Mechanisms of HBV-related hepatocarcinogenesis

姚宁华

Abstract

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都比较高,并呈现出逐渐上升的趋势。尽管近年来肝癌的诊断和治疗有了一定进步，但是其预后仍很差。就全球范围来讲，肝炎病毒感染是肝癌发病的主要危险因素，高达80％的肝癌归因于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）或丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）感染。在我国，则主要是乙肝病毒感染为主，90%肝癌患者HBsAg阳性。B型肝炎病毒（HBV）是一种小型包膜DNA病毒，主要感染肝细胞并引起急性或慢性肝病，流行病学研究提供了慢性HBV感染与肝癌发生因果关系的大量证据。对病毒诱发肿瘤形成分子机制的广泛研究发现：HBV DNA可以整合到宿主DNA直接转化肝细胞、HBV蛋白参与干扰细胞信号通路并导致细胞生长失控也具有致瘤潜力。在这篇综述中，我们讨论慢性HBV感染是原发性肝癌主要危险因素的相关证据以及长期HBV感染导致肿瘤形成可能的分子机制。

 

关键词：乙肝病毒，肝细胞癌，癌基因，发病机制，信号通路

Introduction

肝细胞癌(HCC)是常见的恶性肿瘤，其发生率和死亡率分别占全球恶性肿瘤的第5位和第3位¹,占我国恶性肿瘤的第3位和第2位，在部分地区和农村其死亡率已经上升到第一位。在全球范围内其发病率逐年上升，每年约新增加60余万病例,其中50%以上病例发生在中国。肝炎病毒感染是肝癌的主要危险因素，高达80％的肝癌归因于乙肝病毒或丙型肝炎病毒感染²。在我国，则主要是乙肝病毒感染为主，90%肝癌患者有HBV感染或者HbsAg阳性。慢性乙肝病毒携带者肝癌患病风险较常人增加了5 - 15倍¹。对于HBV感染者，已证明抗病毒治疗和疫苗可以降低肝癌的风险，Liaw YF等³证实使用拉米夫定治疗，可以降低肝硬化和非肝硬化慢性乙型肝炎患者HCC发病率，但是随着对拉米夫定抗药性的发展，其作用会钝化⁴，近来的研究发现：只有少部分患者使用抗病毒治疗来预防肝癌的发生有效^5-6，而且持续的清除患者HBV是难以实现的，特别是对于已发生肝硬化的患者尤其困难。目前，手术切除与肝移植仍然是治疗肝癌最有效的方法，少数病人则更宜行介入术。尽管近年来肝癌的诊断和治疗有了一定的进展，其预后仍然不理想，五年生存率极低。究其原因, 肝癌对目前化疗药物不敏感，大多数肝癌患者缺乏有效的治疗方法⁷；此外，肝癌往往在疾病的晚期才被诊断，这就排除了局部消融、外科手术这些原本可以改善病人病情的方法^8-9。在这种情况下，迫切需要弄清肝癌的基本分子机制，这有利于发现早期肿瘤标志物和新型靶向药物，提高治疗效率。

1.肝癌发生的分子途径

肝细胞癌是一种高度异质性的恶性肿瘤。其形成是一个多步骤的复杂过程，涉及大量的遗传学与表观遗传学改变、癌基因或癌相关基因激活、抑癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活、以及多个信号转导通路的功能失调。这些通路包括Wnt /β- catenin，p53，pRb，Ras，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），JAK/STAT，PI3K/ Akt，Hedgehog（Hh）基因和生长因子（如：表皮生长因子（EGF）与转化生长因子-β（TGF-β））^10-12。此外，一些生长因子（如：肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGFs）和Amphyregulin）与血管生成基因一样，其异常表达均可能参与肝癌的发生和发展¹³。最近鉴定出的有助于肝癌细胞转化、增殖、抗凋亡和侵袭的调控通路包括：TGF-β/TBR, IGF/IGF-1R, HGF/MET, Wnt/β-catenin/FZD, 和 TGF-α/EG¹⁴。

肝癌发生时患者TGF-β持续上调，近年来研究发现，TGF-β具有双重作用，在肝损伤早期阶段具有肿瘤抑制功能；在肿瘤形成阶段的其作用从肿瘤抑制转换到促进肿瘤形成，并诱导侵袭和转移。因此，使用TGF –β受体I激酶抑制剂通过调节肿瘤血管形成来发挥抗肿瘤作用¹⁵。HCC起始和进展过程中涉及蛋白激酶异常活化，这些激酶包括PI3K – AKT、Aurora激酶、酪氨酸激酶（VEGF、EGF、PDGF、Heregulin和 IGF-I）受体¹⁶ 。最近的研究表明丝裂原活化蛋白激酶（如：p38和JNK）在推进肝细胞增殖失控和侵袭时起主要作用^17-18。最近发现：可以同时作用于VEGF受体、PDGF受体和Raf的多激酶抑制剂-索拉非尼可以提高晚期肝癌患者生存受益¹⁹。

