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宏基因组研究揭示大熊猫的肠道菌群可能并没有特化出发酵纤维的能力

撰文：和平鸽 中科院动物研究所

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

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Guo W, Mishra S, Zhao J, Tang J, Zeng B, Kong F, Ning R, Li M, Zhang H, Zeng Y and others. 2018. Metagenomic study suggests that the gut microbiota of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) may not be specialized for fiber fermentation. Frontiers in Microbiology 9(229). DOI： 10.3389/fmicb.2018.00229

小结

1. 大熊猫肠道菌群在功能上与熊等食肉动物更为近似，而明显不同于植食类群。
2. 大熊猫胃肠道菌群中与纤维素、半纤维素、氨基酸消化和生物反应相关酶富集相关的基因的丰富度与食肉类哺乳动物类似。
3. 酶活性分析显示大熊猫肠道菌群中纤维素酶和木聚糖酶和其它植食性动物相比处于最低水平。
4. 大熊猫肠道菌群并没有产生消化竹子中纤维素和半纤维素的特化。

摘要

大熊猫拥有和别的食肉动物类似的短而简单的胃肠消化系统，但是却以竹子为主要食物，这一现象使其成为现生哺乳动物中的神秘物种。近年来，除了针对大熊猫自身取得的突出研究进展，其取食习性的适应性现状也是生物科学领域存在较大争议的问题。为了解决这一难题，四川农业大学四川省农畜遗传资源勘查与创新重点实验室李英教授领导的研究团队及其合作伙伴使用短读长宏基因组测序技术对大熊猫的粪便进行了研究，并将大熊猫粪便样品的宏基因组数据与哺乳动物中的植食类、肉食类和杂食类进行了对比。

研究结果揭示大熊猫肠道菌群与熊等食肉动物更为近似，而明显不同于植食类群。这些植食类群肠道菌群中的微生物组成的代谢潜能显著不同于大熊猫和其它哺乳动物。此外，大熊猫肠道菌群中与纤维素、半纤维素、氨基酸消化以及生物反应相关酶富积相关的基因的丰富度也与食肉动物类似。更重要的是，对大熊猫粪便样品的酶活性分析显示其纤维素酶和木聚糖酶和其它植食性动物相比处于最低水平。

总之，所有这些结果都揭示大熊猫肠道菌群并没有产生消化竹子中纤维素和半纤维素的特化。

背景

大熊猫是高度易危的物种，也是野生动物保护中广受世界关注的旗舰种类。从系统发育关系来看，大熊猫隶属于熊科，这一类群同时包括肉食性和杂食性的物种。大熊猫最神奇之处在于它每天消耗大量富含纤维素的竹子，但是它却生就典型的食肉类动物短而简单的胃和肠道消化系统。此外，伴随全球气候变化的威胁，这一物种因为强烈地依赖于大量取食少数几种竹子而面临灭绝的风险。

研究者们已试图从各个不同方面探讨大熊猫的适应性演化与未来生存境况。例如： 基于头骨解剖学的研究发现其头骨强健且骨缝强烈愈合、下颌骨发达、咬肌强壮、臼齿平展。此外，它还进化出“假拇指”，这有助于提高取食效率。随着季节的变化，大熊猫取食的竹子种类和部位都会产生变化，以获取更多的能量。还有研究显示Tas1r1（鲜味受体基因）假基因化可能与其食性的转变有关，这一事件发生在4.2个百万年左右。然而，其它的因子可能也参与了其食性转变的调控，如同为植食性的马和奶牛就保持了完整的鲜味受体基因。

