CR小鼠(30%)相比，约氏疟原虫免疫的Tac小鼠(86%)在伯氏疟原虫攻击后的细胞外基质存活率(86%)高于约氏疟原虫免疫的CR小鼠(30%)(图7D)。在ECM中存活下来的约60%的约氏疟原虫免疫的Tac小鼠也能够防止伯氏疟原虫高寄生血症的发展并控制感染(图7E)。相反，在ECM中存活下来的约氏疟原虫免疫CR小鼠中，没有一只能够控制伯氏疟原虫寄生虫病(图7E)。此外，约氏疟原虫感染的Tac小鼠出现高寄生血症，与出现高寄生血症的约氏疟原虫感染的CR小鼠相比，小鼠的寄生虫血症减少，存活时间更长(图7E和7F)。这些数据表明，肠道微生物群诱导的对约氏疟原虫高寄生血症的抵抗力允许在伯氏疟原虫致死攻击后更好地存活。

图7.对约氏疟原虫感染具抗性的小鼠增加了对致死性伯氏疟原虫的保护。(A)用约氏疟原虫感染Tac和CR小鼠pRBC。(B)约氏疟原虫感染的寄生虫血症百分比。(C)约氏疟原虫寄生虫病AUC分析。(D)伯氏疟原虫感染小鼠的存活曲线。(E)伯氏疟原虫感染的寄生虫血症百分比。寄生虫血症曲线的统计意义显示CR小鼠和Tac高寄生血症小鼠在个别日龄感染寄生虫血症的差异有统计学意义(p<0.05)，CR小鼠和Tac高寄生血症小鼠的寄生虫血症差异有统计学意义。(F)伯氏疟原虫安卡原虫血症的AUC分析(仅显示未出现细胞外基质的小鼠)。

尽管以前的研究表明，肠道微生物的缺失会对体液免疫产生负面影响，但这项研究独特地表明，肠道微生物的组成会影响GC反应的总体规模和质量，从而影响传染病的严重程度，包括记忆发育和防止再次感染。在基因相同的小鼠中，肠道微生物的差异导致了在感染后第9天和第14天之间的关键免疫时间点GC反应持久性的不同。GC结构的这种差异维持导致了不同数量的GC相关细胞类型，不同的疟原虫特异性抗体效价，以及这些抗体对疟原虫的质量和特异性的差异。此外，这些GC B细胞在脾脏中分化，而不是在之前的研究中观察到的肠道相关组织中分化。这些发现对广泛的抗体介导和抗体依赖性疾病的潜在治疗有意义，并为科学界提供了更多关于个人肠道微生物组成的重要性的观点。

在生产有效和持久的疟原虫疫苗方面，研究人员面临的挑战之一是寄生虫和受感染的红细胞上存在大量的表面抗原。有几个因素促成了这种抗原多样性，这导致个体需要在一段时间内暴露在反复感染中，才能发展出对疟疾的自然获得性免疫力。我们的数据显示，易感小鼠的BCR谱系总体上具有较低的多样性，特别是在GC B细胞区段，其特点是限制更多，但克隆性扩张更大。然而，尽管在高抗小鼠中观察到的多样性增加，但它们的GC B细胞谱系彼此之间看起来比敏感小鼠更相似。这些数据表明，易受感染的小鼠循环中的疟原虫抗原特异性抗体的范围可能更有限，这一观点通过Western blot得到了证实。

这项研究中最引人注目的观察之一是50%的约氏疟原虫高抗小鼠在伯氏疟原虫的致命挑战中存活了下来。它们表明，在最初的疟原虫感染期间，有效的GC反应不仅能控制该感染，还能抵御随后的感染，这对预防严重疟疾以及人类疟疾的发病率和死亡率具有重要意义。

虽然这项研究将肠道微生物的组成与GC反应的质量联系起来，但还需要进一步的工作来更好地确定将肠道微生物与体液免疫反应联系起来的机制。本研究中没有观察到短链脂肪酸水平和疟疾严重程度之间的相关性。这其中仍有许多实验要做，以将肠道微生物的特定成分和功能与疟原虫感染后GC反应的差异联系起来。

综上所述，这些数据表明肠道微生物通过调节脾脏GC反应的大小和质量导致小鼠对疟原虫感染易感性的差异。虽然肠道微生物和体液免疫反应之间的分子机制尚未确定，但本研究支持肠道微生物提高了疟原虫获得性免疫率的潜力，从而降低易感人群的疾病严重程度和疟疾相关死亡率。