文献来源：陈烨,李凯,周宇荀,等. 小鼠基因转录表达分析中内参基因的优选[J]. 中国实验动物学报,2011,19(3):197-202. DOI:10.3969/j.issn.1005-4847.2011.03.004.

摘  要

目  的： 建立小鼠基因转录表达分析中内参基因的选择方法。

方  法：以C57BL/6J和C3H/HeJ 两个品系3个不同组织及2个不同发育阶段为研究对象，应用反转录实时定量PCR技术，评价GAPDH、HPRT1、B2M、PPIA、ACTB和18S rRNA等6个看家基因在下丘脑、垂体与卵巢中mRNA水平的表达稳定性。

结  果：GeNorm统计分析表明，GAPDH和HPRT1表达最为稳定，PPIA等次之，B2M在不同组织和发育阶段中都几乎无表达。

结  论:  成功筛选到GAPDH和HPRT1两个稳定表达的看家基因，证实了小鼠基因表达转录分析中内参基因选择的必要性和可行性。

关键词

内参基因；基因表达；反转录实时定量PCR； geNorm程序

本研究选取GAPDH、HPRT1、B2M、PPIA、ACTB和18S rRNA共6个看家基因，通过SYBR-Green qRT-PCR技术对相关组织和发育阶段中的基因转录水平进行检测，评估适合小鼠基因表达水平研究的内参。

1、材料与方法

C3H/HeJ（B6）和C57BL/6J（C3H）两个近交系实验小鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司（SYXK（沪）2007-0005）。动物实验遵守中国1988年实验动物管理条例。两品系雌鼠分别分成15、45日龄两组，每组3窝，每窝收集3只。取样前，禁食4小时，10a.m－11a.m颈椎脱臼处死动物，迅速取出下丘脑、垂体、卵巢样本，液氮速冻后-80℃保存备用。

依照说明书使用mRNA Isolation Kit（Applied Biosystems）抽提总RNA。采用DNaseI（Invitrogen）以去除基因组DNA污染。用紫外分光光度计测定每个RNA样本浓度与纯度，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定提取RNA的完整性。

按照ImProm-II^TM 逆转录酶（Promega）说明书逆转为cDNA，同时设阴性对照。上下游引物均跨越内含子设计，引物序列由上海生工合成（见表1）。PCR通过 ABI 7900 Real-Time PCR System 和7900 System Software-SDS 2.2 (Applied Biosystems) 运行。

PCR反应终体积（25μl）包括2×SYBR Green/Rox qPCR Master Mix（Fermentas） 12.5 μl，上下游引物各0.3 μmol/L, cDNA模板 2.5μl, 同时设阴性对照。PCR反应程序为：95℃变性10min; 95℃变性15s, 60℃复性延伸1min, 40个循环。反应产物经融解曲线和琼脂糖凝胶电泳检测特异性。经SDS 2.2软件分析循环域值（Ct值）。

表一qRT-PCR中所用看家基因和目的基因引物

Tab. 1 Housekeeping gene and target gene primers used in the quantitative RT-PCR

采用geNorm程序（http://medgen.ugent.be/-jvdesomp/geNorm/）对候选看家基因表达稳定性和所需内参基因数量进行分析。设定不同样本中某一看家基因Ct值最小者的相对表达量为1，其他样本该看家基因的相对表达量则为2^-△Ct（△Ct=各样本Ct值-最小Ct值），计算基因表达稳定度的平均值M，对看家基因的表达稳定度进行排序（M值越小，表达越稳定），并通过看家基因标准化因子配对变异分析V_n/n+1来评估该实验条件下基因表达研究所需的最适内参基因数量。

将15日龄和45日龄雌鼠C3H/HeJ作为对照组，15日龄和45日龄雌鼠C57BL/6J作为实验组，分别用不同的看家基因均一化处理sox3，通过△△Ct方法表明目标基因在下丘脑、垂体、卵巢中的相对表达差异。