2.HCC与HBV感染相关的流行病学证据

流行病学调查显示HBV感染是HCC发病的主要原因，HCC发病率的地理分布与HBV感染流行区域分布大致相同，在HBV流行地区HCC也比其它类型癌症更常见²⁰，此外，HBV感染持续时间、慢性肝炎时肝损伤程度也都与HCC发病风险密切相关。据报道，非活动性HBV携带者、HBV慢性感染患者和肝硬化代偿期病人HCC每年发病率分别为0%、0.3%和1.5-6.6%^20-21，此外，HCC也可以发生在HBV恢复期的病人。台湾一项研究证实：在儿童时期普遍接种乙肝疫苗可以降低HCC发病风险。韩国一项研究则显示即使在成年后接种乙肝疫苗仍然可以降低HCC发病风险。乙肝病毒复制增加HCC发病风险，认为HBV DNA是预测HBsAg阳性患者HCC发病的主要因素，HBeAg阳性患者HCC相对危险度高于静息期HBsAg携带者²²。总之,血清及早出现HBeAg抗体以及抑制病毒载量均可以降低HCC发病风险。

3.HBV,肝硬化与肝癌

肝炎病毒慢性感染20-30年后，约20-30％的患者发生肝硬化，HBV感染伴肝硬化患者发展为肝癌的风险率年增长3-8％²³。在肝连续损伤过程中，肝星状细胞（HSCs）被激活，丢失富含类维生素A的脂滴并转化为成肌纤维细胞样细胞（MFC），并由此产生细胞外基质，最终发展为不可逆转的肝硬化。激活的肝星状细胞易与血小板衍生生长因子（PDGF）及纤维发生细胞因子（TGF-β）²⁴反应,这些细胞因子在纤维化过程中可被上调并调节免疫细胞浸润的炎症信号。PDGF可激活MAPK及PI3K / Akt信号级联。Campbell JS等²⁵发现在PDGF- C转基因小鼠，肝星状细胞的活化与增殖先于肝纤维化，肝纤维化后又有肝癌的发生，这一过程和观察到的人类肝癌进程相似。肝硬化也与端粒缩短相关，端粒缩短后可导致染色体不稳定和染色体检查位点的删除²⁶。此外，乙肝病毒载量与肝硬化的发展密切相关²²。

80-90％的肝癌在肝硬化肝基础上发展而来²⁷。肝硬化后由于肝脏储备能力下降使得有毒代谢产物积累增加、增加的存活因子可以防止DNA损伤肝细胞的凋亡、活化的星状细胞（如：Gas6 ²¹⁵)、NK细胞功能降低后肿瘤监视功能的下降，这些都是肝硬化发展为肝癌的可能因素²⁸。最近的研究发现，星状细胞表达干细胞的标志物（如：CD133²⁹，nestin，c - kit和p75神经营养因子受体）。Yang, L等³⁰实验发现Hedgehog（Hh）信号通路参与肝硬化发病过程，Myung, S. J等³¹发现Wnt信号通路通过调控肝星形细胞参与肝纤维化形成，这二个信号通路均与干细胞分化和癌症形成有关。这一系列的证据表明，星状细胞可能隐藏了转分化为祖细胞的潜力，并可能与肝癌发展有关²⁸。

4.HBV基因组

4.1基因结构、基因型和突变体

乙肝病毒属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，直径为42nm，外膜由HBsAg及少量前S抗原镶嵌在脂质层组成。这个包膜围绕一个内在的核衣壳—包裹病毒DNA和聚合酶的HBV核心抗原（HBcAg）组成的二十面体，其内部含有HBV DNA和聚合酶。 HBV基因组是一个环状部分双链DNA分子，长度大约为3.2kb，其负链至少包含四个部分重叠的开放读码框架（ORF），分别称为 S、C、P和X；前S / S编码三种包膜蛋白、前C / C编码e抗原（HBeAg）和核心抗原（HBcAg）、P和X分别编码聚合酶和X蛋白。在粘附到肝细胞后，乙肝病毒基因组移动到细胞核，在DNA多聚酶作用下组装成共价闭合环状DNA（cccDNA）—具有高度稳定构象。cccDNA可以作为病毒RNA转录模板，并翻译成病毒蛋白。HBV聚合酶可以反转录和复制HBV DNA，由于其缺乏校对能力而容易产生突变，常见基因突变为编码HBeAg的前C区（G1896A）突变，近年来研究发现基本核心启动子（A1762T / G1764A） 和前S /S基因也是常见突变位点³²。

