【EFL进展】：强韧仿肌腱丝素蛋白帮助组织再生

人体中许多组织具有高度有序的各向异性结构，赋予它们优异的力学性能和特定的生物学功能。例如：肌腱所具备的单一取向、多尺度和多层次结构正是其优异力学性能的关键基础。然而，人造材料难以兼具天然组织所具备的多尺度/层次结构、强韧力学和生物相容性。

为解决上述挑战，EFL团队于2023年报道了一种机械训练方法，将明胶基水凝胶的强度提升至6.67 MPa（Tough gelatin hydrogel for tissue engineering. Advanced Science, 2023, 10(24): 2301665）。2024年，团队将该方法进一步拓展，通过打印、训练和交联三步法，成功实现了可3D打印定制的坚韧明胶（3D printing of tough hydrogel scaffolds with functional surface structures for tissue regeneration. Nano-Micro Letters, 2025, 17(1): 27）。本研究聚焦于丝素蛋白这一天然高分子，尝试通过结构设计实现兼具高强度、韧性及优异生物性能的支架材料。

本研究提出了一种三步法策略（包括定向冷冻、机械压实和酒精退火），用于制备具有单一取向、多尺度和多层次结构的仿跟腱丝素蛋白支架。首先，在纳米尺度上，通过乙醇诱导丝素蛋白形成β-折叠结晶；其次，在微米尺度上，通过定向冷冻构建具有单一取向的微结构；最后，在宏观尺度上，通过机械压力增强定向孔壁之间的界面结合力。该丝素蛋白支架的单向、多尺度结构高度仿生天然跟腱组织，并通过多尺度协同效应显著增强了对裂纹扩展的抵抗力，从而大幅提升了整体强度和韧性（抗拉强度达7.8 MPa，断裂伸长率为206 %，韧性为14.52 MJ·m^-3）。此外，该丝素支架完全通过物理方法制备，无需化学修饰或添加化学试剂，最大程度保留了丝素的生物相容性。仿生跟腱丝素支架有效模拟了肌腱的单一取向特征，显著促进了肌腱细胞的黏附、定向迁移以及肌腱特异性蛋白的上调表达。在兔全层跟腱缺损模型中，将丝素支架植入后，经过8周的修复，支架有效促进了新生胶原纤维的有序排列，使再生的肌腱组织在结构上高度接近天然肌腱。

相关研究“Strong and Tough Tendon-Mimetic Silk Fibroin for Tissue Regeneration”发表在《Advanced Healthcare Materials》期刊上。浙江大学机械工程学院贺永教授、孙元博士后为论文通讯作者，刘国峰博士生、夏鹏程博士生为该论文第一作者。

图1.用于肌腱组织再生的强韧仿肌腱再生丝素蛋白支架示意图

丝素蛋白溶液经定向冷冻、机械压实和酒精交联等一系列工艺，制备成强韧仿肌腱丝素蛋白支架。定向冷冻过程中，冰晶定向生长，去除冰晶后，丝素蛋白形成定向有序的多孔结构，而后，经水蒸汽塑化与机械压实致密化后，支架密度提升，并保持了良好的取向结构。实验分析证实了其优异的各向异性特征，其结构高度仿生天然跟腱的取向结构。

图2.仿肌腱丝素蛋白支架微观结构形貌表征

丝素蛋白主要由两种不同的构象组成：亚稳态的丝素I型（Silk I），包括无规卷曲、α-螺旋和β-转角结构，以及更稳定的丝素II型（Silk II），其特征为反平行β-折叠结构。丝素蛋白的力学性能与其构象密切相关，尤其是β-折叠结构的含量，其对丝素材料的强度和韧性起着至关重要的作用。通过光谱分析，系统研究了丝素蛋白支架在酒精处理前后的晶体构象变化。原始丝素蛋白支架以随机卷曲构象为主，经酒精处理后，支架由无定形向有序的晶区转变，构象转变为稳定的β-折叠结构。拉曼和红外光谱进一步定量分析了β-折叠相含量的大幅提升。酒精处理有效促进了丝素蛋白支架的结晶化，将改善其结构和性能。

图3.乙醇处理前后丝素蛋白支架晶体结构变化

仿生丝素支架展现出优异的力学性能，兼具柔软性与高强度。通过定向冷冻、机械压实和酒精交联等一系列工艺处理，显著提升了支架的强度（5.33 MPa）、断裂伸长率（194.63%）及韧性（6.36 MJ/m³），远超无序结构的支架。断裂模式分析表明，沿丝素取向方向加载时可有效抑制裂纹扩展，体现了类似天然组织的裂纹钝化效应。不同丝素浓度支架的测试发现，适当的微观结构排列与层间结合对于力学性能至关重要。此外，循环拉伸实验验证了其良好的力学耐久性。进一步优化乙醇浓度、冻结铸造及压实条件可进一步提升性能。相比传统制备方法，本研究采用纯物理方式，不引入化学修饰，保留了丝素蛋白优良的生物相容性，展示了其在组织工程领域应用的潜力。