此外，大熊猫基因组中的“食欲奖赏系统”中不完善的多巴胺代谢被认为是导致其食性转变的关键因子。尽管关于大熊猫食性转变的后果已经有大量突出的研究成果，然而为什么大熊猫要转变为吃竹子？这一问题依然还是未解之谜。 此外，大熊猫没有发育出其它植食性哺乳动物那样发达的瘤胃或盲肠，它取食大量富含纤维素的竹子，与同等体型的植食性动物相比，它们如何依赖这样的食物而存活依然未知。然而，值得关注的是，对大熊猫基因组的研究揭示它们拥有肉食动物消化系统中所有的关键性酶，但是却缺乏消化富含纤维素的酶类。在这种情况下，它不得不依赖胃肠道微生物菌群以适应于高纤维含量的饮食。季节性的食物来源转变会改变大熊猫的胃肠道微生物菌群组成，也给其自身健康带来问题，引起发炎等症状。慢性胃肠道紊乱会导致圈养大熊猫排泄粘性粪便。胃肠道疾病也是引起野生或者圈养大熊猫死亡的主要疾病。胃肠道系统中与淋巴组织关系密切的微生物能够驱除病原体，协助产生短链脂肪酸以增强对抗病原体的屏障。因此，对大熊猫肠道菌群开展研究对于掌握影响其营养与健康的重要生物学机制意义重大。

Ley等(2008)人的研究发现大熊猫肠道菌群的组成与熊类似，而与其它哺乳动物显著不同。Li等（2015）基于肠道菌群16S rDNA的分析，发现虽然大熊猫与小熊猫一样取食竹子，但是其肠道菌群的组成与黑熊更相似。Xue等(2015)对45只圈养大熊猫的研究也揭示艾希氏杆菌（Escherichia）、志贺氏菌（shigella）和链球菌（Streptococcus）是其肠道系统菌群中的关键组成。这些类群同样出现在包含熊在内的食肉动物的消化系统中。该研究还指出大熊猫肠道系统并没有进化出能有效地消化富含纤维素的肠道菌群。Fang等人(2012)的研究发现大熊猫的肠道菌群可能有助于消化木质素，但是这项研究所用样品数量较为有限，也没有提供能够证明其肠道菌群具有消化木质素能力的直接证据。如果仅考虑菌群的组成，而没有研究其生物学功能较难得出可靠的结论(Wei, et al. 2015)。宏基因组学的研究手段为实现这一目标提供了可能。

为了探讨上述科学问题，研究者对73组（14组为新测数据）来源于不同食性哺乳动物粪便样品的宏基因组数据进行了分析。研究发现大熊猫胃肠道菌群中与纤维素和半纤维素消化、氨基酸降解和生物合成通路相关的基因的相对丰富度与熊非常近似。此外，与别的植食动物相比，大熊猫粪便样品中纤维素酶和半纤维酶的活性最低。此项研究为大熊猫胃肠道菌群没有特化出消化纤维素和半纤维素的能力提供了直接证据。

研究方法

用于宏基因组测序的样品来源于圈养动物，包括6只大熊猫、4只亚洲黑熊、4只竹鼠的粪便样品。 用于酶学活性分析的样品除了大熊猫，还有65只其它动物的新鲜粪便样品，包括家兔、山羊、马、奶牛、小鼠、长颈鹿、斑马、盘羊、梅花鹿、老虎、狼、狮子和狒狒。

宏基因组测序由诺和致源完成，采用Illumina HiSeq 2500双端测序策略。原始数据使用cutadapt 1.3去除接头序列。数据中竹子的序列参考毛竹的基因组使用BWA比对去除；大熊猫和亚洲黑熊的序列参考大熊猫已发表基因组去除；竹鼠粪便样品中宿主的序列参考大鼠的基因组序列去除。去除接头和宿主后的数据使用FLASH进行组装。Sanders 等(2015)发表的数据也包含在分析中。为了避免不同的测序深度造成的偏差，使用seqtk-master对数据进行随机抽提，以获得140869条序列进行后续分析。使用MetaGeneMark进行序列开放阅读框的预测。预测的氨基酸序列使用KEGG在线数据库进行功能注释。碳水化合物活性酶的注释使用 CAZYmes分析工具箱。

