从外周血中快速富集新抗原特异性CD8-T细胞（NeoPBL），通过NeoSelect和NeoExpand-REP技术，经新抗原肽刺激结合磁珠提取，新抗原特异性 CD8-T细胞，28天内可实现超2000倍富集，使其频率达离体培养TIL水平。该方法保留细胞记忆特征（如 CD28、TCF7 高表达）和多克隆反应性，能靶向自体肿瘤类器官，且避免TIL疗法需要手术获取肿瘤组织和手术带来的风险，这种条件限制极大地缩小了TIL疗法在患者中的利用率和可及性，TCR-T 细胞疗法的耗时问题，为癌症个性化过继细胞治疗提供更广泛可及性和更加高效的策略。
研究背景与目标
癌症免疫治疗现状TIL和TCR-T：
TIL 疗法在黑色素瘤中有效，但在消化道癌症中因细胞高度分化而疗效有限。在免疫细胞生物学中，“高度分化” 指免疫细胞（如T细胞）在长期抗原刺激或慢性炎症环境中，逐渐失去增殖能力，而T细胞表面可以呈现高表达耗竭标志物：如 CD39、PD-1、LAG-3 等，这些分子会抑制T细胞的杀伤功能，出现T细胞耗竭。同时也会呈现共刺激分子低表达：CD28、CD27等的表达缺失，导致T细胞难以接收增殖和活化信号，也会导致增殖能力下降，出现细胞耗竭。
TCR-T 细胞疗法是聚焦单抗原的TCR，而实体瘤（如消化道癌症）中肿瘤细胞存在广泛的抗原多样性，即使同一患者的不同转移灶也可能表达不同新抗原。当 TCR-T 细胞仅靶向单一抗原（如 TP53 或 PSMB9 突变肽）时，肿瘤可通过抗原基因沉默或HLA 分子丢失而逃逸。TCR-T制备周期长也是存在的技术瓶颈。主要是个性化TCR定制的复杂性。从肿瘤测序筛选新抗原，到高亲和力TCR克隆获取和对T细胞基因工程改造和制备都需要很长周期。
NeoPBL 的潜力：外周血新抗原特异性T细胞（NeoPBL）表型更接近记忆细胞，分化程度低，但频率极低（<0.005%），需高效富集技术。
NeoExpand-REP技术：新抗原刺激+快速扩增
1. 刺激阶段：用新抗原刺激产生抗原特异性T细胞。患者自体的血细胞或 CD4 T 细胞经过辐射处理，让它们“携带”1μg/mL 的肿瘤新抗原肽，然后洗3次去掉多余肽段。将患者的T细胞（效应细胞）和上述靶细胞按1:5的比例放在24孔板里一起培养过夜。T细胞会被新抗原激活，激活的标志是至少50%（理想70-90%）的T细胞表面表达4-1BB蛋白。
2. 扩增阶段：快速扩增激活的T 细胞。把激活的T细胞转移到含有“饲养细胞”的培养基里。加入辐照处理的异体饲养细胞（1个T细胞配100个饲养细胞），再加上 OKT3 抗体（30ng/mL）和IL-2 细胞因子（3000IU/mL）。第5天换一次培养基，第7天把细胞浓度调整到100万/mL继续培养，根据情况换液传代。如果起始用50万T细胞，先在24孔板刺激，再转移到GREX6孔板扩增；如果用500万T细胞，就用更大的容器（如T25培养瓶）刺激，最后转移到G-REX100大容器里大量扩增。
NeoSelect技术：在NeoExpand 基础上增加“磁珠筛选”的精准富集法
1. 前期准备：先选出“记忆”T细胞。在第0天，用Stem Cell Tech 的工具筛选出 CD8 记忆T细胞（这类细胞对抗癌更有 “经验”）；如果需要，第 14 天再筛选掉非 CD8 细胞，提高纯度。
2. 刺激与提取阶段：用磁珠“选出”目标 T 细胞。刺激步骤类同NeoExpand：先让T细胞和携带新抗原的靶细胞共培养16小时，激活对新抗原有反应的T细胞。激活后，用磁珠“抓住”靶细胞，靶细胞可以是转导了 NGFR 蛋白的自体细胞（用 NGFR 磁珠提取），或直接用自体 CD4 T 细胞（用 CD4 磁珠提取）。由于T细胞和靶细胞结合后会被一起 “钓出”，从而富集出目标T细胞（CD4 磁珠效率稍低，但更简单）。在进行新抗原特异性T细胞筛选时，会用负载新抗原肽的靶细胞（如转导了截短神经生长因子受体NGFR的纯化自体淋巴细胞或纯化的自体CD4+ T细胞）与待筛选的T细胞（效应细胞）进行共培养。在共培养过程中，新抗原特异性T细胞表面的T细胞受体（TCR）会特异性识别靶细胞表面由MHC分子呈递的新抗原肽，两者结合形成稳定的复合物。当加入能特异性结合靶细胞表面分子（如NGFR或 CD4分子）的磁珠时，磁珠与靶细胞结合。由于新抗原特异性T细胞与靶细胞已经紧密结合，所以T细胞和靶细胞会被一起 “钓出”，从而实现新抗原特异性T细胞的富集筛选。这是基于抗原与受体的特异性结合原理以及磁珠对靶细胞的特异性识别结合实现的 。
3. 扩增阶段：把磁珠筛选出的T细胞转移到和NeoExpand相同的REP条件下扩增。因为磁珠筛选会留下很多“无关”T 细胞，所以 NeoSelect 可以用更大的起始细胞量（如500 万效应细胞配2500万靶细胞），最终只有约10%（50万）的有效T细胞被提取并扩增，更适合大规模生产。
经过筛选可将新抗原反应性T细胞频率从0.005%提升至10%，28天内实现超2000倍富集，提供足够治疗剂量 ；筛选的T细胞保留多克隆性和记忆表型，维持高活性（4-1BB + 细胞>50%）；筛选结合REP快速扩增可在28天内扩增至1×10⁹以上细胞，适配临床级生产。这些应用均基于新抗原特异性细胞的筛选技术，达到“高活性、高特异性、快速扩增”的新抗原特异性T细胞的获取能力，为肿瘤免疫治疗提供了另一个完整的解决方案。
Rapid enrichment of progenitor exhausted neoantigen-specific CD8 T cells from peripheral blood BioRxiv preprint May 15, 2025.
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