图4.丝素蛋白支架各向异性力学性能表征

活/死染色和细胞活性定量分析表明，TPSCs细胞在定向支架和无序支架上均保持接近100%的活性，展现出良好的细胞相容性。CCK-8检测显示细胞在3天培养期间持续增殖，血液相容性测试结果也显示两种支架的溶血率均远低于5%，具有优异的血液相容性。共聚焦显微镜观察结果表明，定向支架能够诱导细胞沿支架取向方向高度有序排列，细胞呈细长纺锤状，而在无序支架上细胞呈随机分布。免疫荧光染色结果显示，TPSCs细胞在定向支架上分泌的I型胶原和III型胶原含量明显高于无序支架，且胶原纤维沿支架方向有序排列，而随机支架上则胶原分泌量较低且无特定方向性。此外，机械转导通路相关蛋白TAZ和YAP1的表达在定向支架上也显著上调，进一步说明有序微观结构不仅促进细胞排列，还激活了与力学刺激响应相关的信号通路。这些结果表明，支架微结构对引导细胞行为、促进细胞功能具有重要作用，为其在组织工程应用中提供了坚实的基础。

图5.细胞相容性及定向支架引导细胞定向迁移PAAM/NAAC复合材料在智能医用石膏绷带中的应用及其回收性能。

为了评估RSF支架对跟腱再生的修复效果，在兔体内建立了全层跟腱缺损模型。术后4周和8周，通过H&E和Masson染色观察组织形态及胶原纤维排列情况。结果显示，定向支架组在4周即表现出致密且线性排列的胶原纤维和有序延展的细胞形态，优于随机结构的组及空白组。8周后，定向支架修复组织的胶原纤维高度有序，细胞呈典型纺锤状，结构接近天然跟腱组织。半定量组织学评分显示，定向丝素组在各评价指标上均优于其他组。天狼星红染色和免疫荧光结果进一步表明，定向有序支架促进了COL III向COL I的转变，COL I/COL III比值显著提高，提示胶原纤维成熟度更高。整体结果证实，定向有序支架能有效促进跟腱组织再生并恢复其功能结构。

图6.强韧丝素蛋白用于兔跟腱全层缺损修复

7.定向丝素蛋白支架促进肌腱再生的潜在机制

为探究丝素支架促进跟腱修复的机制，开展了TMT蛋白质组学分析。主成分分析和相关性分析显示，空白组、定向有序组和无序组蛋白表达存在显著差异。定向有序组中，HAPLN1、CCN2和COL11A2等与细胞外基质形成及细胞增殖相关蛋白显著上调，而部分与炎症相关蛋白下调。GO富集分析表明，定向有序支架显著促进了蛋白稳定性、血管生成和细胞黏附，同时增强了细胞骨架结构和细胞连接。与无序支架相比，定向有序支架在调控血管生成和细胞外基质方面更具优势，可能通过有序结构引导细胞迁移并激活信号通路。PPI分析进一步证实其可通过多条通路协同调控，显著提升肌腱再生效果。

图7.蛋白质组学分析

图8.差异表达蛋白质的基因本体富集分析

图9.蛋白质-蛋白质相互作用差异表达蛋白质的网络分析

综上所述，受天然肌腱多级有序各向异性结构的启发，本研究通过定向冷冻、致密化处理和乙醇交联等工艺，成功制备了一种具有优异力学性能的肌腱仿生丝素蛋白支架。该支架具有优异的柔韧性、高强度和高韧性，其拉伸强度达到7.8 MPa，断裂伸长率为206%，韧性为14.52 MJ·m⁻³。得益于其仿生天然跟腱组织细胞外基质定向有序结构，该支架能够显著促进肌腱细胞的黏附、定向迁移、增殖，并上调跟腱特异性蛋白的表达。在动物实验中，将支架植入新西兰大白兔全层跟腱缺损模型中，以评估其组织再生效果。经过8周的修复，定向有序支架有效促进了肌腱再生，这主要归功于其良好的力学传导能力。本研究提出了一种仿生策略，同时复刻了天然组织的结构特性与力学性能，为未来再生医学提供了新的思路

文章来源：https://doi.org/10.1002/adhm.202500428

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