2、结果展示

每对引物扩增结束后，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1示，GAPDH、ACTB、PPIA、HPRT1和18S rRNA目的片段大小正确，条带清晰，但18S rRNA非模板对照中有明显引物二聚体存在；各看家基因的融解曲线分析如图2示，18S rRNA非模板对照出现相同尖锐峰，其余看家基因均为单一融解峰。其中B2M无扩增子存在，不作后续进一步分析。

图1 各看家基因的扩增产物琼脂糖凝胶电泳

注：1，3，5，7，9，11分别为GAPDH, ACTB, PPIA, HPRT1, 18SrRNA, B2M; 2, 4, 6, 8, 10, 12为阴性。

图2  6个看家基因的融解曲线

注：Y轴dF/dT表示看家基因的相对荧光值与X轴融解温度的相应比值。相似的峰值提示无错配与二聚体存在。

5个看家基因稳定性由低到高依次为ACTB<18S rRNA<PPIA<GAPDH和HPRT1（图3.a）。最稳定基因为GAPDH与HPRT1，且V值为0.175，继续加入第三、第四和第五个基因时，V值呈上升趋势，表明没有必要再选择第三个或以上数目基因进行校正。因此，GAPDH和HPRT1一起即可作为后续mRNA分析最为理想的内参。

图3 运用geNorm软件分析定量标准化过程中所需的合适内参

注：A为6个看家基因的平均表达稳定度(M)；Y轴表示看家基因的平均表达稳定度M值，X轴表示看家基因表达稳定性由左向右逐步提高。B：配对变异程度，从最稳定的两个看家基因配对开始，逐步加入第三、第四和第五个基因。

以GAPDH与HPRT1为内参基因对sox3的相对定量结果基本一致。C57BL/6J和C3H/HeJ相比，sox3基因在15日龄垂体、卵巢及45日龄卵巢中上调表达，并且各个样本中表达水平趋势相同。但是以18S rRNA和ACTB为内参进行相对定量时，则呈现不一致的趋势，18SrRNA校正后显示15日龄下丘脑、及45日龄下丘脑中C57BL/6J有少许上调表达，ACTB校正后显示C57BL/6J 15日龄卵巢中表达下调。相对定量结果的稳定性与geNorm软件的数据分析结果一致。表明采用GAPDH和HPRT1中的一种作为内参基因，就能满足所需。

图4  以GAPDH、ACTB、PPIA、HPRT1及18S rRNA分别对sox3表达量进行归一化

注：△△Ct值越大，表明目的基因RNA转录水平变化幅度越大。△△Ct>0表示目的基因表达下调，而△△Ct<0时则表达上调。

本 文 讨 论

以往研究中，大多研究者习惯选用单一内参基因研究基因表达变化，然而，Vandesompele等研究发现，仅用单个内参基因，目标基因定量结果中误差可达3倍以上，因此建议应选定几个内参并进行几何平均以准确地标准化数据。实际上，在特定的实验条件下，使用过多的内参不方便、经济成本也较高，结合选定内参在C3H/HeJ和C57BL/6J的配对差异，建议选取GAPDH和HPRT1一起校准化数据，从而可更好地保证结果的可信性。GeNorm软件的发明者Vandesompele等认为，V值在0.15以下是内参基因组合的最佳阈值。往往实践中无法得到如此理想的内参基因，尤其是在个体水平存在较大差异的情况下，接近0.15，甚至0.2左右都可接受。故在本文中GAPDH和HPRT1两个内参基因被选为最优的参照。

总之，在某些时空条件下，一些基因表达水平的稳定并不代表在其他时空条件下其表达水平也是稳定的。没有一种mRNA的表达水平在所有条件下是恒定的。在各种研究条件下，用多种内参基因平衡化qRT-PCR数据，将有助于校正系统偏差从而得到更可靠的结果，这对于相关基因的准确定量，尤其是细微表达差异的研究具有极其重要的意义。

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