依据基因组序列差异将乙肝病毒分为A至H 8个基因型³³，乙肝病毒基因型分布具有明显的地域和民族差异³⁴。基因型C和高病毒载量已被证明是肝癌发展的独立危险因素³⁵。最近，认为HBV基因型和突变体可能藏匿了不同致癌潜力的想法被进一步证实，在一项大规模的研究中，通过对收集的资料进行后设分析，发现某些区域（如：HBV C基因型preS区、增强子IIC1653T区域、HBV C基因型核心启动子A1762T/G1764A以及T1753V）的突变与HCC发生具有统计学意义，这些突变或单独或组合在一起可以预测80％病例肝癌的发生³⁶。此外，在诊断为HCC八年前就可以在血浆中检测到T1762/A1764突变，这种突变因此可作为是一种有效的生物标志物³⁷。

4.2病毒载量

大规模队列研究表明，乙肝病毒载量与肝癌有关，HBV DNA水平越高肝癌发病风险也随之增加³⁵。当血清HBV DNA水平> 2000 IU/ML强力预示肝癌的发生，但是即使HBV DNA水平很低仍然表示有肝癌发病可能^{35, 38}。鉴于HBV很可能具有致癌特性，HBV DNA（表明高病毒复制）越高、肝癌的风险越大就显得不足为奇了。既往认为HBeAg阳性是一个危险因素，但是进一步研究并没有证明HBeAg可以作为独立因素预测HCC，其作用可能还是主要依靠HBV DNA水平和HBV基因型 ^{35, 39}。

4.3HBV DNA整合

85-90％以上的HBV相关肝癌存在HBV基因组整合并常先于肝癌的发生。HBV DNA整合不仅见于肝癌患者，也见于慢性乙肝患者的非肿瘤组织。HBV DNA整合频率在一些情况下可以增加，如：暴露于氧化应急或氧化制剂导致DNA损伤、慢性炎症DNA复制增强和DNA损伤⁴⁰。最初，人们认为HCC患者HBV DNA整合位点在整个基因组随机分布。近年来有学者认为存在一些易于整合的位点，Feitelson等⁴¹发现许多整合事件发生在人类基因组不稳定的位点或其周围，也可发生在其他癌症相关的区域，而这些区域在肿瘤的发展过程中容易不稳定，与整合相关的遗传不稳定性可能改变癌基因及肿瘤抑制基因和微RNA的表达。HBV DNA整合可诱导宿主基因组产生大范围的遗传学改变，包括染色体缺失、易位、融合转录基因、细胞基因组DNA扩增和基因组整体不稳定⁴²。

最近一项大规模的关于细胞DNA乙型肝炎病毒DNA整合位点的研究发现其整合喜好发生在调节细胞信号、增殖和活力的位点⁴³。整合常见基因靶标包括：人类细胞周期蛋白A2基因、维甲酸受体β基因、人端粒酶逆转录酶、 PDGF受体、钙信号相关基因、混合性白血病和60s核糖体蛋白基因⁴³。大部分的肝癌已经结合了编码HBV X蛋白和/或去除pre-S2 / S包膜蛋白的乙肝病毒序列，这些都有助于肝癌的形成。尽管已经证明在病毒整合点附近的细胞靶基因表达增强，但是这些基因在肿瘤形成过程中扮演的角色是操控者还是旁观者这样的问题几乎没有得到解决。最后，几乎所有的HBV嵌入物缺乏完整基因组，这些序列存在复制缺陷，但是他们可能通过生产截短型和突变型HBx或前S2 / S蛋白利于肿瘤形成。截短型或缺失突变型HBx丢失癌基因诱导的凋亡和细胞循环阻遏能力，增强蛋白转化能力⁴⁴；据报道：截短型pre-S2 / S具有反式激活性质，在HBV DNA整合位点不断发现截短型pre-S2 / S序列⁴⁵。

5.HBV蛋白

5.1HBx蛋白

过去10多年的研究结果显示，在HBV相关HCC的发病中HBx基因具有非常重要的作用，因为它是最为常见的病毒整合基因⁴⁶。HBV X基因通过编码HBx蛋白来发挥广泛的生物活性作用。HBx蛋白是一种由154个氨基酸组成的蛋白质，可通过反式激活细胞启动子和增强子来增加病毒基因的表达和复制，这对于病毒持续性感染是很重要的^47-48。