非真核生物KEGG直系同源基因和碳水化合物活性酶家族基因的相对丰富度通过将每个样品中所有KO和碳水化合物活性酶家族序列数据标准化为1。含KOs相对丰富度信息的观察矩阵表使用非加权算术平均法（UPGMA） 计算样品之间的欧式距离，并使用主坐标分析法（Principal Coordinates Analysis，PCoA）对样品之间的差距进行定量和图示。这些分析在PAST v.3.1中完成，以对比大熊猫和其它动物纤维素、半纤维素降解相关的纤维素酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、内切-1,4-β-木聚糖酶这些功能相关基因的相对富集度。为了研究不同哺乳动物肠道菌群中纤维降解相关基因的β-多样性，使用了距离分析和PCoA排序对比。由于各个物种取样数量不等，所以使用了曼特惠尼检验（Mann Whitney test）进行差异显著性分析。

前人研究显示植食动物和肉食动物的中丙酮酸和谷氨酸代谢通路显著不同，本研究手工绘制了相关基因富集程度的差异。碳水化合物活性酶相关基因的UPGMA聚类树使用不同来源样品中这一基因家族的相对丰富度绘制，并使用自举检验对节点的支持率进行计算。使用LEfSe分析检测不同食性类群之间菌群组成的差异。不同类群间差异是否显著使用GraphPad Prism 5 软件中的曼特惠尼检验进行统计分析。

通过分析粪便样品的纤维素酶和木聚糖酶的活性对大熊猫、食肉动物、食草动物和杂食动物肠道菌群的纤维素降解力进行对比。纤维素酶和木聚糖酶是纤维素和半纤维素降解通路中最关键的酶类。使用纤维素酶蒽酮比色法和中性木聚糖酶二硝基水杨酸法分别对这两种酶的活性进行定量检测。使用曼特惠尼检验分析大熊猫与不同食性样品组之间的差异是否显著。

研究结果

PCoA显示大熊猫肠道菌群宏基因组功能预测结果与熊和别的食肉动物更为近似（图1）。从欧式距离的UPGMA聚类树来看大熊猫与其它植食动物的差距也显著大于（P<0.001）其与其它食肉动物之间的差距（图3. A）。这一结果支持大熊猫与其它食肉动物肠道菌群功能上的相似性。

图1. 大熊猫肠道微生物菌群功能组成与熊和其它食肉动物类似

前人研究显示肠道菌群中有4个基因与纤维素和半纤维素的降解密切相关，这些基因也同样出现在大熊猫的胃肠道菌群中（图1. B-E）。分析发现，这些基因同样也出现在本研究包含的所有食性类型的动物类群中。然而，它们在大熊猫肠道菌群中的相对丰富度却显著低于（P<0.05）其它的植食性动物，与熊和其它食肉动物的情况类似。

Muegge等人(2011)的研究显示植食性哺乳动物的肠道菌群中与氨基酸生物合成反应相关的酶得到富集，而肉食性哺乳动物的肠道菌群中与氨基酸降解反应相关的酶得到富集。此项研究发现大熊猫肠道菌群中与氨基酸降解通路密切相关的酶得到了富集，而与氨基酸合成通路密切相关的酶则较为缺乏，与肉食性哺乳动物非常类似。此外，大熊猫肠道菌群中催化谷氨酰胺和谷氨酸降解的基因也相对较为丰富，相反催化这些物质合成的基因则较为不足 (图2)。

图2. 丙酮酸和谷氨酸代谢通路及其催化基因相对丰度在大熊猫、熊、肉食者、杂食者和植食者之间的对比

植食性动物的发酵代谢，包括前肠发酵和后肠发酵被认为在其食用低能量的植物资源中具有重要的作用。此研究还比较了不同食性类型肠道菌群中催化短链脂肪酸产生和利用相关酶编码基因的相对丰富度。同样，大熊猫和其它食肉动物类似，其能够代谢丙酸、乙酸、丁酸甲酯相关酶的丰富度也低于植食动物。Wood-Ljungdahl通路和甲烷生成通路相关酶的丰富度同样低于其它植食动物。因此，此项研究揭示与其它食肉动物类似，具有较短且简单胃肠消化系统的大熊猫肠道同样缺乏微生物发酵的能力。

此外，从碳水化合物活性酶相关基因的丰富度来看（图3. B），与纤维素和半纤维素的降解有关的基因家族在大熊猫肠道菌群中并不丰富，其所占比例与熊和别的食肉动物类似。而与其它食肉动物相比，8类在大熊猫中较为丰富的CAZY家族没有1类与纤维素和半纤维素的降解有关。