细胞内定位研究显示HBx主要分布在细胞质，较少分布于细胞核内。定位在不同位置的HBx功能不同，细胞质中HBx调节胞内信号转导级联⁴⁹，位于核内的HBx可以直接干扰转录因子或发挥转录因子样功能。因此，在细胞质中HBX可以激活信号通路（如：PKC， JAK / STAT，PI3K， SAPK/JNK，ras-raf-MAPK， SMAD和Wnt），在细胞核中可以表现为转录反式作用子上调：癌基因（c-Myc、c-Jun）、转录因子NF-kappaB、活化剂蛋白-1（AP - 1）、AP-2、RNA聚合酶II亚基RPB5、TATA结合蛋白、ATF/CREB，以及病毒癌基因（如：HBV增强子）^{42, 50-52}。

HBx蛋白可以与p53直接作用，引起p53基因转录抑制和抑制许多p53依赖功能：在体外p53序列特异性的DNA结合活性、在体内p53介导的转录活化，进而抑制p53依赖的凋亡、细胞周期调控、DNA修复和肿瘤抑制⁴²。另外，HBx通过减少p53与XBP的结合间接减少核苷酸的切除修复、降低XBP作为转录因子的功能²¹。

HBx蛋白可以增加细胞质内钙离子水平，进而激活钙离子依赖性富有脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）⁵³,继而激活Src激酶，Src增加Shc-Grb2-Sos的集合，然后激活Ras、Ras - Raf- ERK和Ras - MEKK – JNK级联并诱导AP - 1家族成员（如：c - fos和c-jun）基因转录⁵³。HBx蛋白也以RAS依赖方式激活NF-κB。

HBx蛋白也减少了β- catenin蛋白酶体降解，在肝癌组织中HBx蛋白表达和β- catenin积聚有着显着的相关性⁵⁴。HBx蛋白也增加了β- catenin下游靶点c - myc和cyclin D-1。 HBx蛋白丝氨酸-脯氨酸可以与作为Wnt信号通路调节器的Pin1特异结合，Pin1的过量表达增加了HBx蛋白的稳定性。伴随着Pin1的表达HBx蛋白介导的反式激活活性也逐渐提高，Pin1和HBx的结合增加了HBV感染肝细胞的恶性转化⁵⁵。

TGF-β是纤维化及凋亡的重要介质，在肝炎时被持续诱导并通过加速细胞外基质的沉积促使肝硬化发展，在肝癌组织中HBx上调TGF-β的表达。TGF-β通过磷酸化Smad3中间连接器和/或C -末端区域传递信号，Smad3依赖信号可以在肿瘤抑制和肿瘤形成间进行可逆性转变，这提示Smad3的C -端区域（pSmad3C）磷酸化传输一种肿瘤抑制TGF -β信号，而Smad3链接器区域（pSmad3L）磷酸化促进了诸如：细胞增殖和侵袭的致癌活动。在早期致癌过程，HBx蛋白转变肝细胞TGF-β信号从抑制肿瘤的pSmad3C通路到致癌的pSmad3L通路²⁴。最近有报道：使用TGF –β受体I激酶抑制剂通过调节肿瘤血管形成来发挥抗肿瘤作用¹⁵。

最近的一项研究发现HBx蛋白诱导肝星形细胞的旁分泌活化，而抗TGF –β（anti-TGF-β）阻止这些旁分泌作用⁵⁶。脂肪变性也是慢性肝病和肝癌的重要辅助因子。Kim, KH等⁵⁷在一项研究发现，HBx表达的增加引起肝细胞脂质聚集导致脂肪肝，这一过程是通过固醇调节元件结合蛋白1— SREBP1（sterol regulatory element binding protein 1）和PPAR -γ的转录活化实现的。另有报道肝癌时发现肝X受体可以调节HBx蛋白诱导的脂肪生成⁵⁸。HBx诱导肝癌发生可能还有其它一些机制，如：过度表达胰岛素受体底物-1⁵⁹、上调beclin 1并相应增加了“饥饿”诱导的细胞自噬（Autophagy）⁶⁰、 通过结合受损的DNA结合蛋白-1使得基因组不稳定、与DNA甲基转移酶（DNMT）相互作用引起表观遗传学改变^{59, 61}。

此外，一些动物实验也提供了相关证据，土拨鼠肝炎病毒的结构和生命周期方面都与HBV相似，它可以土拨鼠感染肝脏，并在造成急性或慢性肝炎2-4年后形成肝癌⁶²，然而，当鸭子感染鸭乙型肝炎病毒，肝癌发展的风险却很低。这可能是因为鸭乙肝病毒不含有HBx基因，而这个基因在肝癌的形成过程中表达HBx蛋白。

5.2包膜蛋白

截短型pre-S2 / S 基因是常见被删除的整合的病毒基因组。HCC患者HBV DNA整合位点经常发现截短型pre-S2 / S序列，截短型pre-S2 / S蛋白特异活化MAPK信号途径，导致转录因子（如：AP-1和NF-kappaB）活化，通过活化这个信号级联引起肝细胞增殖率增加。pre-S2 / S蛋白具有反式激活能力，可以反式激活一些细胞基因，如：c-myc、c-fos、c-Haras。过度产生的HBV表面蛋白（pre-S2 / S）尤其是L也可能是M，在细胞内过度聚集，可能使得细胞易受伤害，并可能进一步损害导致癌变⁶³。细胞内过度积累的多肽类HBV表面蛋白（pre-S2 / S）突变体与肝细胞的严重损害相关，也可能导致肝细胞毛玻璃样变性甚至癌变。最近的一项研究发现，pre-S2通过上调人类端粒酶逆转录酶和诱导端粒酶活化来增强人肝癌细胞株恶性转化⁶⁴。pre-S2激活PKC并引起pre-S区域磷酸化，然后激活c - Raf - 1/MEK/ ERK信号转导级联。

HBV表面蛋白隐藏了致癌作用，这个作用主要是通过诱导ER应急和作为其后果的细胞内ROS水平介导⁶⁵。pre-S基因突变产生的大表面抗原可以激活内质网（endoplasmic reticulum,ER）应急,从而诱导DNA氧化损伤和基因组不稳定, pre-S突变体还可以上调COX-2和cyclin A诱导肝细胞细胞周期和增殖⁶⁶。最近一项研究发现，pre - S突变体可以上调VEGF- A，这个过程可以被ER应急抑制剂所抑制，表达pre -S突变体的细胞系Huh-7呈现Akt / mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶）信号通路激活和生长加速，这也可以被VEGF-A中和抑制⁶⁷。

HBV致癌其它相关因素

HBV感染患者合并HCV感染或者黄曲霉毒素B1同步接触时其HCC发病率大为提高，促肾上腺皮质激素释放激素受体-2基因内含子的多态性增加HBV相关肝癌易感性⁶⁸。包含雄激素信号的信号通路可能影响男性的HBV相关肝癌患病风险⁶⁹。血清有较高的维生素A水平可能降低乙肝病毒携带者肝癌发病风险⁷⁰。

Conclusions

肝癌是一种高度复杂和异质性肿瘤，其发生是一个多步骤的过程，涉及癌基因、抑癌基因以及多个细胞信号通路。病毒感染是HCC发生的主要危险因素，但是病毒感染导致肝癌发生明确的发病机制仍然不清楚。HBV病毒蛋白可以影响抑癌基因和癌基因的表达，也可以干扰多种细胞信号转导通路，影响细胞的存活，增殖，转移。另外，各种病毒间也可以联合作用导致癌变。当前，高通量技术和选择性信使RNA分析等理解基因表达谱方法的进步，已经改革了我们肝癌发病机制的研究方法。到目前为止，研究对象主要集中于肿瘤；因此，采集大量不同阶段的慢性HBV感染样本分析其基因表达和蛋白组学改变是非常重要的，有助于鉴定出早期诊断标志物和新颖的治疗靶点，利于解决当前HCC早期诊断困难和缺乏有效治疗手段的难题。最近，证实使用多激酶抑制剂-索拉非尼有利于提高晚期肝癌患者生存受益，这表示对肝癌发病机制及治疗认识方面的突破，并证明肝癌患者使用分子治疗有效^{19, 71}。因此，有必要充分理解病毒肝癌发病的分子机制，这有利于我们选择更为有效的干扰途径、针对复杂发病机制探索有效的多靶点联合治疗。

后记：这是一篇初稿的文章，题目写的大，写的可能浅，很难讲述的好。初稿后就没再修改过（语句有误或者别字）。但是，这是我第一篇综述，写作期间参考了不少高影响因子上面近期的文章，自己觉得有些信息还是有点价值的，作为原创，乐意与大家交流！

 

转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自姚宁华科学网博客。
链接地址：https://wap.sciencenet.cn/blog-362590-363758.html

上一篇：自然辩证法课后作业