图3. 碳水化合物活性酶相关基因丰富度在大熊猫和其它植食动物间的对比

以上结果均揭示大熊猫肠道菌群代谢纤维素和半纤维素的能力低于其它的植食性动物。酶学活性的直接分析也进一步证实以上结果（图4）。

图4. 不同食性哺乳动物间纤维素酶和半纤维素酶活性的对比

主要结论

此项研究为大熊猫肠道菌群是否具有降解纤维素和半纤维素的能力提供了较为可靠的证据。研究发现与纤维素和半纤维素降解密切相关的酶的相对丰富度在植食性哺乳动物中明显高于大熊猫和食肉动物。研究者们推测，大熊猫具有与其它食肉类动物类似的胃肠道结构，在功能上可能还没有形成类似植食性动物的菌群组成，这可能也与其较短的演化历史有关，它可能正处于适应于高纤维饮食的演化进程中。

大熊猫胃肠消化系统缺乏其它植食性动物特有的瘤胃或者盲肠等能够对高纤维食物进行发酵的场所。竹子在其消化系统中停留的时间相对较短，这也不利于多糖类物质的发酵。大熊猫取食竹子的过程中获取到的能量是非常有限的。Zhu 等(2011)的研究揭示大熊猫肠道菌群中纤维素酶和半纤维素酶的相对丰富度与其它植食性动物比较处于较低水平，这一结果与此项研究的发现也是一致的。

从野生动物保护的角度来看，已有研究报道大熊猫分布范围不断缩减，伴随气候变化带来的种群片段化不断加剧，尤其是近两个世纪以来，其栖息地丧失和片段化的情况更加严峻。然而，它的消化系统并没有演化出有效地消化竹子的能力，因而强烈地依赖于大量取食竹子。目前，除了大熊猫的保护，竹林的保护已经变得至关重要。

主要参考文献

Fang W, Fang Z, Zhou P, Chang F, Hong Y, Zhang X, Peng H, Xiao Y. 2012. Evidence for lignin oxidation by the giant panda fecal microbiome. PLoS One 7(11):e50312.

Guo W, Mishra S, Zhao J, Tang J, Zeng B, Kong F, Ning R, Li M, Zhang H, Zeng Y and others. 2018. Metagenomic Study Suggests That the Gut Microbiota of the Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca) May Not Be Specialized for Fiber Fermentation. Frontiers in Microbiology 9(229).

Ley RE, Hamady M, Lozupone C, Turnbaugh PJ, Ramey RR, Bircher JS, Schlegel ML, Tucker TA, Schrenzel MD, Knight R and others. 2008. Evolution of mammals and their gut microbes. Science 320(5883):1647-51.

Muegge BD, Kuczynski J, Knights D, Clemente JC, Gonzalez A, Fontana L, Henrissat B, Knight R, Gordon JI. 2011. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science 332(6032):970-4.

Sanders JG, Beichman AC, Roman J, Scott JJ, Emerson D, McCarthy JJ, Girguis PR. 2015. Baleen whales host a unique gut microbiome with similarities to both carnivores and herbivores. Nature Communications 6.

Wei F, Wang X, Wu Q. 2015. The giant panda gut microbiome. Trends Microbiol 23(8):450-2.

Xue Z, Zhang W, Wang L, Hou R, Zhang M, Fei L, Zhang X, Huang H, Bridgewater LC, Jiang Y and others. 2015. The bamboo-eating giant panda harbors a carnivore-like gut microbiota, with excessive seasonal variations. MBio 6(3):e00022-15.

Guo W, Mishra S, Zhao J, Tang J, Zeng B, Kong F, Ning R, Li M, Zhang H, Zeng Y and others. 2018. Metagenomic Study Suggests That the Gut Microbiota of the Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca) May Not Be Specialized for Fiber Fermentation. Frontiers in Microbiology 9(229).

Zhu L, Wu Q, Dai J, Zhang S, Wei F. 2011. Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108(43):17714-9.

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